dyskusja
metoda cytometrii obrazkowej proponowana w tej pracy wykazuje zdolność do szybkiej i skutecznej analizy autofagii w żywych komórkach w celu przeprowadzenia badań przesiewowych potencjalnych leków, które mogą indukować lub hamować działania autofagowe, takie jak promowanie klirensu nieprawidłowo fałdowanych białek związanych z neurodegeneracją lub hamowanie oporności na leki związane z rakiem. Ograniczenia w obecnych metodach można przezwyciężyć za pomocą cytometrii obrazowej i unikalnych odczynników w celu opracowania nowej metody wykrywania autofagii. Celometr Vision był wcześniej używany do fluorescencyjnych testów komórkowych (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et al., 2011) oraz wykazano, że barwnik autofagii Cyto-ID specyficznie zabarwia autofagosomy w żywych komórkach. W tej pracy wykazano, że barwnik Cyto-ID kolokalizuje się za pomocą RFP-LC3 w zagłodzonych komórkach HeLa, co dodatkowo potwierdza specyficzność barwnika. Opracowana oparta na obrazie metoda autofagii jest porównywana ze standardową cytometrią przepływową poprzez porównanie wyników aktywności autofagii w głodnych składników odżywczych komórkach Jurkata. Wyniki wykazały wzrost intensywności fluorescencji w komórkach głodnych składników odżywczych i spadek odzyskanych komórek Jurkata. Jednak zmierzone wartości AAF cytometrii obrazowej są znacznie wyższe niż cytometrii przepływowej, co może być spowodowane różnicami między oprzyrządowaniem i metodami. Celometr Vision image cytometer wykorzystuje urządzenie sprzężone z ładunkiem do pomiaru fluorescencji, podczas gdy cytometr przepływowy FACS Calibur wykorzystuje rurkę fotointerpretacyjną (PMT). Ponadto metoda analizy intensywności fluorescencji również różniła się między tymi dwoma systemami. Cytometr przepływowy mierzy całkowite sygnały fluorescencyjne z każdej komórki, podczas gdy system oparty na obrazie pozyskuje obrazy i analizuje fluorescencyjnie zabarwione autofagosomy w komórkach, co może zapewnić dokładniejsze pomiary aktywności autofagii. Oprogramowanie Cellometer może analizować fluorescencję komórek, sumując całkowite fluorescencyjne piksele w każdej komórce lub mierząc tylko piksele o wysokiej intensywności fluorescencji z autofagosomów w każdej komórce. Inna różnica może być spowodowana stresem ścinającym cytometrii przepływowej wpływającym na żywotność komórek docelowych(Robey et al., 2011).
strumień Autofagiczny jest również ważnym testem dla opracowania nowej metody wykrywania. CQ stosuje się w celu zahamowania lizosomalnej degradacji autofagosomów, gdzie aktywność autofagowa byłaby najwyższa dla głodnych składników odżywczych komórek Jurkata w obecności CQ z powodu synergistycznej interakcji między zabiegami. Następny najwyższy byłby Jurkat komórki w głodzie bez CQ. Jedynie nieznaczne zwiększenie aktywności autofagii byłoby wykazywane przez komórki Jurkata z CQ tylko w porównaniu z grupą kontrolną z powodu nagromadzenia podstawowych autofagolizosomów. Wyniki strumienia autofagicznego uzyskane z obu instrumentów wykazały podobne tendencje, ale wartości AAF zmierzone w cytometrii obrazowej są znacznie wyższe. Wyniki te wykazały, że metoda wykrywania cytometrycznego obrazu może być łatwo wdrożona do badania aktywności autofagii, pomimo potencjalnie specyficznych dla instrumentu różnic ilościowych w wartościach AAF.
w celu wykazania, że cytometria obrazowa może być potencjalną technologią przesiewania odkryć leków, należy przetestować zdolność do analizy próbek w wielu warunkach. Cytometria obrazkowa służy do pomiaru aktywności autofagicznej komórek Jurkata leczonych rapamycyną w różnych stężeniach, aby wykazać zdolność cytometrii obrazkowej do pomiaru efektów zależności dawka-odpowiedź w badaniu czasowym. W rezultacie cytometria obrazowa jest w stanie wykryć różnice w aktywności autofagicznej w różnych warunkach doświadczalnych. Na Rys. 8.6, aktywność autofagiczna (mierzona wartościami AAF) jest najwyższa po 18 h inkubacji. Wykazano nieznaczny spadek wartości AAF między 8 a 4 godziną inkubacji, co może być spowodowane brakiem możliwości pełnego powrotu komórek do zdrowia po początkowym leczeniu farmakologicznym. Ponadto przylegające komórki, takie jak linia komórek ludzkiego raka prostaty (PC-3), można również zmierzyć za pomocą metody cytometrii obrazowej. Rozdzielczość obrazowania widzenia Celometru może analizować fluorescencyjnie znakowane autofagosomy (puncta), obserwowane zarówno w obrazach fluorescencyjnych, jak i histogramach intensywności fluorescencji.
ważne jest również wykazanie zdolności do scharakteryzowania różnych związków leków poprzez porównanie ich autofagicznego efektu dawki–odpowiedzi w kampaniach odkrywania leków. Efekty reakcji na dawkę tamoksyfenu i rapamycyny są bezpośrednio porównywane za pomocą cytometrii obrazowej. Wyniki po 18 h inkubacji wykazały, że rapamycyna indukuje wyższy poziom aktywności autofagii niż tamoksyfen. Ważne jest, aby pamiętać, że tamoksyfen w 100 µM jest wysoce cytotoksyczny, co prowadzi do śmierci komórek Jurkata i rozpadu po 18 h inkubacji. Oparta na obrazie weryfikacja efektu cytotoksyczności w tamoksyfenie w wysokim stężeniu może być bardzo przydatna w eliminowaniu niepewności z wyników wykresu rozproszonego i histogramu.
cytometria obrazkowa wykazała porównywalne wyniki do Standardowej cytometrii przepływowej do analizy fluorescencyjnej opartej na komórkach (Chan et al., 2011; Robey et al., 2011). Metoda cytometrii obrazowej może oferować kilka zalet w stosunku do cytometrii przepływowej. Na przykład liczba komórek wymagana dla każdej próbki (10-20 µL) jest znacznie mniejsza niż w przypadku konwencjonalnego cytometru przepływowego (300-500 µL). Wstępna konfiguracja na cytometrze przepływowym wymaga, aby niektóre próbki komórek docelowych były wykorzystywane do napięć PMT i regulacji kompensacji. Z drugiej strony, Wiele cytometrów obrazowych pipetuje komórki do komory zliczającej, którą można wielokrotnie skanować ponownie. Dlatego próbki komórek docelowych nie są marnowane podczas początkowej optymalizacji regulacji czasu ekspozycji i ustawiania ostrości. Co ważniejsze, zaleta przechwytywania obrazów BR i fluorescencyjnych pozwala badaczom wizualnie zweryfikować Uzyskane dane fluorescencyjne. Może to pomóc w identyfikacji cytotoksyczności jako powikłanego efektu ubocznego testu leczenia farmakologicznego, który indukuje autofagię.
Autofluorescencja może wystąpić przy użyciu zielonego barwnika autofagii Cyto-ID z powodu plastikowej Komory liczenia, ale oprogramowanie może automatycznie usunąć sygnał tła, aby uzyskać rzeczywistą docelową fluorescencję bez zmiany obliczeń AAF. Ponadto, fotoblodzenie sond fluorescencyjnych w testach komórkowych jest zminimalizowane, ponieważ Celometr Vision wykorzystuje diody LED o niższej mocy w porównaniu do laserów o dużej mocy stosowanych w innych instrumentach. Przyszłą poprawą cytometru obrazu komórkowego byłoby opracowanie zautomatyzowanego systemu o wyższej przepustowości, który może analizować więcej komórek w celu ulepszonej analizy statystycznej, a także zdolność do analizy wielu próbek jednocześnie, ułatwiając badania przesiewowe leków na bazie komórek o wyższej przepustowości inhibitorów i aktywatorów autofagii, apoptozy, martwicy i innych zjawisk fizjologicznych będących przedmiotem zainteresowania.