α-Hemolizyna z Escherichia coli wykorzystuje endogenną amplifikację poprzez aktywację receptora P2X w celu wywołania hemolizy

wyniki

hemoliza wywołana HlyA wymaga aktywacji receptorów Purynergicznych.

Supernatant z produkującego α-hemolizynę (HlyA) szczepu E. coli ARD6 lizuje końskie, ludzkie i mysie erytrocyty (Fig. 1). 1 przedstawia hemolizę wywołaną przez HlyA jako funkcję czasu. Eksperymenty poklatkowe z mysimi i ludzkimi erytrocytami dołączonymi do nakrywek ujawniły, że hemoliza wywołana HlyA jest procesem sekwencyjnym. W ciągu pierwszych 20 minut HlyA wywołał krenację czerwonych krwinek w wyniku kurczenia się komórek, a następnie stopniowy wzrost objętości i wreszcie liza komórek (Fig. 1a i 1b, film S1). Ten sekwencyjny skurcz i obrzęk ma również zastosowanie na poziomie jednokomórkowym. Tak więc nie różne populacje czerwonych krwinek kurczą się lub puchną, ale raczej pojedynczy erytrocyt najpierw kurczy się, a następnie pęcznieje w wyniku zastosowania HlyA. Zawiesinę erytrocytów (1,25%) inkubowano z rozcieńczonym supernatantem E. coli (50 µl · ml-1). Erytrocyty z trzech badanych gatunków wykazywały znaczną różnicę w reakcji na HlyA (Fig. 1C) z najniższą wrażliwością na HlyA w ludzkich erytrocytach. We wszystkich poniższych doświadczeniach ilość dodanego supernatantu E. coli dostosowano do uzyskania ≈50% hemolizy po 60 minutach inkubacji.

Zwykle używamy filtrowanego supernatantu E. coli (ARD6) do wywołania hemolizy, chyba że zaznaczono inaczej. Podejście to wybrano w celu zapewnienia, że nasze wyniki będą również miały zastosowanie in vivo, gdzie HlyA jest uwalniana z E. coli wraz z różnymi innymi składnikami. Wybierając takie podejście, musieliśmy jednak zweryfikować, czy hemoliza wywołana przez produkujące HlyA E. coli może być w rzeczywistości przypisana HlyA. Dlatego oczyściliśmy HlyA z naszej kultury ARD6. Po oczyszczeniu zawiesinę oczyszczonego HlyA oddzielono na 5-15% żelu siarczanu dodecylu sodu (SDS). Pojedyncze pasmo 100 kDa pojawiło się po barwieniu Coomassie R, A spektroskopia mas zidentyfikowała pasmo jako HlyA (Fig. S1 A i B). Jako dodatkową kontrolę zastosowaliśmy supernatant ze szczepu E. coli d2103, niepatologicznego laboratoryjnego szczepu E. coli, który nie wytwarza HlyA. Supernatant z tych bakterii nie wywoływał hemolizy w erytrocytach ludzkich, mysich ani końskich (Fig. S1D). Co więcej, porównaliśmy nasze wyniki do HlyA uprzejmie dostarczonych przez Prof. Sucharit Bhakdi, Uniwersytet w Moguncji, Niemcy (o aktywności 10 ng·ml−1 dla ≈50% hemolizy, rys. S2). Poniżej, gdy wspomniano o oczyszczonej HlyA, jest to w odniesieniu do tego preparatu. Podczas naszych wstępnych testów aktywności biologicznej HlyA odkryliśmy, że APIRAZA zmiatająca ATP całkowicie hamowała hemolizę erytrocytów końskich wywołaną przez HlyA. To odkrycie było naprawdę zaskakujące, ponieważ sugerowało pozakomórkowy ATP niezbędny do hemolizy spowodowanej przez produkujące HlyA E. coli. Ponieważ zewnątrzkomórkowy ATP jest cząsteczką sygnalizacyjną aktywującą receptory P2, nasze wyniki mogą sugerować, że dominujący model porów hemolizy indukowanej HlyA może być uproszczeniem. Dlatego dokładniej przetestowaliśmy działanie oczyszczania ATP. Odkryliśmy, że apiraza całkowicie hamowała hemolizę nie tylko końskich, ale także mysich i ludzkich erytrocytów (rys. 2A). Ponadto heksokinaza, która szybko rozkłada adenozynotrójfosforan (ATP) do adenozynotrójfosforanu (ADP), podobnie zmniejszała hemolizę indukowaną przez HlyA w krwinkach czerwonych pochodzenia mysich i ludzkich w sposób zależny od stężenia (Fig. 2b). To odkrycie zostało zweryfikowane przez oczyszczonego HlyA (Fig. 2B, wstawka). Warto zauważyć, że w erytrocytach ludzkich zarówno apiraza, jak i heksokinaza nasilały hemolizę indukowaną HlyA w niższych stężeniach. Rozróżnienie może sugerować różnicę w wzorze ekspresji receptora P2 na krwinkach czerwonych między gatunkami.

aby potwierdzić znaczenie tego odkrycia, ważne było, aby dowiedzieć się, czy antagoniści receptora P2 wpływają na hemolizę wywołaną przez HlyA. Nieselektywny antagonista receptora P2, ppads, w zależności od stężenia zmniejszał hemolizę wywołaną przez produkujące HlyA E. coli w erytrocytach końskich, mysich i ludzkich (Fig. 2C). Wartość EC50 dla ppad wynosi odpowiednio 520 µM, 400 µM i 180 µM dla erytrocytów ludzkich, mysich i końskich. Stwierdzenie to zostało uzasadnione dla całego zakresu stężeń HlyA (Fig. 2D) testowane na ludzkich erytrocytach narażonych na oczyszczoną HlyA. Związek stężenie-odpowiedź był zgodny z konkurencyjnym antagonizmem i należy zauważyć, że wpływ nawet maksymalnych stężeń toksyn został zmniejszony przez bloker receptora P2. Tak więc aktywacja receptora P2 wydaje się być zaangażowana w hemolizę wywołaną HlyA. Nieselektywny antagonista receptora P2, suramina, również w zależności od stężenia zmniejszał hemolizę wywołaną przez HlyA u wszystkich trzech gatunków (dane nie pokazane). W wyższych stężeniach suramina powoduje jednak dramatyczny skurcz erytrocytów, a zatem może nie być odpowiednia do oceny wpływu receptora P2 na erytrocyty.

aby ocenić, czy wpływ antagonisty purynergicznego na hemolizę był jedynie wynikiem zwiększonej osmolalności, przetestowaliśmy wpływ zewnątrzkomórkowej sacharozy na hemolizę wywołaną przez HlyA (dane nie pokazane). Sacharoza (1 mM) tylko nieznacznie zmniejszała hemolizę (5,1% ± 1,7%), podczas gdy sacharoza 10 mM i 75 mM znacznie zmniejszały hemolizę (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Biorąc pod uwagę, że stężenia antagonistów i Atpaz stosowanych w tym badaniu nigdy nie przekraczały 1 mM, efekt ten nie może być wynikiem zwiększonej osmolarności. Nasze wyniki nie odzwierciedlały też nieselektywnego wiązania między antagonistami a toksyną. Testowano to na erytrocytach koniowatych, które wstępnie inkubowano HlyA przez 10-15 minut w temperaturze 37 °C lub przez 30 minut w temperaturze 4 °c, dokładnie przemyto i ponownie zawieszono z antagonistami lub bez nich. Ponieważ HlyA jest włączona do błony podczas preinkubacji, erytrocyty przystąpiły do lizy w przypadku braku wolnej HlyA. Fig. S2 pokazuje, że różne interwencje farmakologiczne zmniejszyły hemolizę po tym, jak HlyA był wcześniej związany z erytrocytami. Antagoniści byli jednak mniej skuteczni, gdy dodawali je do umytych erytrocytów, w których już rozpoczęto proces lityczny.

który Receptor P2 bierze udział w hemolizie wywołanej przez HlyA?

erytrocyty wyrażają różne typy receptorów P2. Receptory P2 wykazujące ekspresję w dojrzałych erytrocytach ludzkich obejmują P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2X1 (15) i P2X7 (16), podczas gdy P2Y1, P2X1, P2X4 i p2x7 wydają się być obecne w komórkach progenitorowych erytroidalnych (17). Aby sprawdzić, który z tych receptorów purynergicznych bierze udział w hemolizie wywołanej przez HlyA, zajęliśmy się tymi receptorami indywidualnie. Ponieważ receptor P2Y1 jest zaangażowany w indukowaną przez sorbitol hemolizę ludzkich i mysich erytrocytów zakażonych plazmodium (14), zbadaliśmy, czy receptor ten jest odpowiedzialny za hemolizę wywołaną przez HlyA. Antagonista receptora P2Y1 MRS2179 nie wpływał na hemolizę wywołaną przez HlyA (Fig. S3A) w stężeniach (do 500 µM) przekraczających to, co było potrzebne do zahamowania hemolizy w erytrocytach zakażonych Plasmodium berghei (14). Ponieważ nie ma specyficznych antagonistów receptorów P2Y2, zbadaliśmy działanie HlyA u myszy transgenicznych. Hemoliza wywołana przez HlyA była podobna w erytrocytach myszy p2y2 – / – i p2y2+ / + (Fig. S3B). W przypadku P2Y13 przetestowaliśmy antagonistę MRS2211, który, jak donoszono, wykazuje pewną selektywność wobec receptora P2Y13 (18). MRS2211 znacznie zmniejszył hemolizę wywołaną HlyA u erytrocytów ludzkich i mysich (rys. S3C). To odkrycie jest sprzeczne z naszymi wynikami z heksokinazą (degradującą ATP do ADP), która powinna raczej stymulować niż hamować wrażliwy na ADP receptor P2Y13. Dlatego heksokinaza i MRS2211 powinny dawać przeciwne wyniki, jeśli zaangażowany jest receptor P2Y13. Ponieważ tak nie jest, receptor P2Y13 jest mało prawdopodobnym kandydatem na receptor P2 biorący udział w hemolizie indukowanej HlyA. Nie można wykluczyć, że hamowanie wytwarzane przez MRS2211 jest pośredniczone przez inny receptor P2.

W Zasadzie, to pozostawia tylko receptory P2X do rozważenia. Fig. 3A pokazuje, że nieselektywny bloker receptorów P2X Evans blue silnie zmniejsza hemolizę wywołaną przez HlyA, co sugeruje, że w hemolizie bierze udział receptor P2X. Spośród receptorów P2X wyrażonych w erytrocytach, uważaliśmy P2X7 za najbardziej prawdopodobny mediator hemolizy wywołanej przez HlyA z następujących powodów. Wiadomo, że receptory P2X7 przechodzą w stan większej przepuszczalności, co ostatecznie prowadzi do lizy w niektórych komórkach (12). Stwierdzono, że receptor P2X7 wchodzi w interakcję z białkiem kanałowym pannexin1 (12), a kompleks tworzy duże pory przepuszczalne dla większych cząsteczek, takich jak bromek etydyny (13). Pannexin1 ulega ekspresji w ludzkich krwinkach czerwonych (19) i jest ostatnio sugerowana jako kanał uwalniania ATP w erytrocytach (20). Aby sprawdzić, czy receptory P2X7 uczestniczą w hemolizie indukowanej przez HlyA, użyliśmy antagonistów o względnej selektywności dla P2X7: Błękit brylantowy G (BBG), ATP-2′,3′-dialdehyd (Oksatp) i KN-62 (21). Wszyscy antagoniści w zależności od stężenia zmniejszali hemolizę w erytrocytach końskich, mysich i ludzkich (Fig. 3). Erytrocyty końskie i ludzkie były bardziej wrażliwe na wszystkie badane substancje w porównaniu z erytrocytami mysimi. W tym kontekście należy wspomnieć, że wiadomo, że receptor mysi P2X7 jest mniej wrażliwy na KN-62 w porównaniu z receptorem ludzkim (22). Ochrona przed hemolizą przez antagonizm receptora P2X została ponownie uzasadniona dla całego zakresu stężeń oczyszczonego HlyA w ludzkich erytrocytach, stosując BBG jako przykład antagonisty P2X7 (Fig. 3D). Ponownie antagonista wykazuje znaczny wpływ na hemolizę wywołaną HlyA, nawet w stężeniach HlyA, które powodowały maksymalną hemolizę. Hamowanie hemolizy przez OxATP zweryfikowano stosując oczyszczoną HlyA w mysich i ludzkich erytrocytach (Fig. 3E, wstawka). Nowy selektywny, konkurencyjny antagonista receptora P2X7 a438079 zmniejszał hemolizę w erytrocytach ludzkich, ale był mniej skuteczny w erytrocytach mysich (Fig . 3F). Immunobloty frakcji błonowych osocza receptora P2X7 potwierdzają, że erytrocyty ludzkie i mysie wykazują ekspresję białka o odpowiedniej wielkości (66 kDa, Fig. 3G, a w całości na Rys. S4B). Będzie to wymagało dalszych badań w celu pełnego ustalenia względnego udziału receptorów P2X w hemolizie wywołanej HlyA. Dzięki naszym obecnym narzędziom nie możemy wykluczyć możliwości udziału innych receptorów P2X w hemolizie wywołanej przez HlyA u żadnego z badanych gatunków.

rys. S4A pokazuje hemolizę wywołaną przez HlyA w mysich erytrocytach (P2X7+/+ i P2X7−/ -). Mysie erytrocyty wykazują podobny stopień hemolizy w odpowiedzi na HlyA, niezależnie od ich genotypu. Myszy P2X7−/− i p2x7+/+ były pierwotnie generowane przez firmę Pfizer i były krzyżowane wstecznie na tle BALB/C. Nie wykryliśmy żadnych rozbieżności między wrażliwością na hemolizę wywołaną przez HlyA w erytrocytach wyizolowanych od myszy BALB/c i C57BL/6 (DANE Nie pokazane), mimo że wiadomo, że szczep C57BL/6 ma genetyczną zmienność końca C receptora P2X7 (23). Dane te są zgodne z niewielkim wpływem A438079 na mysie erytrocyty i niską ekspresją białka receptora P2X7 w mysich erytrocytach (Fig. 3F i 3G).

wyniki te sugerują, że istnieje co najmniej jeden dodatkowy receptor P2 zaangażowany w hemolizę indukowaną przez HlyA w mysich erytrocytach. Ponieważ P2X1 i P2X7 mają podobne profile inhibitorów dla BBG, kn-62 i OxATP (24), przetestowaliśmy antagonistów P2X1 MRS2159 i NF449. MRS2159 hamuje hemolizę zależną od stężenia erytrocytów u koni (EC50: 150 µM) i myszy (EC50: ≈250 µM). Ludzkie erytrocyty były stosunkowo niewrażliwe na działanie antagonisty, ale przy stężeniu powyżej 250 µM zaobserwowaliśmy niewielkie i statystycznie istotne zmniejszenie (rys. 4a). Efekt ten był znacznie bardziej wyraźny, jeśli zastosowano oczyszczoną HlyA (rys. 4C). Oznacza to, że mogą występować różnice w odpowiedzi komórkowej w odniesieniu do tego, czy są one poddawane HlyA w czystej postaci, czy w połączeniu z innymi składnikami E. coli. Nf449 w zależności od stężenia hamuje hemolizę wywołaną przez HlyA u ludzi (Fig. 4B). NF449 był znacznie mniej skuteczny w mysich erytrocytach, zgodnie z tym, że mysi receptor P2X1 był stosunkowo oporny na ten inhibitor (25). Należy podkreślić, że chociaż nf449 jest pochodną suraminy, nie wywołał on takich samych zmian objętości erytrocytów jak suramina. Wiadomo, że immunobloty receptora P2X1 wykazują do 4 pasm w różnych tkankach; nie glikozylowany 45 kDa, glikozylowany 60 kDa i pasmo 95/120 kDa, które może być polimeryzowaną formą receptora (26, 27). W naszych rękach przeciwciało receptora P2X1 konsekwentnie rozpoznało pasmo 45 KD i bardzo słabe pasmo 60 kDa w plamach błon osocza z mysich i ludzkich erytrocytów (Fig. 4D). Co ciekawe, odkryliśmy, że poziom ekspresji pasma 60 kDa był znacznie wyższy u myszy P2X7−/− w porównaniu do kontroli (podobnie w trzech preparatach, Fig. 4D). W tym immunoblot poziom białka jest dostosowywany, aby uniknąć przeciążenia pasm myszy P2X7−/−, co pozostawia pasmo 60 kDa prawie niewykrywalne u myszy p2x7+/+. Ta pozorna regulacja w górę receptora P2X1 może potencjalnie ukryć fenotyp hemolityczny u myszy z niedoborem receptora P2X7. Zebrane razem dane potwierdzają hipotezę, że zarówno receptor P2X1, jak i p2x7 są istotne dla hemolizy wywołanej przez HlyA. Nasze wyniki wskazują na znaczące różnice międzygatunkowe, w których receptor P2X7 jest ważniejszy dla hemolizy w ludzkich erytrocytach.

hemolizie wywołanej przez HlyA zapobiegają antagoniści Pannexin1.

karbenoksolon (28), meflochina i probenecyd (30) były stosowane jako antagoniści o względnej selektywności wobec panneksyny1. Karbenoksolon znacznie obniżył poziom hemolizy u wszystkich trzech gatunków o podobnej czułości (Fig. 5A). Działanie karbenoksolonu zostało ponownie przetestowane dla całego zakresu stężeń HlyA (oczyszczona Toksyna, Fig. 5B), wykazujące również znaczne efekty przy maksymalnym stężeniu HlyA. Meflochinę i probenecyd testowano tylko w mysich i ludzkich erytrocytach. EC50 dla meflochiny wynosiło 25 µM u ludzi i 18 µM u mysich erytrocytów. Probenecyd hamował hemolizę w ludzkich erytrocytach, z EC50 wynoszącym 2 mM, ale był mniej skuteczny w erytocytach mysich. Ostatnio wykazano, że znane antagonisty kanału Cl-NPPB i kwas niflumowy hamują również kanały panneksyny (31). Obie substancje zmniejszały hemolizę wywołaną przez HlyA, ze znacznie wyraźniejszym wpływem na ludzkie erytrocyty (rys. S5).