biotine en zijn bindingspartner avidin worden tegenwoordig algemeen gebruikt in de moleculaire biologie voor een reeks verschillende technieken en protocollen. In dit artikel bespreken we de natuurlijke rol van biotine, biotinylatie, de ontdekking van de biotine-avidin interactie en het gebruik van biotinylatie in de moleculaire biologie!
leer meer over in vivo biotinylatie van bacteriële fusieproteïnen
Biotine is een essentiële vitamine voor het leven
hoewel biotine het meest bekend is om zijn rol in de moleculaire biologie, is biotine (vitamine H of vitamine B7) in de eerste plaats een essentieel co-enzym dat door alle organismen voor het leven nodig is. Biotine wordt alleen gesynthetiseerd door planten, de meeste bacteriën en sommige schimmels, dus zoogdieren moeten de vitamine verkrijgen via externe bronnen. Mensen absorberen het grootste deel van de biotine die ze nodig hebben in de dunne darm van de microflora die er wonen.
Biotine is een cofactor die in zijn actieve vorm covalent is gehecht aan de actieve plaats van belangrijke metabole enzymen, waaronder biotinecarboxylase en decarboxylase. Deze enzymen katalyseren de overdracht van carboxylgroepen aan organische zuren om belangrijke cellulaire metabolites te produceren. Biotine werkt als carboxyldrager van de ene verbinding naar de andere. Deze biotine afhankelijke enzymen zijn essentieel voor processen zoals gluconeogenese, lipogenese, aminozuurmetabolisme en energietransductie.
Biotinylering is het algemene proces waarbij biotine wordt toegevoegd aan een eiwit of macromolecuul. Biotine kan enzymatisch of chemisch worden toegevoegd. Enzymatische biotinylering komt van nature voor in cellen en is het proces waarbij biotine covalent wordt gebonden aan een specifieke lysine op de actieve plaats van een nieuw gesynthetiseerd enzym. Biotine eiwit ligase (BPL) is verantwoordelijk voor deze zeer specifieke post-translationele eiwit modificatie. De meeste organismen hebben minder dan vijf enzymen in het gehele proteoom die biotinylated zijn. In E. coli bijvoorbeeld is de BPL, BirA, verantwoordelijk voor het biotinyleren van slechts één lysine in het gehele organisme op het biotine carboxyl carrier protein (BCCP).
ontdekking van de biotine-avidin interactie
eind jaren dertig werd waargenomen dat dieren die voornamelijk eiwitvoer kregen, huidlaesies en andere ernstige gezondheidsproblemen zouden ontwikkelen. Deze ziekte werd genoemd “eiwit letsel” en werd vastgesteld te wijten aan een tekort aan vitamine H later omgedoopt tot vitamine B7/biotine. Eiwitschade zou deze dieren teisteren, zelfs als hun dieet werd aangevuld met biotine. Dus iets in het eiwit werd het isoleren van biotine van wordt geabsorbeerd. In 1940 was Esmond E. Snell in staat om het eiwit dat verantwoordelijk is voor het binden van biotine, avidine, te zuiveren. Avidin werd toepasselijk genoemd naar de kip, “Avian”, ei het werd gezuiverd uit. Snell later bevestigd dat avidin was inderdaad de boosdoener in eiwit letsel door het voeden van ratten gezuiverd avidin (Kresege et al., 2004). Avidin is een glycoproteïne die uit vier identieke subeenheden bestaat die elk één molecuul biotine kunnen binden.
biotine en avidine hebben een zeer sterke affiniteit voor elkaar. Eigenlijk is de band tussen hen een van de sterkste niet-kovalente eiwit-ligand interacties gevonden in de natuur. Zodra de binding is gevormd, wordt deze niet beïnvloed door veranderingen in pH, temperatuur of organische oplosmiddelen.
gebruik van biotine in de moleculaire biologie
Biotine is een relatief klein, in water oplosbaar molecuul dat niet interfereert met de macromoleculen waaraan het wordt toegevoegd. Biotine heeft ook een blootgestelde zijketen die gemakkelijk kan worden gemanipuleerd om reactieve species te maken zonder de avidin bindende plaats te beà nvloeden. Met al deze eigenschappen is het niet verwonderlijk dat wetenschappers biotine en zijn sterke interactie met avidin voor Moleculaire Biologie en biotechnologiedoeleinden begonnen te exploiteren.
zodra een polypeptide is gebiotinyleerd (meer hierover hieronder) kan het worden geïncubeerd of samen tot expressie gebracht met avidine of een structureel vergelijkbaar eiwit dat werd ontdekt in de jaren 1960, strepavidine. Het biotine-avidine complex kan dan worden gebruikt en / of gemanipuleerd voor het beoogde doel van een wetenschapper. Twee van de gemeenschappelijkste toepassingen van biotinylation in het laboratorium zijn eiwitreiniging en immunoprecipitatieexperimenten. Biotinylated proteã nen of complexen kunnen gemakkelijk worden gezuiverd gebruikend kolommen of parels die met avidin met een laag worden bedekt.
de biotine-avidine interactie is ook aangepast voor gebruik in immunohistochemie en antilichaametikettering. In deze experimenten, wordt biotine toegevoegd aan een primair of secundair antilichaam dat uw proteã ne van belang of Primair antilichaam respectievelijk richt. Avidin gebonden aan een verslaggever wordt dan toegevoegd aan de reactie voor gemakkelijke opsporing. De veelvoudige die biotinebindingsplaatsen op avidin worden gevonden zijn ook ideaal voor signaalversterking tijdens deze experimenten. Tijdens detectie kan een biotinyleerd verslaggeversenzym dat vooraf is geïncubeerd met vrij avidin aan uw monster worden toegevoegd. Om het even welke vrije biotine-bindende plaatsen op dit complex kunnen aan uw biotinylated antilichaam binden. Dit leidt tot een groot netwerk van biotine-avidin complexen die aan uw proteã ne van belang worden gebonden die tot versterking van het verslaggeversignaal en gemakkelijkere opsporing leiden. Deze strategie wordt aangeduid als de Avidin-biotine Complex (ABC) immunohistochemie (IHC). Voor meer informatie over ABC en IHC kijk op Thermo Fisher Scientific ‘ s guide.
Er zijn een reeks andere moleculaire biologie toepassingen voor biotine en avidine. Een korte lijst van enkele andere veel voorkomende toepassingen en links naar relevante papers en webpagina ‘ s zijn hieronder vermeld.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of biotine en avidine, macromoleculen van belang moeten eerst worden gebiotinyleerd. De wetenschappers hebben verscheidene methodes aan chemisch biotinylate macromoleculen van belang zowel in vitro als in vivo ontwikkeld.
Biotinyleringsreagentia:
de blootgestelde zijketen van biotine kan via gespecialiseerde chemicaliën (biotinyleringsreagentia) in vivo worden gekoppeld aan functionele aminozuurgroepen. Er is een verscheidenheid van beschikbare biotinyleringsreagentia die in de functionele groepen of residuen verschillen zij richten, evenals hun oplosbaarheid, en zo zijn de verschillende reagentia nuttig voor biotinylation in verschillende micromilieu. Er zijn ook reversibele en splitsbare biotinyleringsreagentia om te helpen met de specifieke elutie van biotinylated proteã nen. Voor hulp bij het bepalen van welke biotinyleringsreagens u moet gebruiken, kunt u de selectietool voor Biotinyleringsreagens van Thermo Fisher Scientific raadplegen.
AviTag en BirA:
eiwitten kunnen ook worden gebiotinyleerd door gebruik te maken van de specificiteit van E.coli BPL, BirA. Als je het je herinnert, biotinyleert BirA slechts één lysine in het hele E. coli proteoom. Gebruikend deze kennis, identificeerden de wetenschappers de 13 die aminozuuropeenvolging voor erkenning en biotinylation van het BirA wordt vereist. Deze 13 aminozuursequentie wordt AviTag genoemd. Gebruikmakend van AviTag, kan men een proteã ne van belang met biotine etiketteren door eenvoudig een fusie te creëren waarin AviTag aan of het eind van N of C van het proteã ne wordt toegevoegd. Het BirA is aangetoond dat het AviTag effectief biotinyleert en eiwitten tot expressie brengt in bacteriën, gisten, insecten en zoogdiercellen. Bekijk Kay et al., 2009 for methods on biotinylating proteins with BirA.
U kunt plasmiden vinden die zowel AviTag als BirA bevatten bij Addgene!
Oligonucleotide etikettering:
biotine kan worden toegevoegd aan beide terminus van een DNA-sequentie tijdens een polymerasekettingreactie (PCR) door gebruik te maken van een gebiotinyleerde primer. Biotine kan ook enzymatisch tijdens PCR worden opgenomen gebruikend een biotine geëtiketteerd dUTP. Er zijn veelvoudige types van biotinetiketten die aan oligonucleotide afhankelijk van uw stroomafwaartse toepassing kunnen worden toegevoegd. Biotine geëtiketteerde oligonucleotides kan in een veelheid van toepassingen met inbegrip van maar niet beperkt tot kruising in situ, bevlekken (noordelijke en Zuidelijke) en affiniteitsband worden gebruikt.
Fotobiotinylering:
Fotobiotine kan worden gebruikt om DNA en RNA niet-selectief te labelen. Photobiotinacetaat bestaat uit een biotin molecuul in bijlage aan een photoreactive arylazide groep. Onder sterk zichtbaar licht wordt de arylazide groep reactief en vormt een link met nabijgelegen nucleïnezuren (McInnes et al., 1990). Fotobiotinylatie is soms gemakkelijker en goedkoper dan andere enzymatische methoden. De wetenschappers hebben deze methode algemeen gebruikt om proteã nen of polypeptides aan een vast substraat vast te maken (Holden en Cremer, 2003).
1. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. “Molecular Biology of Biotin Attachment to Proteins; Symposium: Nutrition, Biochemistry and Molecular Biology of Biotin” J. Nutr, 129 (2009a): 477-484. PubMed PMID: 10064313.
2. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. ” The enzymatic biotinylation of proteins: A post-translational modification of exceptional specificity.”Trends in biochemische Wetenschappen, 24.9 (1999b): 359–363. PubMed PMID: 10470036.
3. Said, H. M. ” biotine: de vergeten vitamine.”American Journal of Clinical Nutrition 75.2 (2002): 179-180. PubMed PMID: 11815306.
4. Nicole Kresge, R. D. S. and R. L. H. ” The Discovery of Avidin by Esmond E. Snell. J Biol Chem 279.e5 (2004). PubMed PMID: 20353954.
5. Kay, B., Thai, S., & Volgina, V. ” High-Throughput Biotinylation of Proteins.”Methods Mol Biol, 498 (2009): 185-196. PubMed PMID: 18988027. PubMed Central Pmcid: PMC3223083.
6. McInnes, J. L., Forster, A. C., Skingle, D. C., & Symons, R. H. ” Preparation and uses of photobiotin.”Methods in Enzymology 184 (1990): 588-600. PubMed PMID: 2388593
7. Holden, M. A., & Cremer, P. S. ” Light activated patterning of dye-label moleculen on surfaces.”Journal of the American Chemical Society 125.27 (2003): 8074-8075. PubMed PMID: 12837056.
8. Pan, J. feng, Liu, N. hua, Shu, L. yuan, & Sun, H. ” Application of avidin-biotin technology to improve cell adhesion on nanofibrous matrices.”Journal of Nanobiotechnology 13.1 (2015): 1–14. PubMed PMID: 25980573. PubMed Central Pmcid: PMC4461904.
9. Huang, Q., Mao, Z., Li, S., Hu, J., & Zhu, Y. ” A non-radioactive method for small RNA detection by northern blotting.”Rice 7.1 (2014): 1-7. PubMed PMID: 26224555. PubMed Central Pmcid: PMC4884002.
10. Boer, E. De, Rodriguez, P., Bonte, E., Krijgsveld, J., Katsantoni, E., Heck, A., … Strouboulis, J. “Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.”PNAS 100.13 (2003): 7480-5. PubMed PMID:12802011. PubMed Central Pmcid: PMC164612.
11. Liou, Y.-R., Wang, Y.-H., Lee, C.-Y., & Li, P.-C. ” Buoyancy-Activated Cell Sorting Using Targeted Biotinylated albumine Microbubbles.”PLoS ONE 10.5 (2015). PubMed PMID: 25993512. PubMed Central Pmcid: PMC4439073.
12. Ludwig, L. B., Hughes, B. J., & Schwartz, S. A. ” Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examinate specific dsDNA, ssDNA or RNA–protein interactions.”Nucleic Acids Research, 23.18 (1995): 3792-3793. PubMed PMID: 7479014. PubMed Central Pmcid: PMC307283.
13. Howarth, M., & Ting, A. Y. ” Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.”Nature Protocols 3.3 (2008): 534-545. PubMed PMID: 18323822. PubMed Central Pmcid: PMC2671200.
14. Bloch, B. ” Biotinylated sondes for in situ hybridization histochemistry: use for mRNA detection.”The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society, 41.12 (1993): 1751-1754.PubMed PMID: 8245422.
Additional resources on the Addgene blog
- In vivo biotinylatie van bacteriële fusieproteïnen
- leer hoe biotine wordt gebruikt in Split-BioID: een verbeterde methode voor het bestuderen van eiwit-eiwitinteracties
- leer hoe biotine kan worden gebruikt met CRISPR