Sulfaat-reducerende bacteriën in de menselijke uitwerpselen en hun associatie met inflammatoire darmziekten

Abstracte

We hebben gezocht naar sulfaat-reducerende bacteriën in de uitwerpselen van 41 gezonde individuen en 110 patiënten met een Lever-gastro-Enterologie-Eenheid met een bepaalde vloeistof (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, Frankrijk). De 110 patiënten werden gescheiden bij 22 patiënten met inflammatoire darmziekten en 88 patiënten werden opgenomen in het ziekenhuis voor andere lagere (n=30) of hogere (n=58) spijsverteringskanaal ziekten. Sulfaatreducerende bacteriën werden geïsoleerd uit 10 gezonde personen( 24%), 15 patiënten met inflammatoire darmziekten (68%) en 33 patiënten met andere symptomen (37%). Een multiplex PCR werd bedacht voor de identificatie van Desulfovibrio piger (voorheen Desulfomonas pigra), Desulfovibrio fairfieldensis en Desulfovibrio desulfuricans, en toegepast op de bovengenoemde isolaten. De stammen van sulfaatreducerende bacteriën bestonden uit D. piger (39 isolaten), D. fairfieldensis (19 isolaten) en D. desulfuricans (één isolaat). De prevalentie van D. piger was significant hoger bij patiënten met inflammatoire darmziekte (55%) in vergelijking met gezonde personen (12%) of patiënten met andere symptomen (25%) (P<0,05).

1 Inleiding

de ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC) zijn chronische inflammatoire darmziekten (IBD) met onbekende etiologie, maar ze zijn waarschijnlijk afhankelijk van omgevingsfactoren, genetische en immuunfactoren . Er is een infectieuze oorsprong voorgesteld en veel micro-organismen zijn betrokken bij het ontbreken van overtuigende argumenten. In beide syndromen reageert de darmontsteking echter wel op antibiotica. In diermodellen van chronische colitis, is Luminal flora een essentiële cofactor voor de ziekte om voor te komen . Dit kan de hernieuwde interesse in de rol van de darmflora als oorzaak van deze aandoeningen verklaren .

Sulfaatreducerende bacteriën (SRB) zijn anaërobe micro-organismen die verschillende sulfaatreductie uitvoeren om energie te verkrijgen, wat resulteert in de afgifte van een grote hoeveelheid sulfide. Ze worden vaak geïsoleerd uit omgevingsbronnen, maar zijn ook aanwezig in het spijsverteringskanaal van dieren en mensen. Als Desulfomonas pigra is geherclassificeerd als Desulfovibrio piger comb. nov. menselijke isolaten van SRB bestaan bijna uitsluitend uit Desulfovibrio-soorten . De recente bevindingen suggereren dat SRB een rol in menselijke ziekten kan hebben. Ze zijn in verband gebracht met de klinische ernst van menselijke parodontitis , en geïsoleerd van ernstige abcessen (abdominale of hersenen), bloed of urine . In deze settings, zijn de meeste stammen geà dentificeerd als Desulfovibrio fairfieldensis, een recent voorgestelde nieuwe species , door 16S ribosomal RNA gen (16S rDNA) het rangschikken. Desulfovibrio desulfuricans, de typesoort van het geslacht Desulfovibrio, is ook geïsoleerd uit menselijke exemplaren . De implicatie van SRB in IBD is voorgesteld aangezien hun metabolisch eindproduct, waterstofsulfide, een cytotoxische verbinding is . Deze verbinding kan werken door een remming van butyraat oxidatie, de belangrijkste energiebron voor colonocyten. De aantasting van de functies van het intestinale epitheel zou leiden tot celdood en chronische ontsteking. De met IBD geassocieerde SRB-soorten zijn echter nog niet geïdentificeerd. Hun identificatie zou toelaten om te zoeken naar virulentie factoren evenals hun gevoeligheid voor antimicrobiële stoffen.

in medische laboratoria wordt SRB zelden geïsoleerd uit menselijke monsters vanwege een trage groei. Kolonies verschijnen na meer dan 3 dagen van incubatie en worden niet opgemerkt, worden overwoekerd door de begeleidende flora, tenzij zij de dominante of enige soort aanwezig zijn. Hun zoektocht naar uitwerpselen is dus moeilijk, tenzij een specifiek medium wordt gebruikt. Dergelijke media bevatten meestal een organische verbinding (elektronendonor en koolstofbron), sulfaat (elektronenacceptor), ijzer en een reductiemiddel. De groei van SRB in specifieke kweekmedia wordt gemakkelijk gedetecteerd door een zwart worden van het medium als gevolg van de productie van waterstofsulfide (H2S), wat resulteert in de vorming van een ferrosulfideprecipitaat. Eenmaal geïsoleerd uit klinische monsters, kan identificatie op soortniveau moeilijk zijn. Het is bijvoorbeeld niet mogelijk om D. fairfieldensis en D. desulfuricans te onderscheiden door fenotypische tests. Aldus, is de versterking van het gen een waardevol hulpmiddel om een dergelijke identificatie te bereiken.

het belangrijkste doel van deze studie was om te bepalen welke Desulfovibrio-soorten eventueel geassocieerd kunnen worden met IBD. Voor dit doel werd een specifiek vloeibaar medium (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, Frankrijk) gebruikt voor de groei van de SRB uit de ontlasting van gezonde personen en patiënten die zijn opgenomen in de afdeling Hepato-Gastro-enterologie van het Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy, Frankrijk. Een multiplex PCR werd bedacht voor de identificatie van de isolaten op species niveau.

2 Materialen en methoden

2.1 patiënten

uitwerpselen van 41 gezonde personen (17 mannen en 24 vrouwen); gemiddelde leeftijd 38 jaar, variërend van 1-101 jaar) en 110 patiënten (67 mannen en 43 Vrouwen; gemiddelde leeftijd 57 jaar, variërend van 14-100 jaar) van de Hepato-Gastro-enterologie eenheid van het Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy, Frankrijk, werden verzameld. Gezonde individuen geraadpleegd achtereenvolgens voor een controle. Er werd geen pathogeen micro-organisme gevonden in hun ontlasting. Gezonde personen en patiënten hebben in de maand voordat het monster werd verkregen geen antibiotica toegediend gekregen. Patiënten werden verdeeld in drie groepen: IBD (n = 22) inclusief 17 CD en vijf; andere lagere darmziekten (n=30) omvatten 23 patiënten met lichte of matige symptomen zoals buikpijn, darmtransitproblemen en rectorrhagie, en zeven patiënten met colonkanker; aandoeningen van het bovenste spijsverteringskanaal (n=58) omvatten galstenen, cirrose, hepato-cellulair carcinoom, maag-en pancreatumoren. IBD werd gediagnosticeerd op basis van klinische, endoscopische en histologische bevindingen. De meeste IBD-patiënten vertoonden een actieve ziekte (Tabel 1).

2.2 SRB detectie en telling

Eén gram feces werd gemengd met 4 ml fosfaatgebufferde zoutbuffer en gecentrifugeerd (3000 rpm, 5 min). Een milliliter supernatans werd onmiddellijk ingeënt in een vloeibaar medium (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, Frankrijk) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort bestaan de testkits Labège® uit flacons met 9 ml van een specifiek medium (organische verbindingen: lactaat en acetaat, reductiemiddel: titaancitraat), anaeroob geconditioneerd voor SRB-detectie. Het wordt geïnoculeerd met een spuit door een rubberen dop. Dit heldere en kleurloze medium is oorspronkelijk ontworpen voor de detectie van SRB uit milieumonsters. Het werd vergeleken met het veelgebruikte vaste medium E van Postgate (organische verbinding: lactaat, reducerende middelen: ascorbinezuur en thioglycolzuur) , parallel geïnoculeerd onder anaërobe atmosfeer. SRB werden opgesomd met behulp van lange en smalle buizen gevuld met het laatste medium en ingeënt met decimale verdunningen van de ontlasting. Alle geïnoculeerde media werden gedurende 2 maanden bij 37°C geïncubeerd. De aanwezigheid van SRB werd vastgesteld door de vorming van een zwart neerslag (ferrosulfide) in vloeibare media en door het verschijnen van zwarte kolonies in vaste media.2.3 ontwerp van PCR primers

De 16s rDNA sequenties van Desulfomonas en Desulfovibrio stammen beschikbaar in de GenBank database werden vergeleken met behulp van de Sequence Navigator software, Versie 1.0.1 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Zij heeft toestemming verleend om zes primers te ontwerpen voor de identificatie door middel van PCR van de SRB die eerder geïsoleerd was van mensen , respectievelijk gerelateerd aan D. piger (voorheen Desulfomonas pigra) ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, en D. fairfieldensis ATCC 700045. D. desulfuricans Essex 6 en D. desulfuricans MB werden onderscheiden aangezien de 16S rDNA opeenvolgingen van deze spanningen een verschil van 3% vertonen. De primers waren 27K-F (5′-CTG CCT TTG ATA CTG CTT AG-3′), 27K-R (5′-GGG CAC CCT CTC GTT TCG GAG a-3′), Essex-F (5′-CTA CGT TGT GCT AAT CAG CAG CGT AC-3′), Fair-F (5′-TGA ATG AAC TTT TAG GGG AAA GAC-3′), Pig-F (5′-CTA GGG TGT TCT Cat Cat CCT AC-3′) en P687-R (5′-gat ATC Tac GGA TTT CAC TCC Tac Acc-3′) (Tabel 2). De specificiteit van deze primers werd gecontroleerd op alle bacteriële sequenties beschikbaar uit de GenBank database met behulp van het Blast programma, Versie 2.0 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA).

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. desulfuricans Essex 6, twee stammen gerelateerd aan D. desulfuricans MB en acht stammen geïdentificeerd als D. fairfieldensis) werden gebruikt als positieve controles. De gevoeligheid van de PCR werd geëvalueerd met verdunningen van gekwantificeerde bacteriële stam suspensies. De specificiteit van de PCR werd gecontroleerd met negatieve controles waaronder typestammen (Bilophila wadsworthia ATCC 49260T, Desulfovibrio gigas DSM 1382T, Desulfovibrio vulgaris DSM 644T) en gemeenschappelijke klinische intestinale stammen behorend tot de volgende soorten: Bacteroides broos, Bacteroides merdae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniform, Bacteroides vulgatus, Campylobacter jejuni, Citrobacter freundii, Bacteriën onschadelijk, Enterobacter romeinse rijk, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium kleine, Eubacterium kleverige, Fusobacterium nucleatum, Kopenhagen van het kanaal, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Peptostreptococcus grote, Proteus prachtige, Proteus common, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, en Streptococcus bovis.

aan het einde van de incubatietijd werden alle 151 geïnoculeerde testkits Labège® gecontroleerd met behulp van de multiplex PCR. DNA-extracten werden verkregen uit 500 µl kweekmedia, na centrifugering en resuspensie in te buffer (10 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA, pH 8). In het kort werden de cellen gelyseerd met achtereenvolgens lysozym (3 mg ml−1), SDS (1%, w/v) en proteïnase K (0,25 mg ml−1). Na een nachtelijke incubatie bij 37°C werd DNA geëxtraheerd met de standaard phenol / chloroform / isoamylalcohol methode. Elk PCR-mengsel van 50 µl bevat 5 µl DNA-extract (ongeveer 50 ng DNA) en uiteindelijke hoeveelheden van 0,4 µM van elke primer, 0,8 mM van elk deoxynucleoside–trifosfaat (Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Duitsland), 0,4 mM Tris-HCl-buffer, 1,5 mM MgCl2 en 1,5 U Taq DNA-polymerase (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, UK). Alle reacties werden uitgevoerd met behulp van het GeneAmp PCR-systeem 2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA). Een eerste denaturatiestap van 94°C gedurende 4 min werd gevolgd door 30 denaturatiecycli (94°C, 1 min), gloeien (55°c, 1 min) en verlenging (72°C, 2 min), en met een laatste verlenging (72°C, 5 min). In elke test werden negatieve (water in plaats van DNA-extract) en positieve (D. fairfieldensis DNA-extract) controles opgenomen. Geamplificeerde producten verdwenen door elektroforese in 1,5% (g/v) agarose gels die ethidiumbromide (1,6 mg ml−1) bevatten. Een 100-bp DNA ladder werd gebruikt als maat marker (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, USA). D. piger, D. desulfuricans Essex 6, D. desulfuricans MB en D. fairfieldensis werden geïdentificeerd door een 255-, 255-, 396 – en 534-BP band, respectievelijk. D. piger en D. desulfuricans Essex 6 werden verder onderscheiden door afzonderlijke PCR-Analyses met behulp van hun respectieve specifieke primers. Voor negatieve steekproeven, werd de versterking van 16S rDNA met behulp van de consensusprimmers 27f en 1525r uitgevoerd om de afwezigheid van remming van PCR ‘ s door contaminanten te controleren.

3 Resultaten

3.1 SRB detectie en telling

bij gezonde personen en volgens de bovenstaande criteria werd SRB gevonden in 10 feces (24%) met zowel Test-kit Labège® als Postgate ‘ s medium. Bij patiënten van de afdeling Hepato-Gastro-enterologie werd SRB gekweekt uit 42 feces met behulp van Postgate ‘ s medium. Drie extra monsters werden positief bevonden met de Test-kit Labège®. Van de 110 onderzochte patiënten werd SRB dus bij 45 patiënten (41%) door kweek gedetecteerd. Drie extra monsters gaven twijfelachtige resultaten met de testkit Labège® (aanwezigheid van een donkerbruine neerslag). De gemiddelde detectietijden voor de groei van SRB waren respectievelijk 2 en 6 dagen met de testkit Labège® (bereik 1-11 dagen) en Postgate ‘ s medium (bereik 3-39 dagen). De gemiddelde telling van SRB in de ontlasting van gezonde individuen en patiënten was 105 g-1 (range 102-109 g−1). Het aantal SRB ‘ s was dus niet gerelateerd aan de klinische status van patiënten.

3.2 SRB identificatie met multiplex PCR

de gevoeligheid van de multiplex PCR assay was 100 bacteriën per ml. De specificiteit ervan werd vastgesteld door de afwezigheid van kruisreacties tussen de vier genospecies gedifferentieerd. Elke positieve controle werd alleen positief bevonden met de bijbehorende set primers. Alle stammen die als negatieve controle werden gebruikt om de specificiteit te controleren, inclusief de typestammen van D. gigas en D. vulgaris, gaven negatieve resultaten met de vier primersets. De specificiteit van de reacties werd verder bevestigd door de versterkte producten te rangschikken. De verkregen sequenties kwamen altijd overeen met de verwachte sequenties. Voor SRB-negatieve monsters door PCR, 16S rDNA amplificatie toegestaan om de mogelijkheid van een remming van de PCR ‘ s door contaminanten te verwerpen.

bij patiënten van de Hepato-Gastro-enterologie eenheid gaven de 45 positieve en de drie dubbelzinnige feces positieve resultaten door PCR. Ze kwamen overeen met D. piger (n = 33), D. fairfieldensis (n=14) of beide (n=1). Er werd geen D. desulfuricans aangetoond (Tabel 3). De kweek-negatieve kolven waren ook negatief door PCR.

3.Relatie van Desulfovibrio species met IBD

de verspreiding van de species verschilde niet significant bij vergelijking van gezonde individuen en patiënten met niet-inflammatoire darmziekten. D. piger kwam nauwelijks meer voor dan D. fairfieldensis. Omgekeerd kwam D. piger bij patiënten met IBD 4 keer vaker voor dan D. fairfieldensis. Dit verschil was vooral merkbaar voor CD aangezien IBD-patiënten voornamelijk uit CD-patiënten bestonden. Bovendien is de prevalentie van D. piger was significant hoger bij patiënten die werden opgenomen voor IBD in vergelijking met gezonde personen of patiënten die werden opgenomen voor andere pathologieën (P<0,05). Er was geen verband tussen het stadium van de ziekte en de aanwezigheid van SRB. De therapie had geen invloed op de isolatiesnelheid van deze bacteriën.

4 discussie

de aanwezigheid van SRB in het darmkanaal van dieren en mensen is al lange tijd erkend, hoewel er zelden identificaties op soortniveau zijn uitgevoerd. Onze resultaten bevestigen dat deze bacteriën gemeenschappelijke bewoners van het darmkanaal van de mens zijn. De meeste studies van intestinale SRB van IBD patiënten zijn gebaseerd op kweken-gebaseerde microbiologische analyse van fecale monsters, en hebben daarom SRB geïdentificeerd op het genus niveau . Nochtans, hebben recente studies gesuggereerd dat de mogelijke rol van SRB in de pathogenese van IBD met fysiologische en/of fylogenetic verschillen tussen spanningen van SRB kan worden gerelateerd . Aldus, bedachten wij een multiplex PCR om deze bacteriën op speciesenniveau te identificeren. Gezien de moeilijkheid van isolatie en de zeldzaamheid van specifieke zoekopdrachten, wordt de prevalentie van SRB in menselijke klinische monsters zeker onderschat. De testkit Labège®, ontwikkeld voor de detectie van SRB uit milieumonsters, bleek een geschikt medium te zijn voor de detectie van SRB uit uitwerpselen en uit lichaamsvloeistoffen (Loubinoux, niet gepubliceerd resultaat). Het is door de fabrikant getoond om milieustammen van SRB zoals D. desulfuricans DSM 1926, Desulfotomaculum nigrificans DSM 574T, Desulfobacter postgatei DSM 2034T en Desulfobulbus propionicus DSM 2032T te kweken. In onze handen bleek het gevoeliger te zijn dan het gebruikelijke Postgate-medium, aangezien zes extra isolaten Desulfovibrio werden gedetecteerd bij patiënten. Ondanks de overvloedige begeleidende flora, liet de testkit Labège® een snelle groei van de SRB van ontlastingsmonsters toe, aangezien de gemiddelde detectietijd 2 dagen was (versus 6 dagen in het medium van Postgate). Dit kan verband houden met de kwaliteit van het medium, maar ook met de wijze van inoculatie van monsters die het behoud van strikte anaerobiose garandeert. In vergelijking met het medium van Postgate breidt de toevoeging van acetaat aan lactaat het detectiespectrum uit tot langzaam groeiende acetaatmetaboliserende SRB zoals Desulfobacter spp. Bovendien maakt de aanwezigheid van titaniumcitraat, dat een zeer efficiënt reductiemiddel is (het redoxpotentieel van Test-kit Labège® is ongeveer -600 mV), een snellere detectie van de meeste stammen van SRB mogelijk.

Het is mogelijk dat sommige SRB-stammen niet door de testkits Labège® werden gedetecteerd, omdat zij door de begeleidende flora of door een gering aantal monsters waren overwoekerd. De testkit Labège® is echter aangepast aan de groei van de meeste SRB, en alle positieve kolven werden door PCR geïdentificeerd als D. piger, D. fairfieldensis of D. desulfuricans. Ondanks de incubatietijd van 2 maanden werden geen extra soorten vastgesteld. Het is dus mogelijk dat onze bevindingen overeenkomen met de echte menselijke flora die vrijwel uitsluitend bestaat uit D. piger en D. fairfieldensis. D. desulfuricans werd ooit geïsoleerd en is ook beschreven in mensen in een eerdere studie, maar het is waarschijnlijk ongewoon in het darmkanaal. In de meeste gevallen, D. piger en D. fairfieldensis sluiten elkaar uit. Een associatie van beide soorten werd slechts één keer waargenomen in een geval van darmkanker. Om het bijna niet-overlappende voorkomen van D. piger en D. fairfieldensis te bevestigen, zijn voor elke positieve testkit Labège®vijf kolonies SRB die in het medium van vaste Postgate zijn gekweekt, geïdentificeerd met PCR. In elk geval werd hetzelfde resultaat verkregen en behoorden de vijf kolonies tot dezelfde soort (gegevens niet weergegeven). We hebben ook een follow-up gemaakt van 10 patiënten (vijf SRB-positief en vijf SRB-negatief) gedurende 2 maanden en de ontlasting werd elke week gekweekt. Voor elke patiënt werd hetzelfde resultaat (SRB-positief of SRB-negatief) verkregen met alle monsters (gegevens niet getoond). Het zou echter interessant zijn om de patiënten met IBD over een langere periode te volgen om te bepalen of de activiteit van de ziekte gevolgen heeft voor de populatie SRB.

D. desulfuricans wordt vaak geïsoleerd uit de omgeving, en wordt ook beschouwd als de meest voorkomende Desulfovibrio-soort bij mensen tot de recente beschrijving van D. fairfieldensis. Men kan dus verbaasd zijn over het zeer lage voorkomen van D. desulfuricans in onze bevolking. Tot nu toe zijn D. piger en D. fairfieldensis alleen geïsoleerd uit menselijke monsters. Zo tonen onze resultaten aan dat beide soorten specifiek kunnen zijn voor het menselijke darmkanaal. Dit moet echter nog worden bepaald door de specifieke zoektocht naar deze bacteriën in andere ecologische niches. D. piger is slechts één keer beschreven, en werd beschouwd als een ongewone bevinding bij de mens. Onze resultaten geven aan dat het de meest voorkomende SRB in het darmkanaal kan zijn. Deze soort is echter nooit beschreven in infectieuze processen. Integendeel, D. fairfieldensis, blijkbaar minder gebruikelijk in menselijke uitwerpselen, is geïsoleerd buiten de dikke darm lumen van bloed en septische collecties . Zo kan D. fairfieldensis aanvullende invasieve eigenschappen bezitten in vergelijking met andere Desulfovibrio-soorten, wat het herstel uit klinische monsters zou verklaren. Interessant is dat in onze reeks patiënten de prevalentie van D. piger in de ontlasting significant hoger is bij patiënten die in het ziekenhuis zijn opgenomen voor IBD (meestal CD) dan bij gezonde personen of bij patiënten die in het ziekenhuis zijn opgenomen voor andere pathologieën. Dit kan twee verklaringen hebben: ofwel D. piger heeft fysiologische kenmerken die het begin van laesies veroorzaken en / of deelnemen aan de bestendiging van chronische ontstekingsprocessen, of kolonisatie door deze soort wordt begunstigd door lokale omstandigheden bij IBD patiënten. De associatie van SRB met IBD is reeds beschreven . D. piger is sinds zijn eerste beschrijving in 1976 niet meer in aanmerking genomen . De bevinding dat deze bacterie, beschouwd als een ‘niet-pathogene’ soort, een veel voorkomende bewoner is van het menselijke darmkanaal en de meest voorkomende soort SRB bij IBD-patiënten is dan ook verrassend. Aanvullende studies moeten worden uitgevoerd om de manier te verduidelijken waarop D. piger betrokken kan zijn bij deze chronische ontstekingsprocessen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Compagnie Française de Géothermie (Orléans, Frankrijk) en door een FCT-subsidie POCTI 36562/ESP / 2000 aan ISP. We zijn dank verschuldigd aan wijlen Dr.Wee Tee (University Of Melbourne, Australia) Voor het leveren van vier soorten van D. fairfieldensis (waaronder stam ATCC 700045) en ook aan Prof. D. Raoult (University Of Marseille, France) voor het leveren van één soort van D. fairfieldensis. We danken D. Meng en A. M. Carpentier (Laboratoire de Bactériologie-Virologie UMR CNRS 7565) voor hun uitstekende technische bijstand, Dr.A. Dao en Prof. B. Fortier voor het verstrekken van uitwerpselen van gezonde individuen evenals de verpleegkundigen van de Hepato-Gastro-enterologie eenheid voor hun vriendelijkheid.