- Abstract
- 1.
- 2. Methoden
- 2.1. Materialen
- 2.2. Konijnen en Weefselpreparaat
- 2.3. Histologische beoordeling van kraakbeen
- 2.4. TUNEL Assay
- 2.5. Fluorescerend kwantitatief PCR
- 2.6. Statistische analyse
- 3. Resultaten
- 3.1. ACLT-geïnduceerde histologische degeneratie bij konijnen werd verminderd door DHJST
- 3.2. DHJST remde kraakbeencellen apoptose
- 3.3. Remming van VEGF-en HIF-1α-expressie in kraakbeencellen wordt geassocieerd met DHJST oefent therapeutisch Effect uit
- 4. Discussie
- 5. Conclusies
- financiering
Abstract
Du-Huo-Ji-Sheng-Tang (DHJST) is een traditioneel Chinees kruidengeneesmiddel dat wordt gebruikt voor de behandeling van artrose. In deze studie werd het therapeutische effect van DHJST op de afbraak van kraakbeen onderzocht in een konijnenmodel van artrose. In de kniegewrichten van konijnen werd anterior cruciate ligament transection (ACLT) uitgevoerd om experimentele osteoartritis te induceren. Aan het einde van de zesde week werden 30 konijnen met ACLT verdeeld in zes groepen, controlegroep, DHJST-groep en Osaminethacine (OSA) groep, die nog eens 4 weken werden gevolgd. De andere drie groepen konijnen met ACLT werden onbehandeld met DHJST of OSA, die na 6 weken werden gedood en dienden als 6-weken tijdpunt controles. De resultaten toonden aan dat er aan het einde van de zesde week na de operatie een significante histologische degeneratie was in de controlegroep in vergelijking met de normale groep. In de controlegroep was de gemiddelde score voor histologische degeneratie verdere verhogingen na 10e week, en er was een significant lagere gemiddelde score voor histologische degeneratie in de DHJST-groep in vergelijking met de controlegroep. Om het potentiële mechanisme te onderzoeken, werd het expressieniveau van VEGF en HIF-1α gedetecteerd. De expressie van VEGF mRNA en HIF-1α mRNA is laag in de normale groep, terwijl de activiteiten geleidelijk toenemen in de controlegroep. In vergelijking met die van dezelfde tijdpuntmodel-groep nam de activiteit van VEGF en HIF-1α echter significant af in de DHJST-groep. Kortom, DHJST heeft een significant therapeutisch effect op osteoartritis konijnen en mechanismen worden geassocieerd met remming van VEGF en HIF-1α expressie.
1.
osteoartritis (OA) is een progressieve en slopende ziekte die jaren kan duren om zich klinisch te manifesteren bij getroffen personen. Kraakbeen veroudering en chondrocyte senescentie spelen een belangrijke rol in de pathogenese en ontwikkeling van OA. Tijdens de ontwikkeling van OA, is er vaak een brandpuntsverhoging van celdood. Veel rapporten toonden aan dat chondrocyten senescentie bijdraagt aan het risico van kraakbeendegeneratie door het verminderen van het vermogen van chondrocyten om het gewrichtskraakbeenweefsel te onderhouden en te herstellen . Aangezien het wordt getheoretiseerd dat elke chondrocyte verantwoordelijk is voor het onderhoud van de extracellulaire matrijs die het omringt, en dat matrijsmolecules in één gebied van het weefsel worden geproduceerd een zeer beperkte capaciteit hebben om het weefsel te doorkruisen, zou het brandpuntsverlies van levensvatbare cellen gedeeltelijk verantwoordelijk kunnen zijn voor het weefsel onvermogen om kleine schade te herstellen .
momenteel is er geen genezing voor OA en de beschikbare behandelingen vertragen alleen de progressie van de ziekte . Voor de laatste 20 jaar, heeft de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) significante vooruitgang tegen OA gezien, zoals in het verbeteren van de klinische bevindingen van patiënten, het remmen van ontstekingsreactie en kraakbeendegeneratie . In vivo en in vitro onderzoek toonde ook aan dat Chinese kruidenformule meerdere uitgebreide acties tegen OA heeft . Du-Huo-Ji-Sheng-Tang, die bestaat uit Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi en Poria, is veel gebruikt voor de behandeling van OA. Het kan klinische symptomen, kniefunctie en levenskwaliteit voor patiënten verbeteren . Op basis van onze kennis over oa pathogenese in TCM, hebben we het effect van DHJST op het voorkomen van kraakbeendegeneratie van OA bij konijnen onderzocht en de mechanismen ervan geobserveerd.
2. Methoden
2.1. Materialen
het doodlopende colorimetrische apoptosedetectiesysteem (TUNEL assay) werd verkregen van Nanjing Jiancheng Biotech Company (China). Trizol total RNA extraction kit, DNA molecular marker, SYBR Premix EX TaqTM en Perfect Real Time kit werden gekocht bij Invitrogen Co. (VERENIGDE). Kruiden in DJST (samengesteld uit Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi en Poria, geleverd door Shanghai Huayu Chinese Herbs Co. Ltd., China) werden geaccrediteerd door een farmacognosist volgens standaardprotocollen, opgesteld door Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, de componenten werden gemengd in volgorde van de verhouding van 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 (drooggewicht), werden de geneesmiddelen geëxtraheerd met standaardmethoden volgens Chinese Farmacopee (China Pharmacopoeia and Committee, 2000). Deze ruwe drugs werden gedrenkt in gedestilleerd water en gekookt gedurende 30 min tweemaal, en de drugoplossing werd gefilterd door een gaas, dan werd het filtraat geconcentreerd tot 4 g mL−1 door een vacuümpomp en vervolgens opgeslagen bij -20°C tot gebruik. Osaminethacine (OSA), elke tablet bevat 25 mg indomethacine en 75 mg aminoglucose (geleverd door Hebei Jizhong Pharmaceutical Co. Ltd., China), werd gebruikt als positieve controle geneeskunde.
2.2. Konijnen en Weefselpreparaat
achtenveertig maanden oude Nieuw-Zeelandse witte konijnen werden door het proefdiercentrum geleverd aan de Chinese Academie van Wetenschappen. Dertig konijnen ondergingen unilaterale anterior cruciate ligament transection (ACLT) onder algemene anesthesie. De normale konijnen ondergingen geen ingreep.
aan het einde van de zesde week werden de 30 konijnen met ACLT verdeeld in zes groepen, controlegroep, DHJST-groep en OSA-groep, die nog eens 4 weken werden gevolgd. De andere drie groepen konijnen met ACLT werden onbehandeld met DHJST of OSA, die na 6 weken werden gedood en dienden als 6-weken tijdpunt controles. De afkooksels werden oraal toegediend in dosering 0.923 g (kg−1·d−1) gedurende 4 weken kregen konijnen in de OSA−groep OSA 0,09 g (kg−1·d-1) toegediend gedurende een periode van 4 weken, de model-controlegroep en de normale groep werden oraal toegediend met hetzelfde volume fysiologische zoutoplossing.
konijnen werden gedood voor de bemonstering. Het protocol werd goedgekeurd door het Comité voor dierproeven van het Universitair Medisch Centrum, Shanghai, China. Rabbit tibiae werd verwijderd en tibia articulair kraakbeen werd onmiddellijk bewaard bij -80°C. De tibiae werden zorgvuldig ontleed en verwijderd uit aangrenzende spieren en onmiddellijk gefixeerd in 10% formaline gedurende 24 uur. Tibiae werden vervolgens gedurende 4 weken ontkalkt in 100 g / L ethyleendiamine-tetraazijnzuur, gewassen in PBS, gedehydrateerd door een reeks ethanol en op een gestandaardiseerde manier ingebed in paraffine om de juiste oriëntatie te garanderen. Paraffine weefselsecties (7 µm) werden op een gestandaardiseerde manier gesneden. De secties werden gedeparaffiniseerd voor histochemische analyses.
2.3. Histologische beoordeling van kraakbeen
histologische beoordeling werd uitgevoerd op de femorotibiële gewrichten van konijnen in de DHJST-groep, de OSA-groep en de controlegroep. De secties waren gekleurd met Safranin o-fast green. Deze histologische secties van elke locatie werden geëvalueerd met behulp van een aangepast Mankin-gradingsysteem (Tabel 1) door twee onafhankelijke, door de raad gecertificeerde veterinaire pathologen.
|
2.4. TUNEL Assay
H2O2-geïnduceerde apoptose werd gedetecteerd door de terminale deoxynucleotidedyltransferase-gemedieerde dUTP nick end-labeling (TUNEL) assay uit te voeren met behulp van een Apo-DirectTM Kit (CalBiochem, San Diego, CA). TUNEL werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Kort, na pretreatments en blootstelling aan H2O2, werden de cellen geoogst, gewassen, vast, permeabilized en geëtiketteerd voor de bundelbreuken van DNA, dan geanalyseerd op de cytometer van de de Elite stroom van de Coulterdipics (Beckman-Coulter, Miami, de V. S.). Alle tests werden uitgevoerd in drievoud.
2.5. Fluorescerend kwantitatief PCR
totaal RNA werd geëxtraheerd uit 50 mg kraakbeen in tibiae articulair met behulp van Trizol-reagens. De synthese van cDNA werd uitgevoerd met behulp van 4 µg totaal RNA per monster met willekeurige primers en reagentia in de cDNA-synthesekit voor de eerste streng van de Revert Aid. Twee microliter (2 µL) van elk monster werd gebruikt voor real-time PCR in een Rotor-Gen 2000-systeem (Australië). Relatieve kwantificering werd berekend met behulp van delta cycle threshold () relatieve kwantificering. De drempelcyclus () voor de endogene controle CAPDH mRNA en de doelsignalen werden bepaald, en de relatieve RNA-kwantificering werd berekend met behulp van een vergelijkende methode waarbij
sequenties van primers die worden gebruikt voor vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) zijn: 5′-tgcccaccgaggagttca-3(forward) en 5′-GGCCCTGGTGAGGTTGAT-3(reverse) (productlengte: 75 bp).Sequenties van primers die worden gebruikt voor hypoxie-induceerbare factor – 1α(HIF-1α) zijn: 5′-CAGTGCAAAAGACAGGGAAG-3(vooruit) en 5′-CCCTGTATGGTGGTGATGTTGT-3 (achteruit) (productlengte: 107 bp).Sequenties van primers gebruikt voor GAPDH zijn: 5′-CCGAGGGCCCACTAAAGG-3(vooruit) en 5 ‘ -GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3(achteruit) (productlengte: 88 bp).
2.6. Statistische analyse
alle resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde en standaardafwijking (SD). De meetgegevens werden geanalyseerd met behulp van een eenrichtingsanalyse van varianties (ANOVA, SPSS 11.0). Rank data werden geanalyseerd met ridit. Het resultaat van P < .05 werd als statistisch significant beschouwd.
3. Resultaten
3.1. ACLT-geïnduceerde histologische degeneratie bij konijnen werd verminderd door DHJST
representatieve histologische secties zijn weergegeven in Figuur 1. Aan het einde van de 10e week hebben we een normale integriteit van het gewrichtsoppervlak in de normale groep waargenomen (figuur 1(a)). In de controlegroep, met verhoogde degeneratie, was er een verlies van Safranine o-fast green kleuring gepaard gaande gespleten vorming die zich uitstrekte tot in de Midden-en diepe zones (figuur 1(b)), en in de DHJST-groep was er verloren gegaan met vroege lichte fibrillatie, en een verlies van Safranine o-fast green kleuring werd waargenomen samen met chondrocyten clustering (figuur 1(c)). OSA groep, met verlies van Safranine o-fast green kleuring deze veranderingen waren vergelijkbaar met DHJST groep(figuur 1 (d)). Aan het einde van de zesde week na de operatie waren er significante histologische verschillen in de controlegroep in vergelijking met de normale groep (P < .01). In de controlegroep was de gemiddelde score voor Safranine o-fast green kleuring verdere toenames op de 10e week in vergelijking met die op de 6e week (P < .01) (Figuur 2 (a)). In het 10e weekend waren er significante verschillen in Mankin-score tussen de controlegroep en de DHJST-groep; er was een significant lagere gemiddelde score voor Safranine o-fast green kleuring in de DHJST-groep in vergelijking met de controlegroep (P < .01) (Figuur 2 (b)), en geen statistisch significante verschillen in de Mankin-score tussen DHJST-groep en OSA-groep (P >.05).
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. De resultaten werden gepresenteerd als gemiddelden ± SD (n = 5 per groep) in elke kolom. * P < .Vergeleken met de osteoartritis controlegroep in de 6e week, **P < .01, vergeleken met die in de osteoartritis controlegroep.
3.2. DHJST remde kraakbeencellen apoptose
aan het einde van de zesde week na de operatie waren de index van apoptose-cellen in de controlegroep in vergelijking met die in de normale groep significant verschillen (P < .01). In de controlegroep was de index van apoptosecel nog steeds sterk verhoogd (van gemiddelde ± SD 0,35 ± 0,13 in de zesde week tot 0,62 ± 0,10 in de tiende week; P < .01) (Figuur 2 (c)). Aan het einde van de 10e week neemt, vergeleken met de DHJST-groep, de index van apoptosecel Opmerkelijk toe in de controlegroep (P < .01) (Figuur 2 (d)). Er waren geen significante verschillen in apoptose cell index tussen OSA groep en DHJST groep (P >.05).
3.3. Remming van VEGF-en HIF-1α-expressie in kraakbeencellen wordt geassocieerd met DHJST oefent therapeutisch Effect uit
Fluorescerende kwantitatieve PCR gaf aan dat de expressie van VEGF-mRNA en HIF-1α-mRNA laag is in de normale groep; terwijl de activiteiten in de controlegroep geleidelijk en significant toenemen in vergelijking met die van de normale groep (P < .01); in de controlegroep begint HIF-1α in articulaire chondrocyten te stijgen in de zesde week na de operatie, verdere stijgingen in de 10e week in vergelijking met die in de zesde week (gemiddelde ± SD 94,21 ± 20.12 in de zesde week, en 160,35 ± 72,27 in de tiende week; P < .05) (Tabel 2). In het 10e weekend was de expressie van VEGF mRNA en HIF-1α mRNA in de DHJST-groep significant afgenomen in vergelijking met die in de controlegroep na toediening (P < .01). Hoewel de VEGF mRNA-en HIF-1α mRNA-spiegel in de OSA-groep doorgaans met 4 weken OSA-behandeling werd verlaagd in vergelijking met die in de controlegroep, was er geen significant verschil (Tabel 3).
|
waarden als gemiddelden ± SD werden verkregen uit elke groep van 5 Dieren. * P < .5 vergeleken met dieren uit de controlegroep in de zesde week. * * P < .01 vergeleken met de controlegroep dieren op hetzelfde tijdstip controlegroep. |
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||
Values as means ± SD. †P > .05 compared with control group animals. ** P < .01 compared with control group animals. |
4. Discussie
het ACLT-model is een van de meest gebruikte experimentele modellen van OA. Konijn ACLT wordt in toenemende mate gebruikt in OA-studies omdat de ziekte snel begint. Het gebruik van experimentele aclt-modellen is van bijzonder klinisch belang, aangezien de breuk van ACL in mensen voorkomt en ook tot de ontwikkeling van OA leidt. Studie geeft aan dat er een grote hoeveelheid chondrocyten apoptose bestaat tijdens een progressief stadium van OA bij konijnen geïnduceerd door een operatie. Chondrocyte apoptose is een van de karakteristieke veranderingen van OA kraakbeen. Pathologische apoptose onder de voorwaarde van schadelijke stimulatie kan resulteren in de afgifte van chemotaxis of ontstekingsfactoren, die op hun beurt kraakbeenschade verergert en pijn activeert . Daarom kan het remmen van chondrocytapoptosis een belangrijke strategie zijn tegen degeneratieve veranderingen in de kniegewrichten van konijnen. De index van chondrocytenapoptose in DHJST groep vermindert beduidend in vergelijking met dat van in de modelgroep, die voorstelt dat de remming van chondrocyteapoptose één van de belangrijke mechanismen van DHJST tegen degeneratieve veranderingen zou kunnen zijn.
eerdere studies hebben de hypoxische aard van de micro-omgeving van de articulaire chondrocyten aangetoond. Interessant, toonden de osteoarthritic verbindingen verder verminderde zuurstofniveaus, rol van hypoxie tijdens de pathogenese van OA . Een recente studie beschreef dat in articulaire chondrocyten katabole en hypoxische spanning sterke inductoren van de transcriptiefactor HIF-1 zijn, die de belangrijkste Regelgever van cellulaire aanpassing aan lage zuurstofniveaus is. HIF-1 is van cruciaal belang voor overleving en groeistilstand van chondrocyten tijdens kraakbeenontwikkeling evenals energieopwekking en matrixsynthese van chondrocyten in zowel gezond als osteoarthritisch kraakbeen. In osteoarthritisch kraakbeen, zijn de eiwitniveaus van HIF-1 beduidend verhoogd en zijn activiteit correleert met de strengheid van degeneratieve kraakbeenveranderingen . Dit werk documenteert het belang van de transcriptiefactor HIF-1α voor het behoud van de integriteit van hypoxisch gewrichtskraakbeen. De overtollige niveaus van HIF-1α vielen samen met verhoogde apoptose van articulaire chondrocyten en leidden tot degeneratieve veranderingen in de kniegewrichten van konijnen. Na toediening van DHJST neemt de HIF-1α-expressie af, in vergelijking met die van de modelgroep. De resultaten tonen aan dat de werking van DHJST op de regulerende functie van chondrocyten, door remmende activiteit van HIF-1α zou kunnen.
Het is interessant dat het verschil tussen de expressie van VEGF en HIF-1α tussen de DHJST-groep en de OSA-groep significant is na toediening. Verschillende studies hebben aangetoond dat bepaalde niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen, zoals indomethacine, ontstekingsremmende effecten veroorzaken onafhankelijk van de activiteit van HIF-1α, omdat indomethacine er niet in slaagde om fosfatidylinositol 3-kinase of extracellulaire signaalgereguleerde kinase/mitogen-geactiveerde eiwitkinaseroute, evenals Erk-activiteit te remmen . Indomethacine kan daarentegen peroxisome proliferator-geactiveerde receptor-γ activeren, die niet gevoelig is voor natriumsalicylaat of aspirine. Remming van fosfatidylinositol-3-kinase of Erk-route is gerelateerd aan remming van HIF-1α en angiogene factoren .
hypoxie en verschillende groeifactoren/cytokines versterken de VEGF-expressie . VEGF is niet alleen één van de belangrijkste angiogenesefactoren, maar is ook betrokken in ontstekingsprocessen in OA en draagt tot symptomen zoals pijn bij en het zwellen door de synovial membranen te richten , worden de chronische ontstekingsreacties vaak geassocieerd met de productie van angiogenic factoren die vasculaire proliferatie veroorzaken, en in reumatoïde artritis VEGF wordt hoogst uitgedrukt in synovial cellen . Aangezien mechanische overbelasting één van de veroorzakende factoren voor OA is, bestudeerden wij het effect op VEGF-uitdrukking op konijnenkraakbeen dat de uitdrukking van VEGF na toediening van DHJST afneemt, wijst het resultaat erop dat DHJST het gewrichtskraakbeen kan beschermen door de VEGF-uitdrukking in chondrocyten te onderdrukken (Figuur 3).
5. Conclusies
tot nu toe zijn de bioactieve ingrediënten in DHJST onbekend, maar onze studie geeft aan dat DHJST een significant therapeutisch effect heeft op OA bij konijnen, door mechanismen van het remmen van chondrocyten apoptose, en het reguleren van de expressie van VEGF, HIF-1α in chondrocyten. Dit verstrekt wetenschappelijk bewijsmateriaal voor kliniek om DHJST in het behandelen van OA toe te passen.
financiering
The Natural Science Foundation of Shanghai (subsidienummer: 08JC1418800).