experimentele
etikettering van RuBisCo:
Aedans(454): donor F(58): acceptor
Bindingsstudies:
termen:
ADP bullet: groel complex bound to GroES and ADP
ApoGroEL: Just GroEL comlex (gebruikt in eerdere bindingsstudies van Rubisco-substraat)
Lin et al. vastgesteld dat:
1. Er was een verschil in FRET op substraat binden aan de trans ring van ADP bullet vs.apoGroEL ring.
– Dit werd duidelijk door het doven van donorfluorescentie (B.)
– dit wees op een verschil in bouw van het eiwitsubstraat.
 |
 |
2. Vond een “passieve” ontvouwing van substraatproteã nen gebonden aan apoGroEL ring.
– Deze ontvouwing vond echter veel langzamer plaats dan Groels functionele reactiecyclus.
3. Er is minder “passieve” ontvouwing van het substraat gebonden aan ADP bullet trans-ring.
– bevestigde dit met studies naar de protease-spijsvertering.
– Dit is echter het meer fysiologisch relevante complex.
– dus is dit een maximaal effectief niveau, of alleen de eerste stap in de reactiecyclus?
om de fysiologische relevantie te testen, voegden ze ATP toe aan de ADP Bullet Reaction, en gemonitord FRET
 |
na toevoeging van ATP vonden ze: – Een eerste snelle, gedwongen conformatie uitbreiding van de ondergrond – en dan een lagere compressie fase – Duidelijk in Figuur b |
 |
 |
-Figuur c geeft aan dat de kinetiek van de compressie fase isdependent op GroES concentratie, wat betekent dat het afhankelijk is van
thesequestration mechanisme van het complex.
– terwijl de expansiefase onafhankelijk is van Groesconcentratie.
concludeerde dat er twee fasen van ontvouwen zijn:
– langzaam passief ontvouwen door substraatbinding aan transring van Groefkamer (vanaf het eerste bindingsexperiment)
– Snel, ATP-gedreven ontvouwen door de conformatie van de Groefkamer.
Snelle ontvouwing is niet afhankelijk van Groezen:
– een overmaat van een enkele geringde GroEL variant, SR1 werd gebruikt als Groesval.
– SR1 is niet in staat om substraat te binden en een zich ontvouwende reactie te katalyseren,maar is wel in staat GroES te binden en op te nemen om de afhankelijkheid van de reactie op de opsluiting van het substraat te bepalen.zij stelden vast dat de snelle ontvouwing, die door FRET wordt gevolgd, zich zonder de aanwezige Groefkap voordoet, en de daaropvolgende verdichtingsfase niet.
– Dit geeft aan dat de snelle expansiefase afhankelijk is van conformatie verandering van GroEL veroorzaakt door ATP binding.
So .. is het ontvouwen van het substraat noodzakelijk voor productief vouwen?
– Is dit een essentiële stap, en belangrijk voor GroEL / GroES vouwmechanisme?
– zij vonden dat de fractie van niet-inheemse RuBisCo die in de inheemse staat opduikt evenredig is met de mate van ontvouwing.
– om dit te onderzoeken, wilden ze de langzame, passieve ontvouwing van het substraat meten als gevolg van Groefbinding alleen(niet ATP
afhankelijk)
– ze gebruikten opnieuw SR1-binding aan het substraat, dit keer niet als atrap, maar als een passief-ontvouwende bindingsplaats voor het substraat.
– incubatietijd met SR1 is gecorreleerd aan de hoeveelheid ontvouwing, aangezien de ontvouwing alleen te wijten is aan de binding van het substraat.
– zij bepaalden dat er een correlatie is tussen de hoeveelheid zich ontvouwend eiwit en het inheemse eiwit.
– dus het geforceerde ontvouwen van GroEL / GroES is een efficiënte manier om het ontvouwingsmechanisme te bevorderen dat nodig is voor een goede eiwitvouwing.
 |
 |
 |
 |