9 de rol van eiwitten in de Spliceosomale katalytische kern
Het vergelijken van de grootte van snrna ‘ s met de veel grotere groep II introns verhoogt de mogelijkheid dat verschillende groep II intron domeinen tijdens de evolutie zijn vervangen door eiwitten in de spliceosomen, wat aanleiding geeft tot de moderne ribonucleoproteïne (RNP) eukaryotische splicing machines. Hoewel er nog geen één-op-één correspondentie bestaat, is het gemakkelijk mogelijk om spliceosomal proteã nen te identificeren die een functie uitvoeren die door elementen van RNA in groep II introns wordt bemiddeld. Bijvoorbeeld, functioneert een aantal U2-geassocieerde proteã nen in het initiëren en het stabiliseren van de interactie van de plaats van de U2 snRNA–tak (Fig. 6.3).5,85 in groep II introns, is het U2 equivalent (deel van domein VI) covalent verbonden met de vertakkingsplaats via een hyperstable haarspeldlus in een regeling die de vorming en stabiliteit van hun interactie verzekert (Fig. 6.2). Vanuit dit evolutionarily perspectief, is het niet verwonderlijk dat een grote fractie van spliceosomal proteã nen direct met snRNA associëren, vaak helpend het in zijn functie.5,85 nochtans, zijn vele spliceosomal proteã nen betrokken bij het uitvoeren van regelgevende functies niet vereist in de context van zelf-splicing intron en zullen waarschijnlijk recentere toevoegingen aan de spliceosomal eiwitcomplement zijn.
zoals hierboven vermeld, wordt aangenomen dat de laatste gemeenschappelijke voorouder van eukaryoten een hoog geëvolueerd, volledig functioneel spliceosoom had dat leek op die gevonden in moderne eukaryoten.1,2 hoewel dit spliceosome waarschijnlijk beduidend minder componenten in vergelijking met zelfs kleinst van moderne spliceosomes bevatte, wijzen de gegevens erop dat de meeste van de belangrijkste componenten in de vroegste versies van spliceosomes aanwezig waren.1-4 inderdaad, toont een subset van spliceosomal proteome die proteã nen omvat verbonden aan de katalytische kern een significant niveau van behoud onder verschillende eukaryotic species, met een aantal spliceosomal proteã nen die onder de meest behouden cellulaire proteã nen zijn.85,86
zoals hierboven vermeld, worden vele goed gekarakteriseerde ribozymes geassocieerd met proteã nen in vivo die hun katalytische activiteit door verscheidene bekende mechanismen verbeteren.83 deze omvatten het stabiliseren van de functionele structuur van RNAs, het bijstaan in het binden en plaatsen van de substraten, en het bijstaan in het binden van functioneel belangrijke metaalionen. Nochtans, is de directe participatie in katalyse tot nu toe niet waargenomen voor om het even welke van de met ribozyme geassocieerde proteã nen bestudeerd.83,87 als men veronderstelt dat spliceosome een enzym van RNA is, zijn spliceosomal snRNAs ongebruikelijke ribozymes in vele opzichten. Misschien het belangrijkst, zijn zij ongewoon klein voor een ribozyme die de splitsing van de fosfodiësterband via de activering van een niet-aangrenzende nucleofiel katalyseren. Andere natuurlijke ribozymes die dergelijke reacties katalyseren, namelijk groep I en II introns en RNase P, zijn minstens tweevoudig langer dan de gecombineerde lengte van menselijke U6 en U2 snRNAs. Deze ribozymes zijn ook veel groter dan nucleolytic ribozymes die aangrenzende 2′-hydroxyl nucleophile voor phosphodiester bond splitsing activeren.24,88,89 de grotere grootte wordt gedacht om deze ribozymes toe te staan om in complexe structuren te vouwen die door veelvoudige tertiaire interactie worden gestabiliseerd, die op hun beurt hen toelaten om geavanceerde actieve plaatsen tot stand te brengen geschikt om de splitsingsplaats, de actieve ionen van het plaatsmetaal, en verre nucleofiel voor in-line nucleofiele aanval nauwkeurig te positioneren. Het is denkbaar dat U6 en U2 snRNAs, wegens hun korte lengte, hoogstens een inefficiënt splicing ribozyme vormen dat andere spliceosomal factoren voor stabiele positionering van de actieve plaatselementen en de reagerende groepen vereist.
Prp8, het meest geconserveerde spliceosomale eiwit, zou een dergelijke rol spelen op de spliceosomale actieve site. Prp8 is misschien wel de meest interessante van de spliceosomale eiwitten, omdat het ongewoon wordt bewaard met 61% identiteit tussen gist en mens.86 nochtans, heeft het weinig duidelijk te onderscheiden functionele motieven in zijn ~ 2300 aminozuurlengte, en de functionele domeinen die tot nu toe zijn onderscheiden zijn gedegenereerd en waarschijnlijk functies uitvoeren die geen verband houden met de cellulaire rol van het originele stichtende motief.86 aan de andere kant speelt Prp8 duidelijk een zeer kritische rol in de spliceosomale actieve site. Het is gekruist met de 5′ en 3′ splice sites en de tak site van premessenger RNAs, in aanvulling op U5 en U6 snRNAs, wat aangeeft dat het aanwezig is in de spliceosomale katalytische kern en rechtstreeks contact met de kritische spelers in de splicing reactie.86,90 verder, is het aangetoond dat Prp8 met verscheidene zeer belangrijke spliceosomal proteã nen met inbegrip van Snu114 en Brr2 in wisselwerking staat (zie hieronder).86,91,92
mutaties in Prp8 worden geassocieerd met een breed spectrum van spliceosomale defecten, waaronder veranderingen in het vermogen van spliceosomen om suboptimale splitsingsplaatsen af te wijzen en suppressie van defecten veroorzaakt door mutaties in andere spliceosomale factoren zoals Prp28, Brr2, U4 en U6 snRNAs.86,93,94 een deelgroep van Prp8-mutanten moduleert selectief de efficiëntie van de eerste of de tweede stap van het splitsen, vooral in suboptimale substraten.58,86,95–97 deze waarnemingen kunnen het best worden verklaard door een hypothese die stelt dat Prp8 betrokken is bij de stabilisatie van alternatieve, elkaar uitsluitende actieve site conformaties die ofwel klaar zijn voor katalyse van de eerste of de tweede stap van splicing, en dat bepaalde prp8 mutanten kunnen leiden tot selectieve hyperstabilisatie van een van deze staten.Hoewel significant bewijs suggereert dat Prp8 waarschijnlijk betrokken is bij de positionering van de substraten en de stabilisatie van de actieve locatie, bestaat er momenteel geen direct bewijs dat suggereert of weerlegt zijn extra betrokkenheid bij metaalioncoördinatie of directe deelname aan spliceosomale katalyse.
deze onzekerheid komt voort uit het feit dat zeer weinig bekend is over de manier waarop Prp8 zijn functie uitoefent. Een innovatieve transposon-gemedieerde screening assay toonde aan dat grote regio ‘ s van Prp8 zeer gevoelig zijn voor het inbrengen van transposons en waarschijnlijk functioneren als een enkele structurele eenheid, hoewel het mogelijk was om transposons in te voegen of zelfs Prp8 te verdelen in twee fragmenten op een aantal andere posities zonder verlies van levensvatbaarheid.90,92 afgezien van een gedegenereerd nucleair localisatiesignaal dicht bij zijn n eindpunt en een gedegenereerd RRM (RNA-herkenningsmotief) motief in het midden van de proteã ne, zijn slechts twee andere functionele domeinen geà dentificeerd in deze ~ 2300 aminozuur-lange proteã ne.86
een gedegenereerde variant van het MPN/Jab1-domein dat geassocieerd is met deubiquitinerende enzymen wordt gevonden in de buurt van het c-Eindpunt van Prp8.86 analyse van de hoge-resolutie structuur van een fragment van Prp8 dat dit domein bevat, heeft aangetoond dat de metaalionbindingsplaats van het isopeptidase-centrum aangetast is en dus waarschijnlijk niet functioneert als een deubiquitinerend enzym.99,100 in vitro, kon een fragment van Prp8 die dit domein bevatten direct aan ubiquitin met een affiniteit binden die met andere bekende ubiquitin-bindende proteã nen vergelijkbaar was.101 verscheidene bekende veranderingen Prp8 die het verbinden verstoorden verstoorden ook het verbinden van ubiquitin in vitro, waarbij de mogelijkheid van een functionele rol voor ubiquitination in het verbinden van regelgeving wordt opgeheven. Belangrijk, hebben de proteomic analyses erop gewezen dat verscheidene spliceosomal factoren, met inbegrip van Sad1,Snu114, Rse1, en Prp8 zelf, ubiquitinated in vivo zijn, en verder vertoont de spliceosomal kernproteã ne Prp19 E3 ubiquitin ligase activiteit in vitro.101-105 verder, speelt ubiquitin een rol in de vorming en het onderhoud van tri-snRNP, misschien door prp8-bemiddelde regelgeving van de functie van Brr2.102 alternatief te moduleren, is het ook mogelijk dat het MPN/Jab1–domein als eiwit-eiwitinteractieplatform functioneert. Een aantal mutaties in Prp8 die in dit domein vallen resulteren in de erfelijke blindheid retinitis pigmentosa, 86 en deze mutaties verzwakten de interactie van Prp8 met Brr2 en Snu114.99
de hoge-resolutie structuur van een ander fragment van Prp8 is bepaald dat een sterk geconserveerd gebied omvat (69% aminozuuridentiteit tussen gist en mens) gelegen dicht bij het C-terminaldomein. De analyse van de structuur onthulde de aanwezigheid van een β-haarspeldvinger die die in ribosomal proteã nen en een gedegenereerde RNase h-als domein lijken lijken.106-108 terwijl de totale geometrie van het RNase H-achtige motief op het niveau van de secundaire en tertiaire structuur goed bewaard werd, vertoonde de primaire sequentie een veel lager niveau van bewaring en slechts één van de drie katalytische residuen is aanwezig op de actieve plaats. Het geconserveerde residu, een aspartaat, is betrokken bij het coördineren van twee katalytische metaalionen in de actieve plaats van canonieke RNase h domeinen. In een studie, mutatie van dit residu in Prp8 in gist resulteerde in geen detecteerbaar groeidefect, wat op redundantie of gebrek aan een kritische functie zou kunnen wijzen.108 in een andere studie, kon het effect ervan niet worden onderzocht aangezien de verandering misfolding van het eiwitfragment veroorzaakte.Er werd geen metaalionbinding waargenomen door het gebied dat overeenkomt met de actieve plaats van het RNase h-domein toen de kristallen werden gekweekt in maar liefst 200 mM MgCl2, wat erop wijst dat de gedegenereerde actieve plaats geen metaalionbindend vermogen heeft. Verder, toonde het fragment van Prp8 die dit domein bevatten een zeer zwakke RNA-Bindende capaciteit, met een Kd van 20 µM aan meer dan 200 µM afhankelijk van de geteste species van RNA.106-108 hoewel het fragment een zeer lage affiniteit voor het binden van RNAs toonde, toonde het een voorkeur voor het binden van duplexrnas die vierwegverbindingen bevatten.108 in geactiveerde menselijke spliceosomes, worden U2 en U6 snRNAs voorspeld om dergelijke structuur te vormen.53,69 wat dit RNase H-als domein bijzonder interessant maakte was dat de aminozuren die aan zijn actieve plaats corresponderen naast residuen in Prp8 worden geplaatst die eerder aan crosslink aan de 5′ lasplaats in precatalytic spliceosomes werden getoond.109 nochtans, werd de efficiency van de vorming van deze crosslink verminderd aangezien precatalytic spliceosomes vorderden om katalytically actieve spliceosomal complexen te worden.109 de waargenomen daling van crosslinking efficiency zou kunnen worden geïnterpreteerd om erop te wijzen dat deze interactie in geactiveerde spliceosomes wordt verstoord. Als alternatief kan de interactie aanhouden, maar de vorming van de crosslink zelf wordt afgeschaft als gevolg van een kleine verandering in de omgeving van de crosslinked residuen. Als dit gedegenereerde RNase h-als domein inderdaad in nabijheid van de 5′ lasplaats in katalytisch actieve spliceosomes wordt geplaatst, is het mogelijk dat het in het stabiliseren van de actieve bouw van snRNAs kan deelnemen, het plaatsen van de substraten in de actieve plaats, en/of het coördineren van katalytische metaalionen. Terwijl het domein door zelf RNA of metaalionen niet kan binden, is het mogelijk dat in aanwezigheid van andere actieve plaatselementen het deel van het substraat of metaal ion-bindende zakken kan vormen. Ondanks deze intrigerende mogelijkheden blijft de rol van Prp8 in spliceosomale katalyse onzeker.