4.3 BBB-crossing bsAbs ontwikkeld met single-domain antilichamen
sdAbs zijn kleine (15 kDa), monomere antigeenbindende fragmenten van antilichamen die verschillende voordelen bieden ten opzichte van andere antilichaamfragmenten als “bouwstenen” voor bsAbs. Ze komen in de natuur voor als het antigeen-bindende gedeelte van zware kettingantilichamen in kameelachtige soorten (genaamd VHH) en kraakbeenachtige vissen (genaamd VNAR) of kunnen worden gegenereerd uit conventionele IgGs door monomere, stabiele VH of VL domeinen te verkrijgen of te engineering (Hamers-Casterman et al., 1993; Husack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdAbs zijn zeer stabiel en compact en zij kunnen toegang krijgen tot verzonken epitopen in proteã nen, zoals receptorholtes of de actieve plaatsen van enzymen, die vaak “verborgen” van conventionele IgGs zijn en doelbindende affiniteiten kunnen bereiken vergelijkbaar met die van conventionele antilichamen (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Deze monomere antigeen-bindende eenheden niet koppelen met lichte kettingen, waardoor ze uitstekende bouwstenen voor heterodimerized bsAbs als ze problemen van onjuiste licht-keten koppelen vermijden (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimere bsAbs kan met één of beide “wapens” worden gecreeerd die sdAb zijn, de laatste die in structuur gelijkaardig aan kamelide zwaar-kettingsantilichamen zijn (Fig. 3E). sdAbs kan ook worden gebruikt in verschillende mono -, bi -, of tetravalente fusies met conventionele therapeutische antilichamen of Fabs (Fig. 3E), meestal resulterend in kleinere, minder complexe moleculen, vergeleken met die gegenereerd met scfv ’s of FAB’ s als bouwstenen, die meestal biofysisch goed gedragen en gemakkelijk te produceren zijn (Holliger & Hudson, 2005). Humanisatie van VHHs en engineering van sdAbs is goed beschreven, waardoor menselijke (iz) sdAbs gemakkelijk kunnen worden gegenereerd met optimale doelaffiniteit en uitzonderlijke biofysische eigenschappen (Vincke et al., 2009).
om het mogelijke gebruik van de camelide VHH FC5 als BBB-drager binnen bisspecifieke op het CZS gerichte antilichamen te evalueren, werden monovalente en bivalente fusies (n-en C-terminus) van FC5 met humane Fc ontworpen en geëvalueerd in vitro en in vivo (Farrington et al., 2014). De schijnbare bindingsaffiniteit (kdapp) aan rat BEC van de bivalente fc5fc-fusie was 75 nM, terwijl de monovalente fc5fc-binding in het micromolaire bereik lag. De analyses van schijnbare transmigratie tarieven (Papp) over een in vitro BBB-model, blijkt CNS blootstelling afgeleid van serum/GSK farmacokinetiek van systemisch toegediend antilichaam constructies, en farmacologische reacties uitgelokt door chemisch conjugated BBB-ondoorlatend neuro-actieve peptiden in Hargreaves pijn model, op voorwaarde dat het bewijs van verbeterde BBB transport van deze grote (75 kDa) antilichaam moleculen gemedieerd door FC5: (1) een in-vitro Papp-waarden werden ~ 200 cm/min voor zowel mono – en tweewaardige N-terminaal Fc-fusie-moleculen (FC5Fc) in vergelijking met 4-8 cm/min voor de controle VHH-A20.1Fc of EG2Fc fusies; (2) de schijnbare CZS blootstelling van de fc5fc fusie was 30 maal hoger in vergelijking met controledomein antilichaam-Fc fusies; (3) systemische farmacologische potentie van fc5fc conjugaten met neuropeptiden dalargin of galanine in Hargreaves inflammatoire pijn model was tot 60 maal hoger in vergelijking met monomere FC5–neuropeptide conjugaten. Dit resultaat werd toegeschreven aan de lange circulatoire halfwaardetijd (~96 uur) van FC5Fc-vergeleken met FC5-neuropeptide conjugaten; (4) verschillende controle VHH–Fc neuropeptide conjugaten vertoonden geen systemische werkzaamheid; (5) fusie van FC5 met de C-terminus van Fc resulteerde in verzwakte BBB-kruiscapaciteit. In tegenstelling tot TFR-gerichte BBB-dragerantilichamen vertoonden zowel mono – als bivalente fc5fc-fusieproteïnen in vitro een vergelijkbaar percentage transcytose, vergelijkbare Plasma / CSF-farmacokinetische profielen en vergelijkbare systemische potentie in het farmacodynamiekmodel in vivo, ondanks verschillen in schijnbare bindingsaffiniteit en valentie (Farrington et al., 2014). Deze studies toonden aan dat de BBB-crossing Single-domain antilichaam FC5 kan worden gebruikt als platform BBB drager in beide, heterodimerized “half-antilichamen” en als de meer gemakkelijk schaalbare bi-of tetravalente fusie met conventionele IgGs (Farrington et al., 2014).
een ander potentieel voordeel van VHHs als BBB-dragers is hun natuurlijke weerstand tegen extreme biofysische uitdagingen, zoals temperatuur en pH, evenals tegen protease-degradatie (Kim et al., 2014), vaak aangetroffen in verschillende endocytische compartimenten tijdens transcytose. Zowel FC5 als FC5Fc fusies worden geïnternaliseerd in BEC via clathrin-met een laag bedekte blaasjes, en worden gesorteerd aan vroege endosomes. Interessant genoeg bleek FC5 ook het afstoten van extracellulaire microvesikels (exosomen) van BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013) waarin zowel FC5 als verhoogde niveaus van zijn vermeende receptor Cdc50A werden ontdekt door Westelijke vlek en gerichte massaspectrometrie. Deze studie stelde voor dat shed exosomes het definitieve blaasje van de RMT-weg kan zijn die van de abluminal oppervlakte wordt vrijgegeven die het receptor-antilichaam complex dragen (schematisch getoond in Fig. 4). De RMT-weg en de exosome vorming delen sommige opmerkelijke gelijkenissen. Zoals beschreven in de eerste ontdekking van exosomen, werd een anti-TFR antilichaam gevolgd door elektronenmicroscopie in reticulocyten (Théry, 2011) van het oppervlak van de cellen, in clathrin-gecoate putten, binnen vroege endosomen, op het oppervlak van interne blaasjes van multivesicular endosomen en tenslotte op de vrijgegeven exosomen na fusie van de multivesicular endosomen met het plasmamembraan (Fig. 4). RMT lijkt zich op soortgelijke wijze te ontvouwen en er is aangetoond dat de extracellulaire MICROVESIKELS van BEC verscheidene receptoren bevatten waarvan bekend is dat ze macromoleculen via RMT over de BBB dragen, waaronder TfR, LRPs, LDLR en IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).
uit de beschreven onderzoeken moet duidelijk zijn dat de BBB-dragerarm van op het CZS gerichte BSAB zorgvuldige optimalisatie vereist voor elke RMT-receptor. Belangrijke overwegingen bij het ontwerpen van CZS-targeting bsab ‘ s worden hieronder besproken met het oog op “Lessons-learned” van tfr-BACE1 bsab ontwikkeling en van ons eigen werk met FC5 als een BBB-dragerant antilichaam.