The role of Wolbachia bacteria in reproductive onverenigbaarheden and hybrid zones of Diabrotica kevers and Gryllus crickets

RESULTS AND DISCUSSION

Diabrotica is een nieuw Wereldgeslacht van chrysomelide kevers dat voornamelijk Neotropisch is in zijn verspreiding en waarvan de oorsprong waarschijnlijk ligt in de regio van Centraal of Tropisch Zuid-Amerika (28). Vandaag omvat het gebied het grootste deel van de Verenigde Staten ten oosten van de Rockies en ten noorden van de 35e breedtegraad, De Staten van Mexico ten noordwesten van Durango (met uitzondering van Baja, CA), zuidelijke gebieden van Ontario, Canada, en een recente introductie in Oost-Europa (29). De distributie van D. v. zeae omvat een gebied van Guatemala door Centraal Mexico in de panhandle van Texas en delen van Zuid-Oklahoma (28). De uitgebreide maïsproductie kan ook de verplaatsing van D. v. zeae vanuit Mexico naar het noorden hebben vergemakkelijkt, wat heeft geleid tot een gebied van secundair contact met D. v. virgifera in het noorden van Texas, waar de ondersoort kruist (13).

volwassenen van D. v. zeae uit Stephenville en Uvalde in het zuiden van Texas waren niet geïnfecteerd met Wolbachia, terwijl volwassenen van D. V. virgifera uit 15 locaties in de Verenigde Staten en Canadese distributie van D. V. virgifera positief testten op Wolbachia, met uitzondering van twee locaties in Duncan en Willcox, AZ. Eenentwintig volwassenen van drie locaties in de North Texas hybrid zone testten ook positief, waaronder vijf exemplaren met indexpatronen binnen het variatiebereik van D. v. zeae (J. Krysan persoonlijke communicatie). Sequenties van het ftsZ-gen van Wolbachia van afzonderlijke individuen uit Urbana, IL, Moriarty, NM en Blacksburg, VA, waren identiek. Bovendien Wees de vertering met DraI van het FtsZ-fragment verkregen met I) Algemene B-specifieke primers, ii) ftsZf1 en iii) ftsZr1 erop dat populaties van D. v. virgifera uit alle bemonsterde locaties dezelfde Wolbachia-stam dragen. Een fylogenetische analyse met behulp van het 16S rRNA gen plaatste deze stam in een basale positie met een onopgeloste relatie met andere Wolbachia stammen (resultaten niet getoond). Het ftsZ-gen (23, 30) identificeerde ook de Wolbachia uit D. v. virgifera als een basale stam en onderscheidt zich van de meeste andere stammen in de A-groep (Fig. 1). Gezien de consistentie van infectie en stamtype door de verspreiding van D. v. virgifera, evenals de snelle verspreiding van deze soort in Noord-Amerika, suggereren we dat de infectie plaatsvond in het zuidwesten van de Verenigde Staten of Noordwest Mexico voor de oostelijke uitbreiding van D. v. virgifera in de Verenigde Staten en Canada. De niet-geïnfecteerde D. v. virgifera populaties in het zuiden van Arizona kunnen de restanten zijn van de oorspronkelijke niet-geïnfecteerde populatie of kunnen geïsoleerde populaties vertegenwoordigen die de infectie hebben verloren.

D. V. virgifera en D. v. zeae lijken morfologisch sterk op elkaar (13), met uitzondering van zwarte dekschilden maculatie die onderscheidend is bij D. v. virgifera en beperkt is tot het opperarmbeen of afwezig is bij D. v. zeae. De ondersoorten zijn niet ecologisch geïsoleerd omdat ze beide op maïs voorkomen, noch tijdelijk geïsoleerd omdat ze hetzelfde diapauzemechanisme hebben. Gedragsstudies wijzen niet op premature belemmeringen voor de voortplanting, omdat beide ondersoorten reageren op feromoon van hetzelfde geslacht en er geen onderscheid werd gemaakt tijdens paringskeuze experimenten (13). Bij kruising waren de twee ondersoorten vruchtbaar in één richting, dat wil zeggen dat D. v. zeae mannetjes uit Centraal Mexico gepaard gingen met D. v. virgifera vrouwtjes uit South Dakota terwijl de wederkerige kruising zeer weinig tot geen levensvatbare nakomelingen voortbracht (14). Om te testen of de unidirectionele incompatibiliteit wordt veroorzaakt door de Wolbachia-infectie die is vastgesteld in D. v. virgifera, we hebben reciproke kruisen gemaakt van geïnfecteerde en tetracycline-behandelde D. v. virgifera. De resultaten wijzen erop dat de stam van Wolbachia die D. v. virgifera infecteert ernstige cytoplasmatische incompatibiliteit kan veroorzaken, waarbij slechts 0,4% van de 5627 eieren uitkomen wanneer geïnfecteerde D. v. virgifera-mannetjes gekruist werden met met tetracycline behandelde niet-geïnfecteerde D. V. virgifera-vrouwtjes (Tabel 1, Kruis d).

Wij hebben ook een laboratorium kolonie van D. v. zeae met specimens van Stephenville, TX, en bevestigd, dat D. v. zeae vrouwtjes gekruist met D. v. virgifera mannetjes produceren zeer weinig tot geen nakomelingen overwegende dat de wederzijdse kruis resulteert in een normaal ei uitkomen (Tabel 1, kruisen f en h) (14). Toen we de kruisingen herhaalden met met tetracycline behandelde D. v. virgifera mannetjes, bestond de onverenigbaarheid niet meer, en werden de aantallen eieren waargenomen die niet significant verschilden van de controles (Tabel 1, Kruis g), wat bevestigt dat de unidirectionele paringscompatibiliteit tussen deze twee ondersoorten wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van Wolbachia in D. V. virgifera.

vergelijkbare reproductieve onverenigbaarheden zijn ook gemeld tussen sommige leden van het geslacht Gryllus in Noord-Amerika. Het geslacht Gryllus is verspreid over het grootste deel van de wereld met uitzondering van oost-Azië en de Stille Oceaan (31). Op basis van aantallen soorten is het mogelijk dat het geslacht is ontstaan in de nieuwe wereld of Afrika, waar verschillende geslachten zijn waargenomen die lijken op Gryllus (32). In Noord-Amerika heeft het geslacht Gryllus verschillende nauw verwante soorten, waarvan sommige moeilijk te onderscheiden zijn op basis van morfologische kenmerken alleen. Aan het begin van de eeuw werd deze groep beschouwd als een enkele soort met een hoge mate van variabiliteit (33). Latere werken, voornamelijk met behulp van roepliederen, discrimineerden onder sommige soorten (34).

verschillende soorten van het geslacht Gryllus zijn unidirectioneel of bidirectioneel onverenigbaar gebleken. De unidirectionele incompatibiliteit tussen G. pennsylvanicus mannetjes en G. firmus vrouwtjes in het oosten van de Verenigde Staten (19) weerspiegelt die van D. v. virgifera en D. v. zeae. We hebben ontdekt dat, met uitzondering van G. firmus, specimens van alle Gryllus-soorten die we hebben bestudeerd, meestal besmet zijn met Wolbachia, soms met meer dan één stam (Fig. 2 en 3). De gerapporteerde onverenigbaarheden tussen de verschillende soorten in dit geslacht kunnen worden verklaard door infectie met deze bacterie. Onze studie heeft de volgende patronen van infectie aangetoond. Populaties van G. integer bemonsterd uit Humboldt County, NV, en Wayne County, UT, zijn geïnfecteerd met dezelfde stam van Wolbachia bacteriën, die wij verwijzen naar als de “integer type.”De populatie die werd bemonsterd in Davis, CA, was ook besmet met het integer type, met uitzondering van één individu dat dezelfde stam van Wolbachia had als gevonden in G. rubens, die we het rubens type noemen.”De populatie bemonsterd in Las Cruces, NM, had twee individuen die besmet waren met de Rubens-Type Wolbachia stam en drie individuen die dubbel besmet waren met de rubens – en integer-type stammen. De G. integer populaties in Austin en Dallas, TX, hadden ook dezelfde bacteriële stam, die, op basis van het 16S rRNA gen en het ftsZ gen, identiek lijkt aan die gevonden in G. rubens Uit Lake Placid en Gainesville, FL. Deze Rubens-stam komt ook voor in specimens van G. ovisopis die uit Gainesville worden bemonsterd. We konden alleen specimens van G. assimilis uit de laboratoriumculturen van T. Walker en T. Zera; de laatste cultuur werd afgeleid van T. Walker ‘ s colony. Individuen uit beide culturen werden geïnfecteerd met dezelfde stam waarvan de sequentie voor het ftsZ-gen identiek was aan de rubens-Type Wolbachia stam. De 16S rRNA genfragmentsequentie geeft aan dat de stam in deze soort een transversie heeft op E. coli positie 380 van een guanine naar een thymine, wat in E. coli overeenkomt met de eerste positie in de tetra lus GCAA. In de stam van het” assimilis-type ” bestaat de lus uit TAAA. Deze transversie wordt niet gevonden in een andere Wolbachia 16S rRNA reeks die tot op heden bekend is.

De populatie van G. pennsylvanicus vertoont een complexer infectiepatroon. Gedurende het grootste deel van de distributie die we hebben bemonsterd, is G. pennsylvanicus polymorf voor infectietype. Een populatie die werd bemonsterd in Lethbridge, Alberta, Canada, toonde de aanwezigheid van een Wolbachia stam die verschilt van die gevonden in G. rubens, G. assimilis, G. integer en G. ovisopis. We noemen deze stam de “pennsylvanicus-type” stam. Van de 39 besmette specimens die uit Centraal Illinois werden bemonsterd, hadden 38 de stam van het pennsylvanicus-type, terwijl één exemplaar de stam van het rubens-type droeg. Een plaats 150 km naar het zuiden, Farina, IL, toonde een mengsel van individuen die besmet waren met ofwel de pennsylvanicus-of rubens-type stam of met beide. Van twee monsters uit Ann Arbor, MI, droeg één de Rubens-type stam, en de andere was dubbel besmet met de pennsylvanicus – en rubens-type stammen. Voor de in Londen, Ontario, Canada bemonsterde populatie, 215 km ten noordoosten van Ann Arbor, van 19 geïnfecteerde individuen, droegen er 10 het pennsylvanicus-type, Een droeg het rubens-type, en acht waren dubbel besmet met de pennsylvanicus – en rubens-type stammen (Fig. 3a). Dit polymorfe patroon zet zich voort in specimens van G. pennsylvanicus verzameld uit Vermont en Pennsylvania. In Virginia en North Carolina, ontdekten we alleen individuen die geïnfecteerd waren met ofwel de pennsylvanicus – of rubens-type stammen. De bevolking van G. pennsylvanicus in Noord-Amerika is een mengsel van individuen die besmet zijn met het rubens-type of pennsylvanicus-type en individuen die dubbel besmet zijn met zowel stammen als individuen die niet besmet zijn (Fig. 3). Onze resultaten tot nu toe wijzen erop dat bij populaties van G. pennsylvanicus in Oost-Noord-Amerika de Rubens-achtige infectie in het noorden vaker voorkomt dan in het zuiden (Fig. 3a). Verder hebben we ontdekt dat in de meeste plaatsen waar beide stammen voorkomen, dubbel geïnfecteerde individuen ook aanwezig zijn (Fig. 2 en 3a).

als gevolg van de” drive ” die gepaard gaat met de verspreiding van een Wolbachia – infectie (35), stellen wij voor dat de genetische structuur van de door ons bemonsterde populaties van G. pennsylvanicus, met uitzondering van Lethbridge, Canada, is beïnvloed door de aanwezigheid van de Rubens-en pennsylvanicus-achtige Wolbachia-stammen. Daarom zullen we de monsters van G. pennsylvanicus die in deze regio ‘ s zijn verzameld, als Gryllus bij (nr.) pennsylvanicus beschouwen om de dubbelzinnigheid van hun taxonomische status weer te geven die wordt opgelegd door de infectietypen die in deze populaties worden aangetroffen.

We hebben monsters genomen van G. firmus uit Gainesville en het Archbold Biologisch Station in Lake Placid, FL, en Uit Fort Fischer, NC. 32 van de 35 monsters uit deze plaatsen waren niet besmet. De drie geïnfecteerde individuen kwamen uit Gainesville, FL. Twee werden gevonden om het rubens-type dragen, en de derde droeg de pennsylvanicus-type Wolbachia stam (vijgen. 2 en 3a). Deze bevinding suggereert dat infectie van deze twee bacteriestammen zich verplaatst naar de populaties van G. firmus, vooral in het licht van het feit dat G. pennsylvanicus niet bekend is uit Gainesville, FL.

analyse van de relaties tussen de verschillende stammen die we hebben onderzocht van Wolbachia bij de Gryllus species met behulp van het FtsZ – gen geeft aan dat de integer-en rubens-stammen een monofyletische groep vormen en niet nauw verwant zijn aan de stam van het pennsylvanicus-type, die basaal is voor alle andere Wolbachia-stammen van de B-groep die tot nu toe bekend zijn. De stam van Wolbachia gerapporteerd door Werren et al. (23) in G. pennsylvanicus is van het rubens-type (Fig. 2).

We stellen voor dat de infecties bij de bovengenoemde leden van het geslacht Gryllus een verklaring bieden voor de waargenomen paringscompatibiliteit die is verkregen door Smith en Cade (17), Cade en Tyshenko (18) en Harrison (19) en wijzen op een mogelijke rol van Wolbachia in de soortvorming van sommige leden van dit geslacht. De bidirectionele onverenigbaarheid waargenomen tussen G. rubens en G. integer is waarschijnlijk het gevolg van infectie met de twee verschillende stammen van Wolbachia gevonden in deze twee soorten. De compatibiliteit van G. rubens uit Florida met G. integer uit Texas (17, 18) kan worden verklaard omdat deze populaties de Rubens-achtige bacteriën dragen. Onze gegevens ondersteunen de conclusie van Smith en Cade (17) dat G. rubens en G. integer uit Texas dezelfde soort kunnen zijn, ondanks verschillen in hun liederen van een graad die gewoonlijk wordt gebruikt om soorten te onderscheiden.

aangezien G. pennsylvanicus besmet is met Wolbachia en G. firmus gewoonlijk niet, kunnen kruisingen waaruit blijkt dat G. pennsylvanicus mannetjes onverenigbaar zijn met G. firmus vrouwtjes (19) worden geïnterpreteerd als het gevolg van cytoplasmatische onverenigbaarheid veroorzaakt door Wolbachia. Onze interpretatie wordt verder onderbouwd door het mitochondriale patroon dat in deze twee populaties is waargenomen, namelijk dat G. firmus en G. pennsylvanicus verschillende mitochondriale typen hebben waardoor deze twee populaties zijn geïdentificeerd; hoewel G. pennsylvanicus mtDNA echter gemakkelijk introgresseert in de populatie van G. firmus, komt het omgekeerde niet voor (36). Dit patroon zou worden waargenomen als G. pennsylvanicus besmet is met Wolbachia omdat de meerderheid van de individuen in de hybride zone het gevolg zou zijn van nageslacht van besmette wijfjes, die in dit geval de G. zouden dragen. pennsylvanicus mitochondriale type samen met de maternaal geërfde Wolbachia-infectie.

de unidirectionele onverenigbaarheid tussen G. ovisopis mannetjes, die de Rubens-type bacteriën dragen, en G. firmus vrouwtjes (T. Walker, persoonlijke communicatie) kan ook worden geïnterpreteerd in het licht van deze infectie. Het ontbreken van nakomelingen uit kruisingen tussen mannetjes van G. pennsylvanicus en G. ovisopis met vrouwtjes van G. firmus wijst erop dat deze twee stammen incompatibiliteit kunnen veroorzaken. We weten dat G. ovisopis en G. rubens dragen dezelfde Wolbachia stam, dus de waarschijnlijke oorzaak van de bidirectionele incompatibiliteit waargenomen tussen G. rubens en G. pennsylvanicus is de verschillende Wolbachia stammen die ze kunnen herbergen.

met behulp van het ftsZ – gen werden 39 bp-verschillen waargenomen tussen de stammen van het pennsylvanicus – en rubens-Type, 41 verschillen tussen de stammen van het pennsylvanicus – en het gehele type en 22 verschillen tussen de stammen van het rubens-en het gehele type. Ter vergelijking, in hetzelfde gensegment, is er slechts één basisverandering tussen de bidirectioneel onverenigbare Wolbachia stammen gevonden in Drosophila simulans Hawaii en D. simulans Riverside (23). Op basis van dit bewijs en van de incompatibiliteit die is waargenomen bij de paringen tussen de respectievelijke Gryllus-soorten, voorspellen we dat de stammen van het rubens -, integer-en pennsylvanicus-type bidirectioneel onverenigbaar zijn.

De hybride zone tussen G. pennsylvanicus en G. firmus, aangeduid door Harrison en Arnold (20), is complexer dan een soort–soort interactie. Sommige van de locaties die we hebben bemonsterd langs de Blue Ridge en de Appalachen tonen een fragmentarische verspreiding van infectietypen binnen de populaties van G. pennsylvanicus (Fig. 3a). In dit gebied kunnen dus mogelijke interacties optreden tussen populaties van niet – geïnfecteerde G. firmus, G. nr. pennsylvanicus geïnfecteerd met rubens-of pennsylvanicus – Type Wolbachia en G. nr pennsylvanicus geïnfecteerd met zowel rubens-als pennsylvanicus-Type Wolbachia stammen. De Wolbachia-infectie bij de Gryllus-soorten vermeld en specifiek de meervoudige infectietypes die in de G. nr. pennsylvanicus-populatie geeft aan dat beperking van de genstroom binnen een populatie kan optreden als gevolg van verschillen in infectietype. Het reproductieve succes van individuen in deze populaties zal afhangen van hun infectieprofiel evenals dat van de individuen waarmee ze paren. Ons concept van wat een soort in het geslacht Gryllus vormt moet opnieuw worden geëvalueerd in het licht van de Wolbachia-infecties die ze Herbergen.

infecties met Wolbachia kunnen zich door een populatie verspreiden als gevolg van het voordeel dat geïnfecteerde wijfjes hebben ten opzichte van niet-geïnfecteerde wijfjes (35). Gezien die G. van pennsylvanicus en G. firmus is aangetoond dat zij in het laboratorium hybridiseren (19) en dat er aanwijzingen zijn voor hybridisatie in het veld (21), kan de huidige verspreiding van G. firmus worden geïnterpreteerd als een relict, afkomstig uit een groter gebied waar een opmars van een besmette populatie doorheen is gegaan. Een alternatieve verklaring zou kunnen zijn meerdere infectieplaatsen met dezelfde Wolbachia stam, maar we hebben geen informatie over hoe Wolbachia bacteriën horizontaal worden overgedragen over soorten of de frequentie waarmee ze worden verkregen. Daarom kiezen we voor de meest spaarzame verklaring, dat de infectie ontstaan op één locatie en vervolgens verspreid. Inderdaad, onze gegevens suggereren dat de Wolbachia infecties een geografische component hebben en dat het rubens-type is ontstaan in het zuiden waar het overheerst (Fig . 3a). In de populatie van G. nr. pennsylvanicus in Oost-Noord-Amerika komt de rubens-achtige infectie echter voor in populaties die in het noorden werden bemonsterd. Deze plaatsen zijn het verst verwijderd van de populaties van Gryllus die uniform besmet zijn met de Rubens-stam en ver verwijderd van enige gerapporteerde G. Rubens populaties (Fig. 3 a en b). We stellen voor dat de rubens-achtige infectie zich bewoog door de populatie van Gryllus die bestond in Oost-Noord-Amerika voor de oostwaartse beweging van de pennsylvanicus-achtige stam.

in de grylluspopulaties kunnen dubbel geïnfecteerde individuen het resultaat zijn van selectiedruk in een populatie waarin twee bacteriestammen bestaan die bidirectioneel onverenigbaar zijn (Fig. 2 en 3a). In een dergelijke omstandigheid, individuen die dubbel besmet zou worden geselecteerd voor omdat, als beide infecties kunnen overleven in een cricket, de vrouwtjes compatibel zou zijn met mannen die ofwel bacteriële stam. Een derde infectieuze sweep van dubbel geïnfecteerde individuen zou dan kunnen volgen door de populatie omdat dubbel geïnfecteerde vrouwtjes een voordeel hebben ten opzichte van enkelvoudig geïnfecteerde vrouwtjes, die zich alleen succesvol konden voortplanten met mannetjes die met dezelfde Wolbachia-stam besmet waren. Er zijn meerdere infecties gemeld van verschillende insectentaxa (37-39), en dubbel geïnfecteerde mannetjes zijn gedeeltelijk of volledig onverenigbaar met afzonderlijk geïnfecteerde vrouwtjes bij andere insecten (37-41). We voorspellen dat dubbele infecties kunnen optreden op plaatsen waar enkelvoudige infecties met twee bidirectioneel onverenigbare stammen van Wolbachia voorkomen in dezelfde of zeer nauw verwante taxa.

in een scherm van gematigde insectentaxa met behulp van PCR met specifieke 16S rRNA primers, vonden we dat 16% van de 615 insectentaxa, uit een grote verscheidenheid aan families en orden, besmet was met Wolbachia (R. G. en H. M. R., ongepubliceerde gegevens), en vergelijkbare infectiepercentages werden verkregen voor tropische insecten (42). Gezien deze frequentie van infectie, voorspellen we dat andere insecten hybride zones zal worden gevonden om te worden bepaald op zijn minst gedeeltelijk door Wolbachia infectie en cytoplasmische incompatibiliteit. Sommige geslachten van insecten kunnen meer vatbaar zijn voor infectie met Wolbachia als gevolg van hun natuurlijke geschiedenis. Soortvorming binnen deze groepen moet worden onderzocht met betrekking tot de rol die Wolbachia speelt.