discussie
De image cytometry methode die in dit werk wordt voorgesteld, toont het vermogen aan om snel en efficiënt autofagie in levende cellen te analyseren voor het screenen van potentiële geneesmiddelen die autofagische activiteiten kunnen induceren of remmen, zoals het bevorderen van de klaring van misfolded proteïnen geassocieerd met neurodegeneratie, of het remmen van geneesmiddelresistentie geassocieerd met kanker. De beperking in de huidige methodes kan door beeld cytometry en unieke reagentia worden overwonnen om een nieuwe methode voor autophagyopsporing te ontwikkelen. De Cellometer visie is eerder gebruikt voor fluorescente cel-gebaseerde assays (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et al., 2011), en de Cyto-ID autophagy kleurstof is getoond om specifiek autophagosomes in levende cellen te bevlekken. In dit werk, wordt de Cyto-ID kleurstof getoond om met RFP-LC3 in uitgehongerde HeLa cellen te colokaliseren, die de specificiteit van de kleurstof verder valideren. De ontwikkelde beeld-gebaseerde autophagy opsporingsmethode wordt gebenchmarked tegen standaardstroom cytometry door de autophagyactiviteitsresultaten in voedsel-uitgehongerde Jurkat cellen te vergelijken. De resultaten toonden een verhoging van fluorescente intensiteit in voedsel-uitgehongerde cellen, en een daling voor teruggewonnen Jurkat cellen. Nochtans, zijn de gemeten AAF waarden van cytometry beeld aanzienlijk hoger dan cytometry stroom, die aan verschillen tussen instrumentatie en methodes toe te schrijven zou kunnen zijn. De cytometer van het de Visiebeeld van de Cellometer gebruikt een last gekoppeld apparaat voor fluorescentiemeting, terwijl de cytometer van FACS Calibur stroom een foto-vermenigvuldigingsbuis (PMT) gebruikt. Bovendien verschilde de methode voor het analyseren van fluorescente intensiteiten ook tussen de twee systemen. De stroomcytometer meet totale fluorescentiesignalen van elke cel, terwijl het beeld-gebaseerd systeem beelden verwerft en fluorescently bevlekte autophagosomes binnen de cellen analyseert, die nauwkeurigere metingen van autophagyactiviteit kunnen verstrekken. De Cellometersoftware kan fluorescentie van cellen analyseren door de totale fluorescente pixels in elke cel op te tellen, of slechts de hoge fluorescente intensiteitspixels van autophagosomes binnen elke cel te meten. Een ander verschil kan worden veroorzaakt door schuifspanning van cytometry stroom die de levensvatbaarheid van de doelcellen beïnvloeden (Robey et al., 2011).
Autofagische flux is ook een belangrijke test voor het ontwikkelen van een nieuwe detectiemethode. CQ wordt aangewend om lysosomal degradatie van autophagosomes te remmen, waar de autophagic activiteit voor voedings-uitgehongerde Jurkatcellen in aanwezigheid van CQ toe te schrijven aan synergistic interactie tussen de behandelingen het hoogst zou zijn. De volgende hoogste zou zijn Jurkat cellen in honger zonder CQ. Slechts een lichte verhoging van autophagic activiteit zou door Jurkat cellen met CQ slechts in vergelijking met de controle worden tentoongesteld toe te schrijven aan de accumulatie van basale autophagolysosomen. De autophagic flux resultaten verkregen van beide instrumenten toonden gelijkaardige tendensen, maar de AAF waarden gemeten in beeld cytometry zijn beduidend hoger. Deze resultaten toonden aan dat de beeldcytometrische detectiemethode gemakkelijk kon worden geïmplementeerd om autofagieactiviteit te onderzoeken, ondanks de potentieel instrumentspecifieke kwantitatieve verschillen in de AAF-waarden.
om aan te tonen dat beeldcytometrie een potentiële screeningstechnologie voor de ontdekking van geneesmiddelen kan zijn, moet worden getest of monsters onder meerdere omstandigheden kunnen worden geanalyseerd. Cytometry van het beeld wordt gebruikt om autophagic activiteit van Jurkat cellen te meten die met rapamycin bij diverse concentraties worden behandeld, om de capaciteit voor cytometry van het beeld aan te tonen om dosis–reactiegevolgen over een tijd-cursus studie te meten. Dientengevolge, kan beeld-gebaseerde cytometry de verschillen in autophagic activiteit over diverse experimentele voorwaarden ontdekken. In Fig. 8.6, de autofagische activiteit (gemeten aan de hand van AAF-waarden)is de hoogste na 18 uur incubatie. Een lichte daling van AAF-waarden wordt getoond tussen 8 en 4 H van incubatie, wat te wijten kan zijn aan het niet toestaan van de cellen om volledig te herstellen na de eerste medicamenteuze behandeling. Bovendien kunnen de adherente cellen zoals de menselijke lijn van de prostate kankercel (PC-3) ook worden gemeten gebruikend de beeldcytometry methode. De weergaveresolutie van Cellometervisie kan fluorescently geëtiketteerde autophagosomes (puncta) analyseren, waargenomen in zowel fluorescente beelden als histogrammen van de fluorescentieintensiteit.
Het is ook belangrijk om het vermogen aan te tonen om verschillende geneesmiddelenverbindingen te karakteriseren door hun autofagisch dosis–respons effect te vergelijken voor drug discovery campagnes. Dosis-respons effecten van tamoxifen en rapamycin worden direct vergeleken met behulp van beeld cytometry. De resultaten bij 18 h incubatie toonden aan dat rapamycine een hoger niveau van autofagie activiteit dan tamoxifen induceerde. Het is belangrijk op te merken dat tamoxifen bij 100 µM hoogst cytotoxisch is, leidend tot Jurkat celdood en desintegratie na 18 h incubatie. De beeldgebaseerde verificatie van het cytotoxiciteitseffect in tamoxifen bij hoge concentratie kan zeer nuttig zijn bij het elimineren van onzekerheden uit alleen scatterplot-en histogramresultaten.
Image cytometrie heeft vergelijkbare resultaten aangetoond met standaard flow cytometrie voor fluorescente cel-gebaseerde analyse (Chan et al., 2011; Robey et al., 2011). Beeld-gebaseerde cytometry methode kan verscheidene voordelen over cytometry stroom aanbieden. Bijvoorbeeld, is het aantal cellen vereist voor elk monster (10-20 µL) beduidend minder dan een conventionele stroomcytometer (300-500 µL). De aanvankelijke opstelling op stroomcytometer vereist sommige steekproeven van de doelcel voor PMT-spanningen en compensatieaanpassing worden gebruikt. Aan de andere kant, pipetteren vele beeldcytometers cellen in een tellende kamer die meerdere keren opnieuw kan worden gescand. Daarom worden de steekproeven van de doelcel niet verspild tijdens de aanvankelijke optimalisatie van de aanpassing van de blootstellingstijd en het concentreren. Belangrijker, staat het voordeel van het vangen van BR en fluorescente beelden onderzoekers toe om verworven fluorescentiegegevens visueel te verifiëren. Dit kan in het identificeren van cytotoxicity als complicerende bijwerking van een analyse van de drugbehandeling helpen die autophagy veroorzaakt.
Autofluorescentie kan optreden met behulp van Cyto-ID groene autofagie kleurstof als gevolg van de plastic telkamer, maar de software kan automatisch het achtergrondsignaal verwijderen om de werkelijke doelfluorescentie te verkrijgen zonder de AAF-berekening te wijzigen. Bovendien, wordt het photobleaching van fluorescente sondes in op cel-gebaseerde analyses geminimaliseerd aangezien de Cellometervisie lagere machtsleds in vergelijking met de hoge machtslasers gebruikt die in andere instrumenten worden gebruikt. De toekomstige verbetering aan de cytometer van het Cellometerbeeld zou zijn om een hoger productie geautomatiseerd systeem te ontwikkelen dat meer cellen voor betere statistische analyse kan analyseren, evenals de capaciteit om veelvoudige steekproeven gelijktijdig te analyseren, die hoger-productie cel-gebaseerd drugonderzoek van inhibitors en activators van autophagy, apoptosis, necrose, en andere fysiologische fenomenen van belang vergemakkelijken.