DISCUSSIE
Onze resultaten tonen aan dat, door een zorgvuldige planning, training en standaardisatie van reagentia en protocollen, een grensoverschrijdend netwerk van laboratoria over de capaciteit voor het produceren van consistente en vergelijkbare HAI assay-resultaten. De vijf public health en academische laboratoria die deelnamen aan deze studie maakten deel uit van PCIRN, dat werd ontwikkeld om Canada ‘ s nationale capaciteit te vergroten om vaccin-en ander influenzaonderzoek te ondersteunen in het geval van een pandemie. In een pandemische situatie, met een hoog volume, hoge druk en geografisch verspreide influenzatest, zal standaardisatie van de HAI assay van het grootste belang zijn om de vergelijkbaarheid van de resultaten tussen laboratoria te waarborgen. De pcirn laboratoria toonden een hoge standaard van binnen-laboratorium reproduceerbaarheid, met 99,8% precisie van duplicaten (99.2% tot 100% per laboratorium), 97,8% van de titers binnen een tweevoudig bereik gedurende herhaalde testdagen (93,3% tot 100% per laboratorium) en 91,1% van de testsera die de reproduceerbaarheid van de titer vertonen bij elke herhaling van het zes-assayprotocol (60% tot 100% per laboratorium). De interlaboratoriumreproduceerbaarheid was ook hoog, met mediane titers voor alle replicaten van de vier nonreferentielaboratoria binnen het 2-voudige van het referentielaboratorium voor 100% van de geteste sera. Op laboratoriumbasis, de titers van 94,3% en 98.9% van de monsters gekwantificeerd binnen een enkele verdunning van respectievelijk het referentielaboratorium en de consensustiters (bereik: 85% tot 100% en 95% tot 100%). Deze percentages voldoen aan de typische aanvaardbaarheidsdrempels voor variabiliteit van de HAI-assay (d.w.z. dat ten minste 80% van de monsters binnen 1 verdunning van de nominale waarden en/of GMT ‘ s voor alle assessment ligt ). HAI assay specificiteit (100%) en gevoeligheid (87,5% tot 100%) in PCIRN laboratoria waren vergelijkbaar goed binnen de acceptatiecriteria van eerdere studies (d.w.z. 100% van de negatieve monsters moet worden gekwantificeerd als onder de kwantificatieniveaus, en ten minste 80% van de positieve monsters moet worden gekwantificeerd als positief ).
voor de intralaboratoire component van de HAI assay variabiliteit lijkt de herhaalbaarheid binnen pcirn-laboratoria vergelijkbaar met die in andere studies (5, 22). Een voorbehoud van deze Vorige studies was dat niet meer dan drie herhalingen werden onderzocht, ondanks de gangbare validatiepraktijken van de immune assay waarbij zes of meer herhaalde assays werden onderzocht (24-27). Als zodanig, is het niet duidelijk of hun gegevens direct vergelijkbaar zijn met de resultaten bepaald over zes analyses in deze studie. Niettemin lijken onze bevindingen van 0% tot 6,7% (mediaan, 0%) van de tests met resultaten die meer dan 2 maal verschillen van die van andere testherhalingen vergelijkbaar met de 4,8% tot 7,1% die eerder in één laboratorium (22) en de 0% tot 15% (mediaan, 2%) in negen laboratoria (5).
onze bevindingen van hoge HAI titer reproduceerbaarheid tussen geografisch verspreide pcirn laboratoria contrasteren met eerdere rapporten die aanzienlijke variabiliteit aantonen tussen internationale laboratoria die deze test uitvoeren (5, 6, 9-12). Bijvoorbeeld, gegevens uit een grote collaboratieve studie (11 laboratoria) gevonden per monster GCV ‘ s variërend van 84% tot 803% (mediane GCV per virus van 138%, 155% en 261% ). Andere onderzoeken meldden GCV ’s voor H1N1-en H5N1-monsters die 95% tot 345% (11) en 22% tot 582% (6) overspannen, en GMT’ s verschilden tussen laboratoria tot 80-voudig (11) of 128-voudig (9). Terwijl eerdere rapporten vaak een groter aantal deelnemende laboratoria bevatten dan het huidige onderzoek, zelfs wanneer slechts zes laboratoria gegevens bijdroegen, was de mediane INTERLABORATORIUM GCV 83% voor vijf H1N1-monsters, waarvan 80% een viervoudig verschil tussen laboratoria overschreed (11). In de huidige studie daarentegen bleek de mediane GCV ‘ s per virus van slechts 39% en 17%, met 95% van de monsters binnen een viervoudig verschil tussen laboratoria. Eén Monster overschreed het viervoudige verschil; de titer was voor dit monster in één laboratorium niet kwantificeerbaar en daarom werd de laagste waarde toegekend in plaats van gemeten. Als dat monster uit de analyses zou worden weggelaten, zou de maximale GCV 75,5% zijn, wat een lagere waarde zou vertegenwoordigen dan de minimale GCV in andere studies. Hoewel dat monster een grotere variabiliteit vertoonde dan andere, bleek dit lage meetbereik over het algemeen minder nauwkeurig dan hogere meetbereiken. De GCV varieerde bijvoorbeeld van 43,4% tot 156,4% bij titers tussen 10 en 80 vergeleken met 11,1% tot 53,1% bij hogere titers (Fig. 3). Een grotere variabiliteit met monsters met een lagere titer is ook eerder beschreven (23) en heeft waarschijnlijk bijgedragen tot incongruente seroprotectieclassificaties in het huidige onderzoek voor de drie H1N1-monsters met titers die het dichtst bij de drempelwaarde van 40 liggen (consensustiters van 22, 24 en 43). Ondanks dit bleef de diagnostische nauwkeurigheid van seroprotectie in alle pcirn-laboratoria hoog (93,6% wanneer consensustiters werden gebruikt om seroprotectie te definiëren en 89,5% in vergelijking met referentie laboratoriumwaarden).
Hoge overeenstemming van INTERLABORATORIUM HAI titers in pcirn laboratoria kan betrekking hebben op de zorgvuldige harmonisatie van HAI assay procedures en reagentia in het PCIRN. Deelnemers aan eerdere studies die een hoge interlaboratoriumvariabiliteit toonden, gebruikten over het algemeen HAI assay-methoden die varieerden tussen laboratoria. Assay variabelen waarvan wordt aangenomen dat ze bijdragen aan variabiliteit in resultaten omvatten de hoeveelheid toegevoegde virus, het virale kweeksysteem (bijv., geëmbryoneerde kippeneieren versus weefselkweek), de duur van de RDE-behandeling, de initiële serumverdunning, het type en de leeftijd van de gebruikte RBC ‘ s en de tijd die is toegestaan voor RBC-bezinking (5, 11, 12). Verrassend, echter, toen Wood et al. op voorwaarde dat commerciële en publieke laboratoriumdeelnemers die betrokken zijn bij seizoensinfluenzavaccintests in Europa een gedetailleerde standaardprocedure en gemeenschappelijke reagentia/materialen hadden, meldden zij dat de interlaboratoriumvariatie niet significant was verbeterd (10). De auteurs speculeerden dat aanhoudende “lokale technische variaties”, evenals verschillende RBC-leveranciers, de reproduceerbaarheid tussen laboratoria zouden kunnen hebben beïnvloed, maar merkten op dat verdere standaardisatie buiten de grenzen van de haalbaarheid voor hun studie lag. Latere publicaties interpreteerden deze bevindingen als een aanwijzing dat normalisatie van de HAI-assay tussen laboratoria in het algemeen geen haalbare benadering is voor het harmoniseren van HAI-resultaten tussen verschillende laboratoria (8, 12), en ten minste één groep heeft geprobeerd een aangepaste en robuustere HAI-assay te ontwikkelen om betrouwbaardere en reproduceerbare gegevens te genereren (22).in het huidige onderzoek hebben de pcirn-laboratoria zich strikt gehouden aan het standaard, voor het publiek toegankelijke HAI-testprotocol van de Wereldgezondheidsorganisatie, waarin punten die onderhevig zijn aan technische of interpretatieve variaties tussen laboratoria werden geharmoniseerd voordat met het onderzoek werd begonnen. Belangrijke reagentia (bijvoorbeeld RDE, RBC, virusvoorraden) werden zoveel mogelijk bij dezelfde leveranciers verkregen. Bovendien maakte het beperken van de tests tot één technoloog op elke testlocatie een grotere standaardisatie mogelijk. Het mogelijke effect van het gebruik van meerdere personeelsleden in elk laboratorium werd in dit onderzoek niet getest. Hoewel het gebruik van meerdere operatoren de variabiliteit zou kunnen vergroten, toonde het enige onderzoek waarin deze mogelijkheid voor HAI-tests werd onderzocht geen significant verschil aan tussen de resultaten van twee operatoren in hetzelfde laboratorium (22).
potentiële variaties tussen laboratoria in de virusstammen die voor gebruik in de test werden geteeld, werden geminimaliseerd tussen pcirn-laboratoria door gebruik te maken van viruszaden uit een enkele bron die in dezelfde cellijn onder vergelijkbare omstandigheden in alle laboratoria werden geteeld. Wij speculeren dat interlaboratoriumreproduceerbaarheid vatbaar zou kunnen zijn voor nog verdere verbeteringen indien virale werkvoorraden centraal zouden worden geproduceerd en onder deelnemende laboratoria zouden worden verdeeld. Het belang van virusstamvariaties voor HAI-eindpunttiters wordt goed geïllustreerd door de 2-tot 3-voudige-lagere titers die in één studie werden aangetoond toen de HAI-assay een a/Cal pH1N1-stam gebruikte in vergelijking met de x179a-reassortant die nog steeds gelijkwaardige hemagglutininen en neuraminidasen bezat (11). Helaas werden de voorraden niet gesequenced in het kader van deze studie, en daarom kunnen we niet controleren of alle laboratoria virussen met identieke hemagglutininesequenties gebruikten. Zelfs als kleine sequentievariaties waren geïntroduceerd door lokale voortplanting van virusbestanden, was de variabiliteit tussen laboratoria in dit onderzoek klein, en het is dus moeilijk voor te stellen hoe het gebruik van bestanden met identieke HA-sequenties de variabiliteit verder zou kunnen verminderen. Hoewel de verschillen in deze kleine steekproef niet meer dan 2 maal groter waren, zouden kleine variaties in de Ha-sequentie die door lokale vermeerdering van virusbestanden werd geïntroduceerd een mogelijke verklaring kunnen zijn voor de tendens tot onderschatting van H1N1-titers en overschatting van H3N2-titers.
verschillende studies hebben een verminderde interlaboratoriumvariabiliteit in HAI-titers gemeld door de resultaten te kalibreren aan de hand van internationale normen (6, 11-13); dergelijke normen bestaan echter niet voor de huidige seizoensinfluenza B-en influenza A H3N2-virusstammen, en de constante antigene drift van seizoensstammen die tot een jaarlijkse herformulering van de vaccins leiden, kan de voortdurende ontwikkeling en validatie van nieuwe normen vereisen. In deze studie lijkt de vergelijkbaarheid tussen laboratoria beter dan die welke wordt bereikt door het gebruik van zelfs de meest effectieve ijkstandaarden. Bijvoorbeeld, na kalibratie met is 09/194, Wood et al. (11) rapporteerde dat de maximale verschillen tussen GMT ‘ s in verschillende laboratoria van 80-voudige tot 64-voudige daalden (d.w.z. een waarde die nog steeds aanzienlijk hoger is dan de maximale 11-voudige in het huidige onderzoek) en dat het GCV—bereik tussen laboratoria daalde van 95% tot 345% (mediaan 105%) tot 345% tot 231% (mediaan 109%) – d.w.z. ruim boven het bereik van 0% tot 156% (mediaan 27%) dat in dit onderzoek werd gezien. Evenzo, het gebruik van vervanging is 10/202 verminderde de GCV tussen laboratoria van een bereik van 108% tot 157% tot een bereik van 24% tot 144% over vijf monsters en maximale verschillen tussen laboratoria van 43-voudige tot 21-voudige (13), en, met behulp van de 07/150 standaard, Stephenson et al. (6) verminderde de mediane GCV van 15 NIBRG-14 H5N1 clade 1 monsters van 125% (bereik 31% tot 582%) tot 61% (34% tot 535%).hoewel de exacte reden (en) voor de hoge mate van overeenstemming tussen de pcirn-laboratoria ten opzichte van eerdere studies niet kan worden vastgesteld, werd ons succes vergemakkelijkt door de stimulans die wij als nationaal netwerk hadden om te werken aan het gemeenschappelijke doel om reproduceerbare processen tot stand te brengen. Gedetailleerde en rigoureuze proces-en reagensharmonisatie tussen locaties is misschien wel het enige “nieuwe” aspect dat we aan deze studie brachten, in vergelijking met de jarenlange literatuur die een slechte HAI reproduceerbaarheid tussen laboratoria laat zien. Echter, onze gegevens suggereren dat met zorgvuldige standaardisatie, interlaboratorium variaties in HAI titers kunnen worden gereduceerd tot niveaus vergelijkbaar met die waargenomen in afzonderlijke laboratoria. Mogelijke volgende stappen om variaties in HAI titers in laboratoria wereldwijd tot een minimum te beperken, zijn de mobilisatie van netwerken/consortia, de implementatie van richtlijnen en/of wettelijke vereisten voor het gebruik van standaardprocedures en reagentia, gestandaardiseerde training om reproduceerbaarheid te waarborgen, en het verlenen van ondersteuning en/of stimulansen voor de laboratoria om het concept “normalisatie” te omarmen.