bakterie redukujące siarczany w kale ludzkim i ich związek z zapalnymi chorobami jelit

Streszczenie

poszukiwaliśmy bakterii redukujących siarczany w kale 41 zdrowych osób i 110 pacjentów z oddziału Hepato-Gastro-Enterologii przy użyciu określonego ciekłego medium (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orlean, Francja). 110 pacjentów rozdzielono na 22 pacjentów z chorobami zapalnymi jelit, a 88 pacjentów hospitalizowano z powodu innych chorób dolnego (N = 30) lub górnego (N=58) przewodu pokarmowego. Bakterie redukujące siarczany wyizolowano od 10 zdrowych osób (24%), 15 pacjentów z zapalnymi chorobami jelit (68%) i 33 pacjentów z innymi objawami (37%). Opracowano multiplex PCR do identyfikacji Desulfovibrio piger (dawniej Desulfomonas pigra), Desulfovibrio fairfieldensis i Desulfovibrio desulfuricans i zastosowano do powyższych izolatów. Szczepy bakterii redukujących siarczany składały się z D. piger (39 izolatów), D. fairfieldensis (19 izolatów) i D. desulfuricans (jeden izolat). Częstość występowania D. piger była istotnie większa u pacjentów z zapalną chorobą jelit (55%) w porównaniu do osób zdrowych (12%) lub pacjentów z innymi objawami (25%) (P<0,05).

1 Wprowadzenie

choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) są przewlekłymi zapalnymi chorobami jelit (IBD) o nieznanej etiologii, ale prawdopodobnie zależą od czynników środowiskowych, genetycznych i odpornościowych . Zaproponowano pochodzenie zakaźne, a wiele mikroorganizmów zostało zamieszanych w brak przekonujących argumentów. Jednak w obu zespołach zapalenie jelit reaguje na antybiotykoterapię. W zwierzęcych modelach przewlekłego zapalenia jelita grubego Flora luminalna jest niezbędnym kofaktorem choroby . Może to tłumaczyć ponowne zainteresowanie rolą flory jelitowej jako przyczyny tych zaburzeń .

bakterie redukujące siarczany (SRB) są beztlenowymi mikroorganizmami, które przeprowadzają odmienną redukcję siarczanów w celu uzyskania energii, co powoduje uwalnianie dużej ilości siarczku. Są one powszechnie izolowane ze źródeł środowiskowych, ale są również obecne w przewodzie pokarmowym zwierząt i ludzi. Jako Desulfomonas pigra został przeklasyfikowany na desulfovibrio piger comb. listopad , ludzkie Izolaty SRB składają się prawie wyłącznie z gatunków Desulfovibrio . Ostatnie odkrycia sugerują, że SRB może odgrywać rolę w chorobach ludzkich. Były one związane z nasileniem klinicznym ludzkiego zapalenia przyzębia i izolowane z głębokich ropni (brzucha lub mózgu), krwi lub moczu . W tych warunkach większość szczepów została zidentyfikowana jako Desulfovibrio fairfieldensis, niedawno zaproponowany nowy gatunek, przez sekwencjonowanie genu rybosomalnego RNA 16S (16S rDNA). Desulfovibrio desulfuricans-gatunek typowy rodzaju Desulfovibrio, wyodrębniony również z okazów ludzkich . Sugerowano implikację SRB w IBD, ponieważ ich metaboliczny produkt końcowy, siarkowodór, jest związkiem cytotoksycznym . Związek ten może działać poprzez hamowanie utleniania maślanu, głównego źródła energii dla kolonocytów. Upośledzenie funkcji nabłonka jelitowego prowadziłoby do śmierci komórek i przewlekłego zapalenia. Jednak gatunki SRB związane z IBD nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Ich identyfikacja pozwoliłaby na poszukiwanie czynników zjadliwości, jak również ich wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe.

w laboratoriach medycznych SRB rzadko są izolowane z próbek ludzkich z powodu powolnego wzrostu. Kolonie pojawiają się po więcej niż 3 dniach inkubacji i nie są zauważane, są zarośnięte przez towarzyszącą florę, chyba że są dominującym lub jedynym występującym gatunkiem. Tak więc ich wyszukiwanie w kale jest trudne, chyba że używa się określonego medium. Takie media zwykle zawierają związek organiczny (donor elektronów i źródło węgla), siarczan (akceptor elektronów), żelazo i środek redukujący. Wzrost SRB w określonych podłożach kulturowych jest łatwo wykrywany przez czernienie podłoża z powodu produkcji siarkowodoru (H2S), co powoduje powstanie osadu siarczku żelaza. Po wyizolowaniu z próbek klinicznych Identyfikacja na poziomie gatunku może być trudna. Na przykład nie jest możliwe rozróżnienie D. fairfieldensis i D. desulfuricans na podstawie testów fenotypowych. Tak więc amplifikacja genów jest cennym narzędziem do osiągnięcia takiej identyfikacji.

głównym celem tego badania było określenie, które gatunki Desulfovibrio mogą być związane z IBD, jeśli występują. W tym celu do wzrostu SRB z odchodów osób zdrowych i pacjentów hospitalizowanych w oddziale Hepato-Gastro-Enterologii Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy we Francji wykorzystano specjalny płynny środek (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orlean, Francja). Opracowano multiplex PCR do identyfikacji izolatów na poziomie gatunku.

2 Materiały i metody

2.1 pacjenci

kał 41 zdrowych osób (17 mężczyzn i 24 kobiety; średnia wieku 38 lat, zakres 1-101 lat) i 110 pacjentów (67 mężczyzn i 43 Kobiety; średnia wieku 57 lat, zakres 14-100 lat) z oddziału Hepato-Gastro-Enterologii Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy we Francji. Zdrowe osoby konsultowane kolejno w celu sprawdzenia. W ich kale nie stwierdzono patogennego mikroorganizmu. Osoby zdrowe i pacjenci nie otrzymywali antybiotyków w miesiącu poprzedzającym pobranie próbki. Pacjentów podzielono na trzy grupy: IBD (N=22) obejmowało 17 CD i 5; inne choroby jelita grubego (n=30) obejmowały 23 pacjentów z łagodnymi lub umiarkowanymi objawami, takimi jak ból brzucha, problemy z tranzytem jelitowym i rektorrhagia, oraz siedmiu pacjentów z rakiem okrężnicy; choroby górnego przewodu pokarmowego (n=58) obejmowały kamicę żółciową, marskość wątroby, raka wątrobowokomórkowego, nowotwory żołądka i trzustki. IBD rozpoznano na podstawie wyników badań klinicznych, endoskopowych i histologicznych. U większości pacjentów z IBD wystąpiła aktywna choroba (Tabela 1).

2.2 wykrywanie i wyliczanie SRB

jeden gram kału zmieszano z 4 ml buforu fosforanowo-fizjologicznego i odwirowano (3000 obr. / min, 5 min). Jeden mililitr supernatantu zaszczepiono natychmiast w cieczy (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orlean, Francja) zgodnie z instrukcją producenta. Krótko mówiąc, zestawy testowe Labège® składają się z fiolek zawierających 9 ml określonego medium (związki organiczne: mleczan i octan, środek redukujący: cytrynian tytanu) kondycjonowane beztlenowo w celu wykrycia SRB. Wstrzykuje się go strzykawką przez gumową nasadkę. To przejrzyste i bezbarwne medium zostało pierwotnie opracowane do wykrywania SRB z próbek środowiskowych. Porównano go z powszechnie stosowanym pożywką stałą Postgate ’ A E (związek organiczny: mleczan, środki redukujące: kwas askorbinowy i kwas tioglikolowy), zaszczepioną równolegle w atmosferze beztlenowej. SRB wyliczano za pomocą długich i wąskich rurek wypełnionych tym drugim medium i zaszczepiano dziesiętnymi rozcieńczeniami kału. Wszystkie zaszczepione media inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 miesiące. Obecność SRB stwierdzono poprzez tworzenie czarnego osadu (siarczku żelaza) w mediach ciekłych i pojawienie się czarnych Kolonii w mediach stałych.

2.3 projektowanie starterów PCR

sekwencje 16s rDNA szczepów Desulfomonas i Desulfovibrio dostępne w bazie danych GenBank porównano przy użyciu oprogramowania Sequence Navigator w wersji 1.0.1 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Pozwoliło to na zaprojektowanie sześciu starterów do identyfikacji przez PCR SRB wcześniej wyizolowanego od ludzi, związanych odpowiednio z D. piger (dawniej Desulfomonas pigra) ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774 i D. fairfieldensis ATCC 700045. D. desulfuricans Essex 6 i D. desulfuricans MB zostały zróżnicowane, ponieważ sekwencje 16S rDNA tych szczepów wykazują różnicę 3%. Startery były 27K-F (5′-CTG CCT TTG ATA CTG CTT AG-3′), 27K-R (5′-GGG CAC CCT CTC GTT TCG GAG a-3′), Essex-F (5′-CTA CGT TGT GCT AAT CAG CAG CGT AC-3′), Fair-F (5′-TGA ATG AAC TTT TAG GGG AAA Gac-3′), Pig-F (5′-CTA GGG TGT TCT AAT Cat CCT AC-3′) oraz P687-R (5′-Gat ATC Tac GGA TTT CAC TCC Tac ACC-3′) (Tabela 2). Specyficzność tych starterów sprawdzono na wszystkich sekwencjach bakterii dostępnych w bazie danych GenBank przy użyciu programu Blast, Wersja 2.0 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA).

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. desulfuricans Essex 6, dwa szczepy związane z D. desulfuricans MB i osiem szczepów zidentyfikowanych jako D. fairfieldensis) zastosowano jako kontrole pozytywne. Czułość PCR oceniano za pomocą rozcieńczeń oznaczonych ilościowo zawiesin szczepów bakterii. Swoistość PCR sprawdzano z negatywnymi kontrolami obejmującymi szczepy typu (Bilophila wadsworthia ATCC 49260T, Desulfovibrio gigas DSM 1382T, Desulfovibrio vulgaris DSM 644T) i wspólne jelitowe szczepy kliniczne należące do następujących gatunków: Bacteroides kruche, Bacteroides merdae, Bacteroides тетайотаомикрон, Bacteroides jednolity, Bacteroides pospolity, Campylobacter chudy, Цитробактер фрейндии, Bakterie nieszkodliwe, Энтеробактер imperium rzymskiego, Enterococcus kału, kałowe Enterococcus, Escherichia coli, Эубактерия mała, Эубактерия lepka, Фузобактерия ядрышковая, Kopenhaga kanału, pałeczka zapalenia окситока, Klebsiella pneumoniae, Morganella morgani, пептострептококк duży, Proteusz wspaniały, Odmieniec pospolity, Providencia stuartii, pseudomonas aeruginosa, Pałeczka marcescens, staphylococcus aureus, gronkowiec naskórkowy i Streptococcus bovis.

pod koniec czasu inkubacji wszystkie 151 zaszczepionych zestawów testowych Labège® sprawdzono za pomocą multiplex PCR. Ekstrakty DNA otrzymano z 500 µl pożywki hodowlanej, po odwirowaniu i wymieszaniu w buforze TE (10 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA, pH 8). Krótko, komórki lizowano stosując kolejno lizozym (3 mg ml-1), SDS (1%, w/v) i proteinazę K (0,25 mg ml−1). Po nocnej inkubacji w temperaturze 37°C DNA ekstrahowano standardową metodą fenol/chloroform/alkohol izoamylowy. Każda mieszanina 50-µl PCR zawierała 5 µl ekstraktu DNA (około 50 ng DNA) i końcowe ilości 0,4 µM każdego startera ,0,8 mM każdego trifosforanu deoksynukleozydu (Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Niemcy), 0,4 mM buforu Tris–HCl, 1,5 mM MgCl2 i 1,5 U polimerazy DNA Taq (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, Wielka Brytania). Wszystkie reakcje przeprowadzono przy użyciu systemu PCR GeneAmp 2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA). Po wstępnym etapie denaturacji wynoszącym 94°C przez 4 minuty następowało 30 cykli denaturacji (94°C, 1 min), wyżarzania (55°C, 1 min) i przedłużania (72°C, 2 min) oraz przedłużania końcowego (72°C, 5 min). W każdym biegu uwzględniono kontrole ujemne (woda zamiast ekstraktu DNA) i dodatnie (ekstrakt DNA D. fairfieldensis). Amplifikowane produkty rozpuszczono przez elektroforezę w 1,5% (w/v) żelach agarozowych zawierających bromek etydyny (1,6 mg ml−1). Jako znacznik wielkości użyto drabiny DNA o długości 100 bp (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, USA). D. piger, D. desulfuricans Essex 6, D. odsiarczki MB i D. fairfieldensis zidentyfikowano odpowiednio w paśmie 255 -, 255 -, 396-i 534-bp. D. piger i D. desulfuricans Essex 6 dodatkowo różnicowano za pomocą oddzielnych testów PCR przy użyciu odpowiednich specyficznych starterów. W przypadku próbek ujemnych przeprowadzono amplifikację 16s rDNA przy użyciu starterów konsensusowych 27F i 1525r w celu sprawdzenia braku hamowania PCRs przez zanieczyszczenia.

3 Wyniki

3.1 wykrywanie i wyliczanie SRB

u osób zdrowych i zgodnie z powyższymi kryteriami, SRB znaleziono w 10 kale (24%) zarówno z Test-kit Labège®, jak i pożywką Postgate ’ a. U pacjentów z oddziału Hepato-Gastro-Enterologii SRB wyhodowano z 42 kałów przy użyciu pożywki Postgate ’ a. Trzy dodatkowe próbki z Test-kit Labège®okazały się pozytywne. Tak więc, spośród 110 badanych pacjentów, SRB wykryto w hodowli u 45 pacjentów (41%). Trzy dodatkowe próbki dały niejednoznaczne wyniki z Test-kit Labège® (obecność ciemnobrązowego osadu). Średni czas wykrycia wzrostu SRB wynosił odpowiednio 2 i 6 dni przy użyciu zestawu testowego Labège® (zakres 1-11 dni) i medium Postgate ’ a (zakres 3-39 dni). Średnia liczba SRB w kale zdrowych osób i pacjentów wynosiła 105 g−1 (Zakres 102-109 g−1). Zatem liczba SRB nie była związana ze stanem klinicznym pacjentów.

3, 2 Identyfikacja SRB metodą Multiplex PCR

czułość testu multiplex PCR wynosiła 100 bakterii na ml. Jego specyficzność została potwierdzona przez brak reakcji krzyżowych pomiędzy czterema zróżnicowanymi genotypami. Każda kontrola pozytywna była pozytywna wyłącznie za pomocą odpowiedniego zestawu starterów. Wszystkie szczepy stosowane jako kontrole negatywne w celu sprawdzenia swoistości, w tym szczepy typu D. gigas i D. vulgaris, dały wyniki negatywne w przypadku czterech zestawów starterów. Specyficzność reakcji została dodatkowo potwierdzona przez sekwencjonowanie produktów amplifikowanych. Uzyskane sekwencje zawsze odpowiadały oczekiwanym. W przypadku próbek ujemnych metodą PCR, amplifikacja 16s rDNA pozwoliła wyeliminować możliwość hamowania PCRs przez zanieczyszczenia.

u pacjentów z oddziału Hepato-Gastro-Enterologii 45 dodatnich i trzy niejednoznaczne odchody dawały pozytywne wyniki metodą PCR. Odpowiadały one D. piger (N = 33), D. fairfieldensis (n=14) lub obu (n=1). Nie wykazano D. odsiarczania (Tabela 3). Kolby ujemne w hodowli były również ujemne przez PCR.

3.3 pokrewieństwo gatunków Desulfovibrio z IBD

rozmieszczenie gatunków nie różniło się znacząco w porównaniu z osobami zdrowymi i pacjentami z nieswoistymi chorobami jelit. „D. piger” był prawie bardziej rozpowszechniony niż „D. fairfieldensis”. Odwrotnie, u pacjentów z IBD, D. piger był 4 razy częstszy niż D. fairfieldensis. Różnica ta była szczególnie zauważalna w przypadku CD, ponieważ pacjenci z IBD składali się głównie z pacjentów z CD. Ponadto częstość występowania D. piger był istotnie wyższy u pacjentów hospitalizowanych z powodu IBD w porównaniu do osób zdrowych lub pacjentów hospitalizowanych z powodu innych patologii (P< 0,05). Nie stwierdzono związku pomiędzy stadium choroby a obecnością SRB. Terapia nie zmieniała szybkości izolacji tych bakterii.

4 dyskusja

obecność SRB w przewodzie pokarmowym zwierząt i ludzi jest rozpoznawana od dawna, choć identyfikacji na poziomie gatunku rzadko dokonywano. Nasze wyniki potwierdzają, że bakterie te są powszechnymi mieszkańcami przewodu pokarmowego człowieka. Większość badań nad jelitowym SRB u pacjentów z IBD opierała się na analizie mikrobiologicznej próbek kału opartej na uprawie, dlatego zidentyfikowali SRB na poziomie rodzaju . Jednak ostatnie badania sugerują, że możliwa rola SRB w patogenezie IBD może być związana z fizjologicznymi i/lub filogenetycznymi różnicami między szczepami SRB . Dlatego opracowaliśmy multiplex PCR, aby zidentyfikować te bakterie na poziomie gatunku. Biorąc pod uwagę trudność izolacji i rzadkość specyficznych poszukiwań, częstość występowania SRB w próbkach klinicznych u ludzi jest z pewnością niedoceniana. Test-kit Labège®, opracowany do wykrywania SRB z próbek środowiskowych, okazał się odpowiednim medium do wykrywania SRB z kału, jak również z płynów ustrojowych (loubinoux, niepublikowany wynik). Producent wykazał, że hoduje środowiskowe szczepy SRB, takie jak D. desulfuricans DSM 1926, Desulfotomaculum nigrificans DSM 574T, Desulfobacter postgatei DSM 2034t i Desulfobulbus propionicus DSM 2032t. W naszych rękach okazało się, że jest bardziej wrażliwy niż powszechnie stosowany środek Postgate ’ a, ponieważ u pacjentów wykryto sześć dodatkowych izolatów Desulfovibrio. Pomimo obfitej flory towarzyszącej, Test-kit Labège ® umożliwił szybki wzrost SRB z próbek kału, ponieważ średni czas wykrycia wynosił 2 dni (w porównaniu do 6 dni w pożywce Postgate ’ a). Może to być związane z jakością pożywki, ale także z sposobem szczepienia próbek, który zapewnia utrzymanie ścisłej anaerobiozy. W porównaniu z pożywką Postgate ’ a, dodanie octanu do mleczanu poszerza spektrum detekcji, obejmując powoli rosnący octan metabolizujący SRB, taki jak Desulfobacter spp. Ponadto obecność cytrynianu tytanu, który jest bardzo skutecznym środkiem redukującym (potencjał redoks Test-kit Labège® wynosi około -600 mV), pozwala na szybsze wykrywanie większości szczepów SRB.

możliwe jest, że niektóre szczepy SRB nie zostały wykryte przez zestawy testowe Labège®, są zarośnięte przez towarzyszącą florę lub z powodu małej liczby próbek. Jednak Test-kit Labège® jest przystosowany do wzrostu większości SRB, a wszystkie dodatnie kolby zostały zidentyfikowane przez PCR jako D. piger, D. fairfieldensis lub D. desulfuricans. Pomimo czasu inkubacji wynoszącego 2 miesiące nie wykazano żadnych dodatkowych gatunków. Możliwe więc, że nasze odkrycia odpowiadają prawdziwej florze ludzkiej składającej się niemal wyłącznie z D. piger i D. fairfieldensis. D. desulfuricans został wyizolowany raz i został również opisany u ludzi w poprzednim badaniu, ale prawdopodobnie jest rzadkością w przewodzie pokarmowym. W większości przypadków D. piger i D. fairfieldensis wzajemnie się wykluczały. Skojarzenie obu gatunków zaobserwowano tylko raz w przypadku raka okrężnicy. Aby potwierdzić prawie nie nakładające się występowanie D. piger i D. fairfieldensis, pięć Kolonii SRB hodowanych w pożywce Postgate ’ a zostało zidentyfikowanych przez PCR dla każdego pozytywnego testu Labège®. W każdym przypadku uzyskano ten sam wynik i pięć Kolonii należało do tego samego gatunku (dane nie zostały przedstawione). Wykonaliśmy również obserwację 10 pacjentów (pięciu SRB-dodatnich i pięciu SRB-ujemnych) przez 2 miesiące i hodowano stolce co tydzień. Dla każdego pacjenta taki sam wynik (SRB-dodatni lub SRB-ujemny) uzyskano dla wszystkich próbek (dane nie zostały przedstawione). Jednak interesujące byłoby śledzenie pacjentów z IBD przez dłuższy okres czasu w celu ustalenia, czy aktywność choroby ma konsekwencje dla populacji SRB.

D. desulfuricans jest powszechnie izolowany ze środowiska i był również uważany za najbardziej rozpowszechniony gatunek Desulfovibrio u ludzi, aż do ostatniego opisu D. fairfieldensis. Można więc dziwić się bardzo niskiemu występowaniu D. desulfuricans w naszej populacji. Do tej pory D. piger i D. fairfieldensis były izolowane wyłącznie z próbek ludzkich. Tak więc nasze wyniki pokazują, że oba gatunki mogą być specyficzne dla ludzkiego przewodu pokarmowego. Pozostaje to jednak do ustalenia przez konkretne poszukiwania tych bakterii w innych niszach ekologicznych. D. piger został opisany tylko raz i został uznany za rzadkie odkrycie u ludzi. Nasze wyniki wskazują, że może to być najczęstszy SRB w przewodzie pokarmowym. Gatunek ten jednak nigdy nie został opisany w procesach zakaźnych. Wręcz przeciwnie, D. fairfieldensis, najwyraźniej rzadziej spotykany w ludzkich odchodach, został wyizolowany poza światłem okrężnicy ze zbiorów krwi i septycznych . Tak więc D. fairfieldensis może posiadać dodatkowe właściwości inwazyjne w porównaniu z innymi gatunkami Desulfovibrio, co wyjaśniałoby jego odzyskanie z próbek klinicznych. Co ciekawe, w naszej serii pacjentów częstość występowania D. piger w kale jest znacznie wyższa u pacjentów hospitalizowanych z powodu IBD (głównie CD) niż u zdrowych osób lub u pacjentów hospitalizowanych z powodu innych patologii. Może to mieć dwa wyjaśnienia: albo D. piger ma cechy fizjologiczne, które powodują powstawanie zmian i / lub uczestniczą w utrwalaniu przewlekłych procesów zapalnych, lub kolonizacja przez ten gatunek jest preferowana przez lokalne warunki u pacjentów z IBD. Związek SRB z IBD został już opisany . D. piger nie był dalej rozważany od pierwszego opisu w 1976 roku . Zaskakujące jest zatem stwierdzenie, że bakteria ta, uważana za gatunek „niepatogenny”, jest powszechnym mieszkańcem przewodu pokarmowego człowieka i najbardziej rozpowszechnionym gatunkiem SRB u pacjentów z IBD. Należy przeprowadzić dodatkowe badania w celu wyjaśnienia sposobu, w jaki D. piger może być zamieszany w te przewlekłe procesy zapalne.

podziękowania

prace te zostały częściowo wsparte przez Compagnie Française de Géothermie (Orlean, Francja) oraz przez dotację FCT POCTI 36562/ESP / 2000 na rzecz ICP. Jesteśmy wdzięczni nieżyjącemu już Dr Wee Tee (University of Melbourne, Australia) za uprzejme dostarczenie czterech szczepów D. fairfieldensis (w tym szczepu ATCC 700045), a także Prof. D. Raoult (University of Marseille, Francja) za dostarczenie jednego szczepu D. fairfieldensis. Dziękujemy D. Meng i A. M. Carpentier (Laboratoire de Bactériologie-Virologie UMR CNRS 7565) za doskonałą pomoc techniczną, dr A. Dao i Prof. B. Fortier za dostarczanie odchodów od zdrowych osób, a także pielęgniarek z oddziału Hepato-Gastro-Enterologii za ich życzliwość.