het resistentiemechanisme van Escherichia coli geïnduceerd door ampicilline in laboratorium

introductie

pathogene Escherichia coli veroorzaakt vaak diarree, sepsis en andere klinische symptomen en is nog steeds een van de belangrijkste intestinale pathogenen die van invloed zijn op de gezondheid van mens en dier. Ampicilline (AMP), een semi-synthetische β-lactam antibiotica, wordt veel gebruikt voor de behandeling van mens en vee E. coli infectie, maar onlangs is zijn weerstandspercentage toegenomen.1-3 AMP werkt op het actieve replicerende stadium van bacteriën, die de synthese van bacteriële celwand remmen. De bacteriën verzetten zich vaak tegen dergelijke antibiotica op de volgende manieren: codeert β-lactamase, verandert het doelproteã ne in celwand, vermindert de permeabiliteit van buitenmembraan, en verhoogt de uitdrukking van drugeffluxpomp. Antibacteriële geneesmiddelen worden door dieren gebruikt en vervolgens via uitwerpselen in het milieu verspreid, wat niet alleen het milieu vervuild maakt, maar ook grote schade toebrengt aan de menselijke gezondheid en de duurzame ontwikkeling van de fokkerij.4,5

Whole-genome sequencing (WGS) is aangetoond als leidraad voor de preventie en controle van bacteriële resistentie.6 Het enige nucleotidepolymorfisme (SNP) verwijst hoofdzakelijk naar het polymorfisme van de opeenvolging van DNA dat door de variatie van één enkel nucleotide op het genomic niveau wordt veroorzaakt, en de herschikkingsanalyse om de verschillende SNPs te screenen kan drugresistentie directer bestuderen. We simuleerden het proces van klinische antibiotica in organismen met behulp van de methode van AMP laboratorium inductie, en onderzocht de relatie tussen de mate van resistentie tegen geneesmiddelen en de mutatieplaats. Screening op niet-synoniem single nucleotide polymorfisme (non-SNP) tussen resistente en gevoelige stammen om de rol van niet-SNP in resistente stammen te begrijpen. Het doel van deze studie is om de wet en het mechanisme van resistentie van E. coli te begrijpen, nieuwe doelen te bieden voor de ontwikkeling van nieuwe antibiotica, rationeel gebruik van antibiotica te maken en het meervoudige voorkomen en de behandeling van resistentie van E. coli tegen meerdere geneesmiddelen in de klinische praktijk op te lossen.

materialen en methoden

bacteriële isolaten en reagens

De E. coli-stam die in dit onderzoek is gebruikt (E. coli 15743) werd geïsoleerd uit een ontlastingsmonster van een patiënt in een ziekenhuis in Suixian, Provincie Henan, China, in 2015. Karakterisering van deze stam door Kirby Bauer (k-B) paper diffusion method toonde aan dat de stam gevoelig was voor acht klassen van 20 antibiotica. E. coli ATCC 25922 werd gebruikt als controle voor onze studie.

m-h bouillon medium en M-H solid medium (Oxoid company, UK), farmaceutisch gevoelig papier (Hangzhou Binhe microbial company, Hangzhou, China), AMP standard products (Chinese drug identification Institute, Beijing, China), DNA extraction kit (Shanghai Laifeng Biotech company, Shanghai, China). Illumina Hiseq werd gedaan bij Shanghai Lingen Biotechnology Co., Ltd.

De in het experiment gebruikte E. coli werd specifiek geïsoleerd voor dit onderzoek. De studie werd goedgekeurd door de Life Science Ethics Committee van Zhengzhou University, en de patiënt ondertekende ook schriftelijke geà nformeerde toestemming.

inductieproces

Minimum inhibitory concentration (MIC) werd bepaald met behulp van de microbroth verdunningsmethode.7-9 de stam van E. coli (geïsoleerd uit klinische en hebben MIC waarde) die gevoelig is voor AMP werd gekweekt in MH vast medium, 37°C cultuur na 18-24 uur, kies een enkele kolonie in 8 mL M-H vloeibaar medium voor versterking van bacteriën. De bovenstaande bacterieoplossing werd gekweekt in M-H vloeibaar medium met 1/2MIC AMP, respectievelijk, en de concentratie van AMP werd continu verhoogd tijdens het subcultuurproces. Wanneer de concentratie van antibiotica 16 µg/mL bereikte, werd 8 µg/mL elke keer verhoogd, en elke concentratie werd tweemaal gesubcultureerd. Wanneer de waarde van de MIC verandering van een geneesmiddel groter was dan of gelijk aan vier keer MIC voor en na inductie, werd aangenomen dat de MIC verandering na inductie significant significant was.10 het kweekmedium van M-H bouillon zonder antibiotica werd gebruikt als controle gedurende het hele proces.

Multilocus sequence typing (MLST) van E. coli stammen werden geclassificeerd door zeven paren van huishoud genen die adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA en recA bevatten.

gevoeligheidstesten

Kirby Bauer paper diffusion methode werd gebruikt om de E. coli te screenen die gevoelig was voor acht soorten antibiotica, waaronder aminoglycosiden, penicillines, cefalosporines, tetracycline, β-lactamaseremmers, carbamaten, sulfonamiden en chinolonen. De geïnduceerde stammen werden herhaald met behulp van drug sensitivity test. De gegevensinterpretatie werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Clinical and Laboratory Standards Institute 2016.11

eerst induceerden we E. coli resistentie tegen AMP, door E. coli te kweken met een geleidelijke verhoging van de concentratie van AMP (2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, en 256 µg / mL). Nadat we resistentiestam verkregen hadden, vergeleken we het resistentiespectrum van 20 antibiotica tussen de geïnduceerde stam (E. coli 15743-256, geïnduceerd bij 256 µg/mL) en de oorspronkelijke stam (E. coli 15743) door middel van druggevoeligheidstesten. De bacteriële suspensie werd verspreid op een agar plaat, met een kleine ronde stukken papier met verschillende antibiotica, en gekweekt bij 37°C gedurende 16-20 uur. De diameter van de antimicrobiële ring werd gemeten.

WGS en resequencing analyse

de stammen met MIC-waarden van 32 en 256 werden respectievelijk aangeduid als E. coli 15743-32 en E. coli 15743-256. De gehele genoomanalyse werd uitgevoerd op de primaire gevoelige stammen, en het opnieuw rangschikken werd uitgevoerd op veroorzaakte resistente stammen. De resultaten van resequencing werden vergeleken met die van de originele kaart. Screening non-SNPs die de eiwitfunctie kunnen beïnvloeden.

Sequencing werd uitgevoerd door Shanghai ling ‘ en Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, China). Illumina Hiseq gecombineerd met derde generatie sequencing technologie werd gebruikt om genomic sequencing van de stammen in dit project te voltooien.

RT-PCR

verwijder het omgekeerde getranscribeerde DNA uit de 4°C-vriezer en bereid de gewenste concentratie van het reagens volgens de instructies. Zet het ABI Fast7500 instrument aan, stel 95 ° C in voor 30 s, reageer 40 cycli, 95°C voor 3 s, 60°C voor 30 s, en los de curve op voor 95°C voor 15 s, 60 ° C voor 60 s en 95°C voor 15 s. Voeg het monster toe aan de 8-rijige EP-buis, drie duplate wells per monster, en verwijder de bellen door centrifugeren. De gemiddelde CT-waarde van elk monster werd geregistreerd nadat de reactie was voltooid. Het relatieve expressieniveau van het gen van belang werd berekend met behulp van 2−ΔΔCT. (ΔCT = CT-waarde van het doelgen-CT-waarde van het interne referentiegen. ΔΔCT = experimenteel Monster ΔCT – controlegroep ΔCT.)

Bioinformatica analyse

SWISS-MODEL software werd gebruikt om de aminozuursequentie van het eiwit gecodeerd voor en na genmutatie te analyseren en eiwit tertiaire structuur te voorspellen.12,13

statistische analyse

SPSS17. 0 werd gebruikt voor eenvoudige lineaire regressieanalyse en de regressievergelijking werd getest. De grootte van een test was 0,05 (α=0,05).

resultaten

testresultaten

onze gegevens toonden aan dat E. coli 15743 gevoelig was voor 20 verschillende antibiotica. Na inductie, E. coli 15743-256 was resistent tegen AMP, piperacilline, cefuroxim, cefazoline, cefoxitine, AMP/sulbactam, amoxicilline/clavulaanzuur, piperacilline/tazobactam en aztreonam, maar nog steeds gevoelig voor de resterende 11 antibiotica (Tabel 1, merk op dat tussenpersonen ook werden gedefinieerd als geneesmiddelresistentie). Onze resultaten toonden aan dat originele gevoelige E. coli niet alleen resistent was tegen AMP, maar ook resistent tegen een verscheidenheid aan andere antibiotica en multi-drug resistent werd tijdens de inductie.

Tabel 1 Antibacteriële ring met een diameter van Escherichia coli

Het optreden van resistentie (bepaald door MIC-waarde) tijdens de introductie

om Te studeren kinetiek van resistentie, we gekweekte E. coli met toenemende concentratie van de AMP voor verschillende periodes en gemeten MIC op elke concentratie zoals aangegeven in Tabel 2. Regressieanalyse werd uitgevoerd op de MIC-waarde en de inductietijd met SPSS 17.0. De regressievergelijking was y = 1,0435 lnx-0,7316. Het passende effect van de vergelijking werd geëvalueerd, R2=0,9605, P<0,05. De MIC-waarde die 32 µg/mL bereikt is de kritische waarde en de mic-waarde steeg sneller voordat deze 32 µg/mL bereikte dan daarna (Tabel 2).

Tabel 2 de MIC-waarde van E. coli 15743 in de loop van de tijd en geïnduceerde concentratie

ondertussen werd het deel met een MIC-waarde kleiner dan of gelijk aan 32 µg/mL geselecteerd voor regressieanalyse, en de regressievergelijking was y=0,0358 x+1,2812. Het passende effect van de vergelijking werd geëvalueerd, R2=0,991, P<0,05. De MIC-waarde van E. coli 15743 nam toe met de toename van de inductieconcentratie en de inductietijd (figuur 1).

figuur 1 de verandering van MIC-waarde in de tijd.Afkorting: MIC, minimale remmende concentratie.

MLST resultaten

om aan te tonen dat de geïnduceerde stam (E. coli 15743-256) inderdaad afkomstig was van de oorspronkelijke stam (E. coli 15743), voerden we MLST uit van bovenstaande twee stammen. Genomic DNA werd gehaald door bacteriële DNA extractie kit, PCR versterkt, en gerangschikt door sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Blast searching van NCBI database gaf aan dat deze twee stammen identiek zijn, MLST type, adk-13, fumC-363, gyrB-302, icd-97, MDH-17, Pura-94 en recA-93. Onze gegevens geven aan dat het inductieproces niet besmet was, en de resistente stam E. coli 15743-256 werd afgeleid van de gevoelige stam E. coli 15743.

gehele genoomanalyse

E. coli 15743 bevatte 4408 genen, 22 rRNA en 85 tRNA. De gendichtheid was 0,945 kb, de GC-inhoud was 51.7%, het genpercentage was 88,3%, de lengte van het intergenic gebied was 545.151, de inhoud van het intergenic gebied GC was 42,6%, en het intergenic gebied goed voor 11,7% van het genoom. De kenmerken van E. coli 15743 genomen zijn samengevat in Figuur 2. E. coli 15743 bevatte geen plasmiden.

Figuur 2 de genomische kaart van E. coli 15743.Opmerkingen: de buitenste cirkel van de cirkelkaart is het genoom-sized logo, elke schaal is 0,1 Mp. De tweede en derde cirkel zijn CD ’s op de positieve en negatieve ketens, en de verschillende kleuren wijzen op verschillende COG classificaties van de CD’ s. De vierde cirkel is rRNA of tRNA. De vijfde cirkel is de inhoud van GC, en het uiterlijke rode deel wijst erop dat de inhoud van GC in het gebied hoger is dan de gehele-genoom gemiddelde inhoud van GC. Hoe hoger de piekwaarde aangeeft hoe groter het verschil met het gemiddelde GC-gehalte, en het naar binnen gerichte blauwe gedeelte geeft aan dat het GC-gehalte in het gebied laag is. Voor het geheel-genoom gemiddelde GC inhoud, wijst een hogere piek op een groter verschil van de gemiddelde GC inhoud. De binnenste cirkel is de GC schuine waarde. Het specifieke algoritme is G−C of G+C. Wanneer de waarde positief is in de biologische zin, heeft de positieve keten de neiging om CDS te transcriberen. Als het negatief is, heeft de negatieve keten de neiging om CD ‘ s te transcriberen.Afkorting: COG, Clusters van Orthologe groepen van eiwitten.

De genoomkaart van de stam omvat de distributie van genen op de ketens van rechtvaardigheid en antisense, functionele classificatie van Clusters van Orthologe groepen van eiwitten (COG), GC-gehalte, genoomeiland en homologe genen, die de kenmerken van het genoom volledig kunnen weergeven.

COG

de functionele classificatie van COG van E. coli 15743 toonde aan dat de meeste genen gerelateerd waren aan aminozuurtransport en-metabolisme, koolhydraattransport en-metabolisme, energieproductie en-omzetting, alleen algemene functievoorspelling, anorganisch iontransport en-metabolisme en biogenese van de celenvelop (Figuur 3).

Figuur 3 de functionele classificatie van COG van E. coli 15743.Afkorting: COG, Clusters van Orthologe groepen van eiwitten.

Non-SNPs

om te bepalen of er een verandering was in het E. coli-genoom na inductie van de oorspronkelijke stam, hebben we een genoombrede sequentiebepaling uitgevoerd van de geïnduceerde resistente stammen (E. coli 15743-32 en E. coli 15743-256) en het aantal mutaties en de plaats van de mutatie.

vergeleken met de oorspronkelijke E. coli stam (E. coli 15743) waren er negen niet-SNPs in twee geïnduceerde geneesmiddelresistente stammen, waaronder drie gedeelde niet-SNPs, die aanwezig waren in de genen orf00819, orf01200 en orf02235. Andere niet-SNPs waren aanwezig in de genen orf01916, orf00490, orf03479, orf04094. Drie niet-SNPs-mutaties kwamen voor in het orf03479-gen, en slechts één SNP-mutatie kwam voor in elk van de resterende genen. Drie niet-SNPs zaten in genen die celmembraan eiwitten coderen. Drie zaten in genen met onbekende functies. Eén ervan hield verband met het transport en metabolisme van anorganisch ion, één met transcriptie en één met signaaltransductiemechanismen (Tabel 3).

Tabel 3 De niet-SNPs resultaten van de analyse van E. coli 15743-32 en E. coli 15743-256

Onze gegevens bleek dat er vier niet-SNPs in E. coli 15743-32, die op vier genen. Er waren acht non-SNPs in E. coli 15743-256, verspreid over zes genen. De functionele classificatie van COG toonde aan dat de meeste genen gerelateerd waren aan aminozuurtransport en metabolisme, koolhydraattransport en metabolisme, energieproductie en omzetting, alleen algemene functievoorspelling, anorganisch ionentransport en metabolisme en biogenese van de celenvelop.

RT-PCR

Whole-genome re-sequencing E. coli 15743-32 and E. coli 15743-256, fluorescente real-time kwantitatieve PCR detectie van consensusgenen. De genen waarin niet-SNPs voorkomen werden gescreend, en E. coli 15743-32 en E. coli 15743-256 had drie identieke genen (orf00819, orf01200, orf02235), en de expressieniveaus van deze genen in elke generatie stam zijn weergegeven in Figuur 4A–C, respectievelijk.

Figuur 4 resultaten van mRNA-expressie in verschillende generaties van stammen.

RT – PCR toonde aan dat de genen orf01200, orf00819, orf02235 een hoge expressie vertoonden in resistente stammen (E. coli 15743-32, E. coli 15743-64, E. coli 15743-128, E. coli 15743-256).

voorspelling van de eiwitstructuur

de tertiaire structuur verandert alleen in door de genen orf01200 en orf04094 gecodeerde eiwitten, en de voorspelde resultaten zijn weergegeven in de figuren 5 en 6.

Figuur 5 de tertiaire structuur van het door orf01200 gen gecodeerde eiwit.Opmerkingen: a) vóór de mutatie; B) na de mutatie.

Figuur 6 De tertiaire structuur van het eiwit dat gecodeerd wordt door orf04094 gen.Opmerkingen: a) vóór de mutatie; B) na de mutatie.

vóór de mutatie van orf01200, 2hrt.1.A werd geselecteerd als referentiesjablooneiwit (figuur 5A). Het modelbereik van de restinfrastructuur was 2-1033, de sequentie gelijkenis was 0.59, en de template dekking was 1,00. Na de mutatie van orf01200, 1iwg.1.A werd geselecteerd als referentiesjablooneiwit (figuur 5B). Het modelbereik van de restinfrastructuur was 7-1036, de sequentievergelijkbaarheid was 0,59 en de template dekking was 1,00.

vóór de mutatie van orf04094, 4cti.1.B werd geselecteerd als referentiesjablooneiwit (figuur 6A). Het modelbereik van de resterende infrastructuur was 184-436, de sequentievergelijkbaarheid was 0,56 en de template dekking was 0,59. Na de mutatie van orf04094, 3ib7.1.A werd geselecteerd als referentiesjablooneiwit (figuur 6B). Het modelbereik van de restinfrastructuur was 10-262, de sequentievergelijkbaarheid was 0,33 en de template dekking was 0,91.

discussie

regressieanalyse van MIC en inductietijd toonde aan dat de MIC-waarde van de stam toenam met de toename van de exogene antibiotische druk en de inductietijd. Liu et al, toonden aan dat tijdens de inductie van E. coli resistentie door imipenem, de MIC waarde steeg met de tijd.Zelfs wanneer de geïnduceerde concentratie 128 maal de MIC-waarde van de primaire stam bereikte, werd de inductie voortgezet en bleef de MIC-waarde stijgen met de inductie. In overeenstemming met de resultaten van deze studie nam de MIC-waarde van E. coli toe met de tijd en geïnduceerde concentratie. Het toont aan dat als de dosis niet beperkt is, de weerstand van de stam steeds ernstiger zal worden.

AMP werd gedurende 63 uur geïnduceerd tot E. coli 15743 (MIC bereikte 32 µg / mL), en de mic waarde was acht keer die van de gevoelige stam. Voorafgaand hieraan nam de MIC-waarde snel toe, terwijl wanneer deze werd geïnduceerd tot een MIC-waarde van 32 µg/mL, de inductie werd voortgezet en de groeisnelheid van de MIC-waarde daalde. Aangezien bacteriële resistentie kan optreden kort voor het bereiken van de geneesmiddelresistentiedrempel (MIC-waarde van 32 µg/mL). Na het bereiken van de kritische waarde, kunnen de bacteriën lui zijn en langzaam groeien, maar de MIC waarde blijft stijgen. Er wordt ook aangenomen dat deze stam bepaalde resistentiemechanismen activeert en de resistentiestatus van de bacteriën verandert.

Zhang et al, toonden aan dat chlooramfenicol gevoelige Shigella induceerde voor de geneesmiddelresistente toestand, en het geneesmiddelresistentiespectrum zou veranderen.10 als gevolg hiervan was Shigella niet alleen resistent tegen chlooramfenicol, maar ook resistent tegen andere soorten antibiotica. In overeenstemming met de resultaten van deze studie werd het resistentiespectrum van E. coli na inductie versterkt. Uit de resultaten bleek dat E. coli 15743-256 was niet alleen resistent tegen AMP, maar ook tegen piperacilline, cefuroxim, cefazoline, cefoxitine, AMP/sulbactam, amoxicilline/clavulaanzuur, piperacilline/tazobactam en aztreonam waren ook resistent. Men gaat ervan uit dat tijdens de inductie van E. coli door AMP het expressiesysteem van AcrAB-TolC wordt geactiveerd, of dat meer dan één van de meervoudige effluxpompsystemen wordt geactiveerd, en dat er andere resistentiemechanismen zijn dan het effluxmechanisme.

het moleculaire mechanisme van bacteriële resistentie is nog onduidelijk. Om het specifieke moleculaire mechanisme van E. te onderzoeken. coli resistentie tegen AMP, bacteriële WGS analyse werd uitgevoerd. De sequencing resultaten werden vergeleken met de referentie sequentie, en 20 SNPs werden gescreend van de sequentie van E. coli 15743-32, waarvan 4 niet-synoniem SNPs. Zesentwintig SNP ’s werden gescreend van de E. coli 15743-256 stam, waarvan acht niet-synonieme SNP’ s waren. Xiang et al, toonden aan dat het resistentieniveau van gemuteerde stammen hoger was dan dat van niet-gemuteerde stammen, en er was een kwantitatieve reactie tussen puntmutaties en bacteriële resistentieniveaus, en meerdere genmutaties konden de resistentie van bacteriën tegen antibiotica verhogen.In overeenstemming met de resultaten van deze studie was het aantal mutantengenen in E. coli 15743-32 minder dan E. coli 15743-256, wat erop wijst dat het aantal mutaties gerelateerd kan zijn aan de mate van resistentie tegen het geneesmiddel, en hoe meer mutatieplaatsen, hoe hoger de mate van resistentie tegen het geneesmiddel.

na sequencing werden de niet-SNPs gescreend in dit experiment gedistribueerd in de genen van orf00490, orf00819, orf01916, orf01200, orf02235, orf03479 en orf04094. Onder hen, zijn de genen orf00490, orf00819, en orf01916 betrokken bij de synthese van de celwand. De annotaties in KEGG zijn fumarate reductase subeenheid D (frdD), celdeling eiwit ftsI (penicilline-bindende eiwit 3) en porine buitenmembraan eiwit ompd, respectievelijk. De Studies hebben aangetoond dat het frd gen een FRD enzym codeert om de omzetting tussen fumarate reductase en succinate dehydrogenase te katalyseren.16 men heeft ook gevonden dat de versterking van het frdD gen gebruikend een plasmidevector de opbrengst van barnsteenzuur kan verhogen.17,18 in combinatie met deze studie, wordt aangenomen dat het frdd gen betrokken is bij bepaalde metabolische routes, misschien geassocieerd met AMP resistentie. In E. coli zijn de belangrijkste doelen van β-lactam antibiotica PBP1 (behoud van celmorfologie), PBP2 (behoud van E. coli spanning en staafvorm), en PBP3 (gerelateerd aan bacteriële deling). PBP3 is een kerncomponent van de proteã nen van de celdeling die het cross-linken van peptidoglycanen van de celwand tijdens celdeling katalyseren.19-22 Studies hebben aangetoond dat down-regulatie van ompd eiwit en ompd genexpressie in bacteriële biofilms leidt tot verminderde celmembraan permeabiliteit en verhoogde weerstand tegen antibiotica.In overeenstemming met de resultaten van deze studie, de genmutatie ompd initieert een mechanisme van bacteriële resistentie tegen β-lactam antibiotica, en de afname van E. coli celmembraan permeabiliteit is een van de redenen voor de verhoogde resistentie tegen AMP. Men gaat ervan uit dat deze veranderingen in de functie van proteã nen gecodeerd door genen betrokken bij de synthese van de celwand de weerstand van bacteriën tegen AMP beà nvloeden.

genen orf04094, orf01200, orf02235 worden in KEGG geannoteerd als osmotische druksensor histidine kinase( envZ), multi-drug efflux pomp gen (acrB), en multi-drug resistance protein betrokken bij transcriptional regulation (marR). In de afgelopen jaren is het actieve effluxmechanisme de belangrijkste reden voor de meervoudige resistentie van bacteriën tegen geneesmiddelen.25-27 aangezien het grootste deel van het effluentsysteem substraten op grote schaal vervoert en veel actieve effluentsystemen in dezelfde bacteriën kunnen bestaan, kan dit systeem leiden tot bacteriële resistentie tegen verschillende antibacteriële geneesmiddelen met volledig verschillende structuren, namelijk meervoudige resistentie. In de studie van Marlen Adler verhoogden mutaties in het ftsi-gen alleen niet de antibioticaresistentie, terwijl ftsi-en envz-genmutaties de MIC van antibiotica meerdere malen verhoogden. Cohen et al, toonden aan dat de functie van het remmende eiwit gecodeerd door het gemuteerde MarR gen zou worden verminderd, en het effect van de bacteriën op de meervoudige resistentie van antibiotica was klein toen de Marr mutatie alleen werd ontdekt.28 Merric et al, vonden dat E. coli slechts lage niveaus van multi-drugresistentie toonde toen het MarR-gen werd gemuteerd.De resultaten van deze studie toonden aan dat meerdere genen gelijktijdig werden gemuteerd en de E. coli resistentie tegen AMP toenam.

Gen orf03479 wordt geannoteerd als valine glycine repeat g (VgrG) eiwit in KEGG. Het type VI Secretiesysteem (T6SS) is een phage-gerelateerd systeem dat bestaat in vele bacteriële pathogenen, zoals E. coli, Pseudomonas aeruginosa, en Burkholderia cenocepacia. De effectorfactoren kunnen aan extracellulair van bacteriën worden afgescheiden, en het eiwitafscheidingssysteem is nauw verwant aan virulentie van pathogene bacteriën. Wang Jianfeng et al, toonden aan dat de genmutatie van VgrG de giftigheid en de drugresistentie van bacteriën beïnvloedt, maar de functie van glutamaatvaline herhaalproteã ne is nog onduidelijk.In deze studie wordt geoordeeld dat het vgrg-gen geassocieerd kan zijn met AMP-resistentie en dat het mechanisme ervan verder moet worden onderzocht.

samengevat is de COG-functie van deze mutante genen gerelateerd aan de oorsprong van celmembranen, transport en metabolisme van anorganische ionen, transcriptie-en signaaltransductiemechanismen. Studies hebben aangetoond dat onder antibiotische stress, bacteriën zowel actieve verdediging en passieve verdediging kunnen nemen om hun overleving te verzekeren.31 in passieve verdediging, maken bacteriën zich slapend, verminderen de vitaliteit van het leven en blokkeren de combinatie van antibiotica en doel om het dodende effect van antibiotica te verminderen. In actieve verdediging verhogen ze de activiteit van de effluxpomp om de efflux van antibiotica te verhogen en de accumulatie van antibiotica in bacteriën te verminderen, waardoor het dodende effect van antibiotica op bacteriën wordt verminderd. Deze studie suggereert dat de weerstand van E. coli tegen AMP een combinatie is van actieve afweersystemen en passieve afweersystemen. Geneesmiddelenresistentie kan optreden kort voordat de bacteriële MIC-waarde de drugresistentiedrempel bereikt. De genen frdD, ftsI, acrB, ompd, marR, VgrG, en envZ worden geassocieerd met AMP weerstand. Deze studies zullen bijdragen aan de verbetering van het moleculaire mechanisme van E. coli resistent tegen β-lactam antibiotica, en een onderzoeksbasis bieden voor de preventie en bestrijding van multi-drug-resistente bacteriën en de targets van nieuwe antibiotica.