- Mioblasty przyjmują wydłużony kształt, aby różnicować i regulować swoją sieć aktynową do obszaru rozprzestrzeniania się
- przestrzenna organizacja sieci aktyny i jądra jest kierowana przez morfologię mioblastów
- wydłużenie komórek zwiększa kurczliwość mioblastów
- kurczliwość par komórkowych wzrosła po ich fuzji i wzrosła na wydłużonych mikropaternach
- kurczliwość Actomiozyny sprzyja różnicowaniu mięśniówek
- wydłużenie mioblastów wyzwala eksport jądrowy YAP, który jest niezbędny do różnicowania mioblastów w miotuby
Mioblasty przyjmują wydłużony kształt, aby różnicować i regulować swoją sieć aktynową do obszaru rozprzestrzeniania się
aby ocenić związek między kształtem komórki, siecią aktynową i ogniskowymi zrostami, hodowaliśmy mioblasty C2C12 na jednorodnej warstwie fibronektyny (FN). Po 24 godzinach w hodowli mioblasty utrwalano i barwiono na aktynę w celu określenia ich parametrów morfologicznych (Fig. 1a). Substraty pokryte FN umożliwiły utworzenie specyficznych interakcji komórka-substrat poprzez rekrutację specyficznych integryn transbłonowych. W rzeczywistości kilka podjednostek α integryny, które łączą się z podjednostką β1, ulega ekspresji podczas miogenezy szkieletu, co jest ważne w migracji komórek miogennych, fuzji mioblastów,dojrzewaniu włókien mięśniowych lub utrzymaniu integralności mięśni32, 33. Dodatkowe doświadczenia przeprowadzone na podłożach pokrytych lamininą (LAM) wykazały, że oba parametry morfologiczne (wskaźnik kształtu komórki, Obwód komórki i obszar komórki, Fig. 1A) oraz interakcje komórka-substrat (liczba i obszar zrostów ogniskowych, Fig. 1B) były statystycznie podobne w przypadku FN i LAM, zatwierdzając powłokę FN do badania in vitro morfologii mioblastów C2C12 podczas procesu fuzji / różnicowania.
Mioblasty przyjmują wydłużony kształt, aby różnicować i regulować swoją sieć aktynową do obszaru rozprzestrzeniania. (A) kolorowe obrazy epifluorescencji typowych pojedynczych mioblastów C2C12 wykazujących różne indeksy kształtu komórek (CSI) in vitro. Komórki zabarwiono falloidyną na aktynę. Paski skali mają 20 µm. Analiza morfologiczna (B) CSI (R2 = 0,80), (C) obwodu komórki (R2 = 0,97) i (D) obszaru komórki (R2 = 0.82) wskazują, że komórki C2C12 hodowane in vitro wykazywały średnią powierzchnię 2057 ± 618 µm2 i średnią CSI 0,37 ± 0,15 (n = 101 dla B, C I D). Czerwone krzywe są pasami Gaussa. (E) liniowa ewolucja natężenia fluorescencji aktyny w funkcji obszaru komórkowego (R2 = 0,748, N = 28). Ewolucja całkowitego obszaru winkuliny w funkcji (F) obszaru komórkowego (R2 = 0,783, N = 28) I (G) oraz natężenia f-aktyny (n = 28). H) harmonogram proliferacji (na Żółto) i różnicowania (na Czerwono) mioblastów C2C12 in vitro. Czarna strzałka wskazuje na zastąpienie mediów proliferacyjnych mediami różnicującymi. (I, J) współczynnik kształtu mioblastów przy P0, P2 (etapy proliferacji, średnia = 0,40 ± 0,16 przy P0, n = 150 dla obu) i D2 (etap różnicowania, średnia = 0,24 ± 0,07, N = 100).
obliczyliśmy wskaźnik kształtu komórki (CSI), który charakteryzował morfologię mioblastów, podając informacje na temat wydłużenia komórkowego. Zaokrąglone komórki mają CSI bliskie 1, podczas gdy wydłużone komórki mają CSI bliskie 0. Znaleźliśmy CSI w zakresie od 0,1 do 0,8 ze średnią wartością 0.37 ± 0,15 (N = 101), co sugeruje dużą zmienność morfologii komórek (Fig. 1B). Mioblasty wykazywały średni obwód 259 ± 82 µm (Fig. 1C, n = 101) i szeroki zakres powierzchni rozsiewania (od ~1000 do ~4000 µm2), przy średniej wartości 2057 ± 618 µm2 (Fig. 1D, n = 101). Wyniki uzyskane na mioblastach C2C12 wzmocniono wykonując dodatkowe pomiary morfologiczne (CSI, Obwód komórki i obszar komórki) na pierwotnych ludzkich mioblastach (16ubic, Fig. 2A), które pochodzą z bicepsów pacjenta (np. którym potwierdzono brak usunięcia 4qA). Jak pokazano na rysunku uzupełniającym. 2B-D, nasze wyniki pokazują, że CSI 16ubicznych mioblastów wynosiło od 0,14 do 0,86 ze średnią wartością 0,44 ± 0,17 (n = 90), co sugeruje dużą zmienność morfologii komórek dla ludzkich mioblastów, obserwowaną dla komórek C2C12. Razem, nasze wyniki pokazują, że zmienność morfologii komórek nie jest zależna od typu komórki lub jakiegokolwiek artefaktu kultury komórkowej.
następnie badaliśmy Rozkład włókien aktyny w populacji mioblastów C2C12, aby zrozumieć, czy obszary rozprzestrzeniania się zmienności mogą modulować cytoszkielet aktyny. Nasze odkrycia wykazały, że całkowita intensywność fluorescencji sieci f-aktyny była liniowo związana z obszarem komórkowym (Fig. 1E, n = 31, R2 = 0,748), co sugeruje, że im większy rozsiew mioblastów, tym więcej włókien aktyny powstaje. Jak pokazano na rysunku uzupełniającym. 3, Następnie scharakteryzowaliśmy dystrybucję zrostów zawierających winkulinę, aby określić, w jaki sposób zmiany kształtu komórki wpływają na interakcje komórka-substrat w mioblastach C2C12. Odkryliśmy, że całkowity obszar zrostów komórka-substrat na komórkę zwiększał się wraz z obszarem komórki (rys. 1F, n = 31, R2 = 0,783) i z intensywnością fluorescencji F-aktyny (rys. 1G). Nasze wyniki wskazują, że mioblasty C2C12 przyjmują różne kształty komórek i obszary rozprzestrzeniania się, ale z kolei dostosowują zarówno ilość włókien aktyny, jak i zrostów winkuliny do ich rozprzestrzeniania. Aby uzyskać lepszy wgląd w rolę kształtu komórki w różnicowaniu mioblastów, rozważamy ewolucję współczynnika kształtu komórki podczas etapów proliferacji (P0 po 6 godzinach i P2 po 48 godzinach) i różnicowania (D2 po 96 godzinach) (Fig. 1H). Jak pokazano na Fig. 1i, J, nasze wyniki pokazują, że mioblasty zwiększyły swój współczynnik kształtu z 0,40 ± 0,16 (P0) do 0,36 ± 0,09 (P2) i 0,24 ± 0,07 (D2), co sugeruje, że mioblasty znacznie wydłużają się i przyjmują współczynnik kształtu 1:4 w celu odróżnienia. Ponadto, nasze wyniki wykazały, że włókna naprężeniowe aktyny były wysoce zorientowane na D2 (dodatkowe Fig. 4A, B), co odpowiada również znaczącym wydłużeniom jądrowym (dodatkowe rys. 4C). Zebrane razem Wyniki pokazują, że sieć f-aktyny jest modulowana przez modyfikacje morfologii mioblastów i wskazują, że różnicowanie mioblastów wymaga wydłużenia komórkowego do proporcji 1: 4.
przestrzenna organizacja sieci aktyny i jądra jest kierowana przez morfologię mioblastów
kontrolowaliśmy wewnętrzną zmienność morfologii mioblastów za pomocą samoprzylepnych mikropatern do standaryzacji ich obszarów rozprzestrzeniania się i kontrolowania ich kształtów. Stosując technikę druku mikrokontaktowego20, stworzyliśmy samoprzylepne mikropatterny fibronektyny (FN) o stałej powierzchni 1600 µm2 i różnych geometriach. Zastosowaliśmy zaokrąglone (CSI = 1), kwadratowe (CSI = 0,79), trójkątne (CSI = 0,60) i różne proporcje prostokątne (CSI = 0,50 i 0,34 dla 1: 4 i 1:7 współczynników proporcji, odpowiednio) FN mikropatterns do kultury poszczególnych mioblastów (rys. 2A). Te różne geometrie mikropatternów pozwoliły na standaryzację kształtu mioblastów in vitro w szerokim zakresie i kontrolowanie ich obszaru rozprzestrzeniania się.
przestrzenna organizacja sieci aktyny i jądra jest kierowana przez morfologię mioblastów. (A) obrazy Epifluorescencji komórek C2C12 wyhodowanych na mikropaternach fibronektyny (FN) o powierzchni 1600 µm2 i odpornych na F-aktynę (zieloną), jądra (niebieską) i winkulinę (czerwoną). Mikropatterny okrągłe, kwadratowe, trójkątne i prostokątne (proporcje 1:4 i 1:7) odpowiadają odpowiednio CSI = 1, 0,79, 0,60, 0,50 i 0,34. Paski skali mają 20 µm. B) typowe przykłady przestrzennej organizacji włókien aktyny w mikropatternowanych komórkach C2C12, które są oznaczone kolorami zgodnie z ich orientacjami. Paski skali mają 20 µm. (C) orientacja sieci aktyny w zaokrągleniu (N = 12 w kolorze czarnym), kwadracie (N = 11 w kolorze czerwonym), trójkątnym (N = 19 w Kolorze Niebieskim) i 1:4 (N = 18 w kolorze zielonym) lub 1:7 (N = 11 w kolorze różowym) prostokątnych mikropattern mioblastów. Ewolucja D) współczynnika kształtu jądrowego i e) orientacji jądrowej dla różnych geometrii mioblastów (10 ≤ N ≤ 15 dla każdego CSI).
aby ilościowo określić rolę geometrii komórki w organizacji przestrzennej cytoszkieletu aktyny, określiliśmy orientację włókien aktyny dla każdego kształtu komórki34,35. Włókna aktyny barwione falloidyną oznaczono kolorami w funkcji ich orientacji z gradientem koloru od jasnoniebieskiego, gdy włókna aktyny były zorganizowane równolegle (0°) do osi poziomej i czerwone (+90°) lub pomarańczowe (-90°) dla tych zorganizowanych prostopadle do osi poziomej (Fig. 2b). Zaobserwowaliśmy, że włókna aktyny w zaokrąglonych komórkach były rozmieszczone losowo, z orientacjami od -90° do +90°. Kwadratowe komórki wykazywały włókna aktyny zorganizowane w trzy główne domeny kątowe: 0° do 25°, 50° do 90° i -50° do -90°, podczas gdy trójkątne komórki wykazywały włókna aktyny zorganizowane głównie zgodnie z trzema bokami wzoru w 0°, 60° i -60°. Co ciekawe, odkryliśmy, że włókna aktyny były silnie zorientowane równolegle do osi długiej komórki (0°) dla prostokątnych komórek o proporcjach 1:4 (CSI = 0,50) i 1:7 (CSI = 0,34). Oznaczanie ilościowe zrostów zawierających winkulinę nie wykazało statystycznych różnic w obszarach adhezji między morfologiami komórek(Fig. 5A-C), natomiast orientację ogniskowych zrostów modulowano za pomocą kształtu komórki (rys. uzupełniająca). 5D, E), jak obserwowano dla włókien aktyny. Nasze wyniki pokazują, że zarówno prostokątne mioblasty 1:4, jak i 1: 7 pozwalają na silniejszą organizację cytoszkieletu aktynowego (rys. 2C) i ogniskowych zrostów, co sugeruje, że wydłużenie mioblastów prowadzi do powstawania dipoli kurczliwych.
biorąc pod uwagę rolę jądra komórkowego w różnicowaniu mioblastów w miotubach, następnie zbadaliśmy, czy zmiany kształtu komórki i architektury cytoszkieletu mogą modulować kształt i orientację jądera36. Odkryliśmy, że współczynnik kształtu jądrowego znacznie wzrósł wraz z obniżeniem CSI (rys. 2D). W rzeczywistości, zaokrąglone komórki (CSI = 1) na okrągłych mikropatternach wykazały zaokrąglone jądro charakteryzujące się średnim współczynnikiem kształtu 1,11 ± 0,06, podczas gdy prostokątne komórki o współczynniku kształtu 1:4 (CSI = 0,50) i 1:7 (CSI = 0,34) wykazywały Duże deformacje jądrowe o współczynnikach kształtu odpowiednio 1,39 ± 0,21 i 2,19 ± 0,23. Zauważyliśmy również, że orientacja jądra była modulowana przez morfologię komórek (rys. 2E). Okazało się, że orientacja jądra w zaokrąglonych, kwadratowych i trójkątnych komórkach obejmowała szeroki zakres kątów (od ~15° do ~60°), ze średnią orientacją ~40° (okrągły, n = 11), ~33° (kwadrat, n = 14) i ~43° (Trójkąt, N = 10) względem osi poziomej. W przypadku komórek prostokątnych nasze wyniki wykazały, że jądro jest zorientowane równolegle do osi komórki o średnim kącie ~14° (1:4, n = 15) i ~2° (1:7, n = 10).
wydłużenie komórek zwiększa kurczliwość mioblastów
kolejnym pytaniem, którym się zajęliśmy, było to, w jaki sposób zmiany kształtu komórek wpływają na kurczliwość mioblastów. Aby odpowiedzieć na to pytanie, użyliśmy mikroskopii siły trakcyjnej (TFM) do określenia naprężeń trakcyjnych wywieranych przez mioblasty mikropatternowe. Jak pokazano na Fig. 3A zaobserwowaliśmy, że maksymalne naprężenia były wywierane na kończynach mioblastów mikropatternowanych, niezależnie od kształtu komórki. Jak zaobserwowano wcześniej na innych typach komórkowych37, naprężenie skurczowe kumuluje się preferencyjnie w rogach (kwadratach i trójkątach) lub na obu kończynach (prostokątach 1:4 i 1:7) mioblastów mikropatternowanych. Zmierzyliśmy całkowity stres wywierany przez mioblasty w mikrowłóknach, aby określić, czy morfologia komórek moduluje kurczliwość komórek. Jak pokazano na Fig. 3B, zaokrąglone komórki (CSI = 1) wywierały całkowity naprężenie 170,7 ± 46,4 N/m2, podczas gdy prostokątne komórki (CSI = 0,34, współczynnik kształtu 1:7) wywierały większą całkowitą ilość naprężeń (295,9 ± 156.8 N/m2), co sugeruje, że wydłużone kształty komórek prowadzą do zwiększenia naprężeń trakcyjnych. Ponadto odkryliśmy, że prostokątne komórki (CSI = 0,34, współczynnik kształtu 1: 7) wykazywały większą maksymalną wartość naprężenia (684,3 ± 257,8 Pa, Fig. 3C), natomiast zaokrąglone mioblasty wykazały najniższą maksymalną wartość naprężenia (351,5 ± 123,6 Pa). Biorąc pod uwagę, że naprężenia kurczliwe były wywierane na obwodzie komórki i że obniżenie CSI prowadzi do zwiększonych naprężeń trakcyjnych, wykreśliliśmy maksymalną wartość naprężenia jako funkcję odległości od środka masy do końca komórki (rys. 3D), co oznacza 22,6 µm (CSI = 1), 28,28 µm (CSI = 0,79), 33,98 µm (CSI = 0,60), 41,23 µm (CSI = 0,50) i 53,45 µm (CSI = 0,34). Jak pokazano na Fig. 3D, odkryliśmy, że maksymalny stres skurczowy zwiększał się liniowo wraz z odległością od centroida do końca komórki (R2 = 0,958, N = 65), co sugeruje, że wydłużone morfologie mioblastów wywierają więcej sił trakcji.
w celu określenia udziału sieci aktomiozyny w tworzeniu sił skurczowych w mioblastach, komórki C2C12 leczono lekiem sekwestrującym G-aktynę Latrunkuliną B (LatB) i inhibitorem miozyny II Blebbistatyną (Bleb). Immunostabilne mioblasty z falloidyną wykazały, że komórki latb i Bleb wykazywały rozproszoną sieć aktynową (Fig. 3E), wykazując, że oba leki znacząco wpłynęły na organizację f-aktyny. Wykorzystaliśmy TFM na mioblastach o mikropaternach leczonych obydwoma lekami do określenia roli sieci actomyosin w tworzeniu sił skurczowych w mioblastach o różnych geometriach. Nasze odkrycia wskazują, że leczenie LatB wywołało znaczną utratę kurczliwości, która zwiększała się wraz z wydłużeniem komórek. Rzeczywiście, zaokrąglone komórki wykazywały utratę naprężeń kurczliwych ~62%, podczas gdy prostokątne komórki 1:4 i 1: 7 potraktowane LatB charakteryzowały się utratą naprężeń kurczliwych odpowiednio ~88% i ~86% (Fig. 3F). Ponadto odkryliśmy, że stres skurczowy 1:4 prostokątne komórki potraktowane Bleb charakteryzowały się utratą ~80% siły skurczowej, co dowodzi, że silniki cząsteczkowe miozyny II są kluczowymi uczestnikami sił skurczowych mioblastów.
łącznie wyniki te wskazują, że kurczliwość sieci actomyosin jest zwiększona u wydłużonych mioblastów poprzez utworzenie gęstej sieci równoległych włókien actomyosin.
kurczliwość par komórkowych wzrosła po ich fuzji i wzrosła na wydłużonych mikropaternach
aby zrozumieć, jak morfologia mioblastów może wpływać na właściwości kurczliwe miotub, rozważamy minimalny model dwóch mioblastów. Najpierw określiliśmy siły pociągowe wywierane przez dublety komórkowe w P1 (24 h w mediach proliferacyjnych) platerowane mikropatternami o różnych kształtach (dodatkowe rys. 6a). Nie stwierdzono różnic statystycznych w zakresie stresu skurczowego między szerokim zakresem CSI (dodatkowe rys. 6B), pomimo dobrze zdefiniowanej orientacji sieci aktyny (dodatkowe rys. 6C) i jąder (dodatkowe rys. 6D, E) na mikropatternach prostokątnych 1:4 i 1:7. Opierając się na tej obserwacji, określiliśmy ilościowo stres skurczowy wywierany przez dublety komórkowe hodowane na mikropatternach FN o przekroju okrągłym (CSI = 1) i prostokątnym (CSI = 0,50, współczynnik kształtu 1:7) w ciągu pięciu dodatkowych dni (D5, Fig. 1H) w medium różnicującym. Zastosowaliśmy MitoTracker Red CMXRos (ThermoFisher Scientific), żywe barwienie mitochondrialne, aby upewnić się, że dublety mioblastów zostały skondensowane (rys. 4A) 38. Jak pokazano na Fig. 4B, C, odkryliśmy, że całkowity stres kurczliwy był nieznacznie zwiększony w zespolonych podwójnych komórkach hodowanych na okrągłych mikropaternach (267 ± 64 Pa) w porównaniu do okrągłych nieusuwanych podwójnych komórek (157 ± 37 Pa), podczas gdy zespolone wydłużone dublety były ponad dwa razy bardziej kurczliwe (543 ± 193 Pa) niż nieusuwane wydłużone dublety (211 ± 73 Pa). Wyniki te wskazują, że kurczliwość komórek wzrosła po fuzji komórek i była znacznie zwiększona w przypadku wydłużonych morfologii.
kurczliwość par komórek wzrosła po ich fuzji i wzrosła na wydłużonych mikropaternach. (A) obrazy Epifluorescencyjne par komórek C2C12 niefuzowane (D) i zespolone (FD) na okrągłych i prostokątnych (proporcje 1:7) mikropatternach FN i barwione na mitochondria za pomocą Mito Tracker. Paski skali mają 20 µm. B) reprezentatywne mapy naprężeń skurczowych wywieranych przez pary komórek C2C12 zespolonych na okrągłych i prostokątnych mikropatternach FN. C) Ewolucja naprężeń całkowitych dla par komórek C2C12 niefusowanych (d), (pręty zwykłe) i zespolonych (FD, pręty haszowane) na mikropaternach FN okrągłych (w kolorze szarym) i prostokątnych (w Kolorze Fioletowym). Okrąg D: n = 8; okrąg FD: N = 5; prostokąt d: n = 6 i prostokąt FD: N = 8. **p < 0.01.
kurczliwość Actomiozyny sprzyja różnicowaniu mięśniówek
zapytaliśmy wtedy, czy kurczliwość actomiozyny mioblastów może wpływać na różnicowanie mięśniówek. Mioblasty C2C12 hodowano na podłożach pokrytych FN w mediach proliferacyjnych przez 2 dni (P2, Fig. 1H) w celu osiągnięcia zbiegu komórkowego. Następnie na 30 minut dodawano LatB lub Bleb, a podłoże proliferacyjne zastąpiono pożywką do hodowli różnicującej. Po 4 dniach w pożywce różnicującej (D4, rys. 1H), komórki C2C12 utrwalono i zabarwiono dla dna i Troponinty, markera różnicowania (Fig. 5). Oceniliśmy wpływ leczenia LatB i Bleb poprzez barwienie Alfa aktyniny na miotuby kontrolne (CTRL) i miotuby leczone Latrunkuliną B (+LatB) i blebbistatyną (+Bleb). Jak zaobserwowano na rysunku uzupełniającym. 7, miotuby kontrolne prezentują typowe prążkowane Wzory Z-band, podczas gdy zabiegi LatB i Bleb zakłócają wzory prążkowania w miotubach. Miotuby sterujące (CTRL) charakteryzowały się średnim współczynnikiem kształtu 7,99 ± 3,38 (rys. 5A) i dodatni obszar troponiny T wynoszący 51,7 ± 5,6% (Fig. 5b). Nasze wyniki wskazują, że leczenie Latb i Bleb zmniejszyło frakcję obszaru T Troponiny odpowiednio do 44,9 ± 5,2% i 44,4 ± 5,1%. Ponadto stwierdzono, że wskaźnik fuzji był statystycznie niższy dla komórek latb (27 ± 3%) i leczonych Blebb (29 ± 3%) niż dla komórek kontrolnych (38 ± 5%), wzmacniając rolę kurczliwości actomiozyny w różnicowaniu mioblastów (Fig. 5C). Łącznie wyniki te wskazywały, że kurczliwość mioblastów aktomiozyną sprzyja różnicowaniu mięśni.
kurczliwość Actomyozyny sprzyja różnicowaniu mięśni. (A) rozkład proporcji miotube po 4 dniach w pożywce różnicującej (n = 114, R2 = 0,915). Ewolucja (B) odsetka dodatniego obszaru dla troponiny T i (C) wskaźnika fuzyjnego w komórkach kontrolnych (CTRL), komórkach leczonych Latb i Bleb (N = 20 dla każdej). (D) typowe obrazy epifluorescencji miotub sterujących (Ctrl), LatB i miotub leczonych Bleb powstały po 4 dniach w pożywce różnicującej. Miotuby były odporne na DNA (niebieskie) i troponinę T (czerwone). Skala barów wynosi 100 µm. *p < 0.05, * * p < 0.01 i N. s.nieistotne.
wydłużenie mioblastów wyzwala eksport jądrowy YAP, który jest niezbędny do różnicowania mioblastów w miotuby
aby uzyskać lepszy wgląd w mechanizmy wewnątrzkomórkowe, które kontrolują różnicowanie mięśni, rozważamy rolę YAP, określając jego lokalizację w cytoplazmie lub jądrze mioblastów, gdzie jest wiąże się i aktywuje czynniki transkrypcyjne tead39. W tym celu określiliśmy ilościowo stosunek cytoplazmatycznej / jądrowej YAP w mioblastach mikropattern (Fig. 6a i dodatkowe rys. 8). Wydłużenie komórki na 1:Prostokątne mikropatterny 4 i 1:7 zwiększały stosunek cytozolic / jonów Yap (rys. 6B), co sugeruje, że wydłużenie komórek uruchamia eksport jądrowy YAP poprzez jądrowe siły ściskające wywierane przez sieć actomyosin40. Aby zweryfikować, czy lokalizacja YAP w cytoplazmie lub jądrze jest związana z określonymi etapami procesu różnicowania, zabarwiliśmy Yap w komórkach C2C12 po 24 h (P1) i 48 h (P2) etapu proliferacji oraz po 96 h (D2) i 264 h (D9) etapu różnicowania (Fig. 6C i dodatkowe rys. 9). Co ciekawe, nasze wyniki wykazały, że stosunek cytoplazmatyczny / jądrowy Yap wzrósł z 0,37 ± 0,07 przy P1 do 0,68 ± 0,06 przy P2 i 0,67 ± 0,06 przy D2, a następnie zmniejszył się do 0,42 ± 0,10 przy D9 (rys. 6D). Co ciekawe, stosunek cytoplazmatyczny/jądrowy Yap w D9 okazał się statystycznie nie różny od wartości P1, co sugeruje, że stosunek cytoplazmatyczny/jądrowy Yap w zróżnicowanych miotubach jest podobny do stosunku mioblastów. Aby zweryfikować te wyniki, zebraliśmy mioblasty na etapie proliferacji P1 (24 h) i różnicowania D2 (96 h) i wyizolowaliśmy ich materiały cytoplazmatyczne i jądrowe. Przeprowadziliśmy test białka kwasu bicinchoninowego (BCA) i białka zawarte w cytoplazmatycznej i ekstrakcji jądrowej analizowano za pomocą elektroforezy (Fig. 6E). Nasze wyniki Western blot wykazały, że stosunek cytoplazmatyczny / jądrowy Yap wzrósł z 0,62 ± 0,08 przy P1 do 0,87 ± 0,24 przy D2 (Fig. 6F). Ta biochemiczna kwantyfikacja YAP wykazała znaczący eksport jądrowy YAP w różnicowaniu komórek C2C12 i wzmocniła nasze odkrycia.
wydłużenie mioblastów wyzwala eksport jądrowy YAP, który jest niezbędny do różnicowania mioblastów w miotuby. A) obrazy Epifluorescencji komórek C2C12 hodowanych na mikropaternach FN o powierzchni 1600 µm2 i immunostabilnych dla YAP. Paski skali mają 20 µm. B) stosunek cytoplazmatyczny do jądrowego YAP dla różnych morfologii mioblastów (N = 10 dla każdego). C) obrazy Epifluorescencji komórek zbiegu C2C12 immunostrzeżonych dla YAP w dniu 1 (P1, 24 h) etapu proliferacji oraz w dniu 2 (D2, 96 h) i dniu 9 (D9, 264 h) etapu różnicowania. Skala barów wynosi 100 µm. D) stosunek cytoplazmatyczny do jądrowego YAP przy P1 (N = 50), P2 (N = 30), D2 (N = 30) i D9 (N = 30). (E) Analiza Western blot ekspresji YAP (65 kDa) w proliferacji i różnicowaniu C2C12. F) stosunek cytoplazmatyczny do nuklearnego Yap (średnia ± S. D.) podczas proliferacji i różnicowania(3 replikuje dla każdego stanu z 20.106 komórek/replikacji). G) stosunek cytoplazmatycznego do jądrowego YAP przy D2 oraz (H) wskaźnik fuzyjny dla komórek poddanych kontroli (CTRL) i leptomycyny (LMB) przy D4. **p < 0.01, *** * p < 0.0001 i N. S nieistotne.
na podstawie tych wyników oceniliśmy rolę YAP poprzez zastosowanie leptomycyny B do blokowania aktywnego eksportu z jądra poprzez bezpośrednie wiązanie z exportin141. Alberto Elosegui-Artola i współpracownicy wykazali niedawno, że leptomycyna B (LMB) może być skutecznie wykorzystywana do badania, w jaki sposób siły skurczowe wywierane przez cytoszkieletową translokację jądrową yap39. Traktując mioblasty C2C12 w P2 (48 h) LMB, odkryliśmy, że stosunek cytoplazmatyczny do jądrowego Yap był znacznie niższy w komórkach leczonych LMB w D2 (96 h, Fig. 6G), co sugeruje, że YAP koncentruje się głównie w jądrze, gdy eksport jądrowy jest hamowany. Ponadto, nasze wyniki wykazały, że wskaźnik fuzji W D4 komórek leczonych LMB (Fig. 6H) był bardzo niski (3,8 ± 1.5%) w porównaniu z komórkami kontrolnymi (42,4 ± 9,1%), wykazując, że aktywny eksport jądrowy jest wymagany do różnicowania C2C12.