Menselijke T-cellen express CD25 en Foxp3 op activering en vertonen effector/geheugen fenotypen zonder enige regelgeving/suppressor functie

Activering van T-cellen leidt tot expressie van CD25 en Foxp3 geassocieerd met effector en geheugen fenotype differentiatie

PBMC werden gestimuleerd met bryostatin-1 (5 nM) en ionomycin (1 µM) (B/I) in de aanwezigheid van 80 U/mL IL-2 (Peprotech) voor 16 uur. B / I-activering bootst intracellulaire signalen na die resulteren in t-celactivering door de activiteit van eiwitkinase C en intracellulair calcium respectievelijk te verhogen . De cellen werden driemaal gewassen en gekweekt in 106 cellen/mL in volledig medium met 40 U/mL IL-2 (Peprotech) gedurende 3 dagen en de expressie van Foxp3 werd bepaald met behulp van flow cytometrieanalyse. Expressie van FoxP3 werd ook bepaald op vers geïsoleerde T-cellen op dag 0. Zoals in Fig. 1A (bovenpaneel) gaf de aanwezigheid van IL-2 alleen gedurende 3 dagen geen duidelijke toename van de expressie van Foxp3 of CD25 boven de uitgangswaarden op dag 0 (Fig. 1C). De B / I activering, echter, induceerde Foxp3 en CD25 expressie in CD4 + en CD8+ T cellen (Fig. 1A, middenpaneel). Na B / I-activering werden CD4+CD25+Foxp3+ T-cellen verhoogd van 1% naar 23% (P = 0,016) en CD8+CD25+Foxp3+ T-cellen verhoogd van 0,6% naar 9% (P = 0,013). Uitbreiding van cultuur in aanwezigheid van IL-2 gedurende 6 dagen zonder verdere stimulatie behield CD4 + CD25 + Foxp3 + T-cellen boven de uitgangswaarden in niet-geactiveerde T-cellen (1% Vs.7%; P = 0,031) terwijl CD8+CD25+Foxp3+ T-cellen daalden tot uitgangswaarden (0,6%). Deze resultaten suggereren dat de activering-veroorzaakte uitdrukking van Foxp3 in CD4+CD25+ T cellen stabieler is dan die in CD8+CD25+ T cellen. Het Absolute aantal T-cellen steeg 3 en 6 dagen na de B / I stimulatie en expansie in aanwezigheid van IL-2 (Fig. 1 ter). Activering van T-cellen door middel van anti-CD3/CD28 Abs gedurende 3 dagen leverde vergelijkbare resultaten op als bij B / I-activering door CD4+CD25+FoxP3+ T-cellen te verhogen van 0,4% tot 8,7% (Fig. 1C). Fenotype analyses van T cellen onthulden CD44 + effector en CD44+CD62L+ geheugen fenotypen vóór en 6 dagen na de B / I activering (Fig. 1D, bovenpaneel). Terwijl de effector-CD4+ – en CD8 + T-cellen na activering werden verminderd (respectievelijk 18% tot 9% en 21% tot 13%), werden de geheugen-CD4+ – en CD8+ T-cellen verhoogd (respectievelijk 82% tot 91% en 79% tot 87%). Bij B / I-activering vertoonden CD4+ T-cellen een 6-voudige toename van FoxP3-expressie in CD44+, CD62L+ fenotypen (CD44+: 2,6% tot 15%; CD62L+: 2% tot 12%). Bovendien toonden zowel CD4 + als CD8+ T cellen FoxP3high uitdrukking na activering vergeleken met foxp3low uitdrukking op dag 0 (Fig. 1D, Midden en onder panelen). Alle CD4 + Foxp3 + T cellen uitgedrukt CD44 waaronder 80% ook uitgedrukt CD62L (Fig. 1D, middenpaneel, helemaal rechts). Deze gegevens tonen aan dat 20% van CD4 + Foxp3 + T cellen effector en 80% geheugen fenotypes zijn. Een soortgelijke fenotypische trend werd ontdekt voor CD8 + Foxp3 + T-cellen, die 100% CD44+ vertoonden waarvan 67% CD62L + T-cellen waren (Fig. 1D, Onderpaneel, helemaal rechts). Deze resultaten tonen aan dat 33% van CD8 + Foxp3 + T-cellen effector en 67% geheugenfenotypen zijn. Gegevens in vijgen. 1A-D stelt voor dat de verhoogde uitdrukking van FoxP3high in effector T cellen aan de celdifferentiatie eerder dan celproliferatie toe te schrijven was, omdat het relatieve percentage van CD44+CD62L – effector T cellen na B/I activering verminderde. Het gelijkaardige mechanisme kan in geheugenT cellen wegens de uitdrukking van FoxP3high na activering in vergelijking met FoxP3low op dag 0 bestaan.

Activatie-geïnduceerde FoxP3-expressie op CD4+ T-cellen niet overbrengen regulerende functie in vitro

T-cellen werden gelabeld met CFSE en gestimuleerd met anti-CD3 (1 ug/ml) en anti-CD28 (1 ug/ml) Abs (in de aanwezigheid of afwezigheid van het B/I-geactiveerde CD4+CD25+FoxP3+ T-cellen (2:1 en 20:1 responder:suppressor ratio ‘ s) voor 3 dagen. De cytometrieanalyse van de stroom toonde gelijkaardige tarieven van proliferatie van gated CD8+ T cellen in afwezigheid of aanwezigheid van induceerbare Foxp3+ T cellen (Fig. 2A, 60% vs.61% en 65%). De CD3 / CD28-activering induceerde ook FoxP3-expressie in CD4+ T-cellen van de responder. Gated CD4 + FpxP3 + T cellen toonden ook 70-75% proliferatie bij activering (Fig. 2 bis). Analyse van t-celapoptose toonde vergelijkbare tarieven van apoptose in responder T-cellen in de afwezigheid of aanwezigheid van CD4+FoxP3+ T-cellen (Fig. 2B, 57% vs. 57 en 59%). De meerderheid van de B/I-geactiveerde CD4+FoxP3+ T-cellen (74-76%) bleek apoptotisch te zijn tijdens anti-CD3/CD28-activering in co-culture met responder T-cellen.

allogene activatie van T-cellen tijdens MLR induceert Foxp3-expressie in CD4+CD25+ T-cellen geassocieerd met effector/geheugenfenotype

we voerden een allogene MLR van 8 dagen uit om te bepalen of de inductie van Foxp3-expressie in T-cellen stabiel was tijdens MLR en of een dergelijke geïnduceerde Foxp3+ – expressie t-celproliferatie. Responder-en stimulatorcellen werden verkregen van verschillende gezonde donoren. Stimulatorcellen werden bestraald (5000 rad) en gecultiveerd met respondercellen gedurende 8 dagen in aanwezigheid van 10 µM BrdU (BD Pharmingen). De cellen werden toen bevlekt met relevante Abs en onderworpen aan cytometry stroomanalyse. Zoals in Fig. 3A (bovenpaneel) 86% van CD4+CD25+ T cellen en 93% van CD8+CD25+ T cellen toonden brdu incorporatie als gevolg van celproliferatie. Er werd geen proliferatie gedetecteerd in de responder-of stimulatorcellen alleen (gegevens niet getoond). Dergelijke allogene proliferatie vond plaats in aanwezigheid van een activering-geïnduceerde Foxp3 expressie in CD4+ T cellen zodanig dat 8% van CD4+ T cellen CD25+Foxp3+ (Fig. 3A, Onderpaneel). De cellen van CD8 + CD25 + T, daarentegen, toonden geen stabiele uitdrukking van Foxp3. Deze resultaten zijn in overeenstemming met onze waarneming in Fig. 1 die tonen dat de uitdrukking van Foxp3 in CD4 + T cellen stabieler is dan dat in CD8+ T cellen 6-8 dagen na de celactivering van t. In eerdere rapporten werden in vitro suppressieve assays uitgevoerd in aanwezigheid van hoge ratio ‘ s van CD4+CD25+ T-cellen (Tregs) ten opzichte van respondercellen, om de Suppressieve functie bij t-celactivering en proliferatie te bepalen. Dergelijke kunstmatige verhogingen van de verhouding van CD4+CD25+ T-cellen tot respondercellen zouden de validiteit van de waarneming in vivo verminderen. De frequentie van CD4+CD25+Foxp3+ T-cellen geïnduceerd tijdens MLR was 8%, wat geacht wordt binnen het fysiologisch relevante bereik te liggen zoals gerapporteerd door andere groepen . De frequentie van natuurlijk voorkomende Tregs in Muis is ook rond deze waaier, nog hebbend regelgevende gevolgen voor de remming van auto-immuniteit. Als Foxp3-cellen die CD4+ T uitdrukken een regulerende functie hadden, zou het celproliferatie tijdens de kweek in vitro moeten hebben geremd. Vergelijkbaar met B / I-geïnduceerde t-celactivering, omvatten T-celfenotypen in een MLR CD44+ effector (16%) en CD44+CD62L+ geheugen T-cellen (84%) (Fig. 3B). Nogmaals, alle CD4+Foxp3+ T cellen uitgedrukt CD44 waaronder 90% ook uitgedrukt CD62L (Fig. 2B). Deze gegevens tonen aan dat 10% van CD4 + Foxp3 + T cellen effector en 90% geheugen fenotypes zijn. Een soortgelijke fenotypische trend werd ontdekt voor CD8 + Foxp3 + T-cellen, die 100% CD44+ tonen waarvan 76% CD62L+ T-cellen waren. Deze resultaten tonen aan dat 24% van CD8 + Foxp3 + T-cellen effector en 76% geheugenfenotypen zijn. Het gebrek aan regulerende functie in deze Foxp3+ T cellen kan het gevolg zijn van hun effector/geheugen fenotype, aangezien gemeld is dat expressie van Foxp3 in menselijke geheugen T cellen resulteerde in verminderde suppressor activiteit . Bovendien verlenen de cellen van het Treg type 1 (Tr1) suppressorfunctie bij afwezigheid van Foxp3-uitdrukking . Gezien de rol van Foxp3 als hoofdregelgever van de verbintenis en het onderhoud van de lijn van Treg in muis , schijnt het dergelijke bonafide regelgevende functie voor de verbintenis van de lijn van Treg in menselijke cellen van T niet te hebben.