DNA Triple helix formation: a potential tool for genetic repair

*Autor korespondencyjny: D. V. Kohli
Department of Pharmaceutical Sciences, Dr. Hari Singh Gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, Indie
e-mail:

Abstract

DNA triple helices offer new perspectives towards oligonucleotide-directed gene regulation. Oligonukleotydy tworzące potrójną helisę, które wiążą się z dwuniciowym DNA, są szczególnie interesujące, ponieważ są ukierunkowane na sam gen, a nie na jego produkt mRNA (jak w strategii antysensownej). Jednak słaba stabilność niektórych z tych struktur może ograniczyć ich stosowanie w warunkach fizjologicznych. Specyficzne ligandy mogą interkalować w potrójne helisy DNA i je stabilizować. Niniejszy przegląd podsumowuje ostatnie postępy w tej dziedzinie, jednocześnie podkreślając główne przeszkody, które pozostają do pokonania, zanim możliwe będzie zastosowanie technologii triplex do terapeutycznej naprawy genów.

tworzenie potrójnej helisy (rys. 1) Ostatnio jest przedmiotem dużego zainteresowania ze względu na możliwe zastosowanie w opracowywaniu nowych narzędzi biologii molekularnej, a także środków terapeutycznych i ze względu na możliwe Znaczenie struktur H-DNA w systemach biologicznych . W strukturach międzycząsteczkowych Sekwencja oligopirymidynowo-oligopurynowa dupleksu DNA jest związana oligonukleotydem o trzeciej nici w głównym rowku .

opisano dwa główne typy potrójnych Helis, w zależności od orientacji trzeciej nici . Pierwsze zgłoszone kompleksy potrójnej helisy obejmowały pirymidową trzecią nić, której Wiązanie opiera się na wiązaniach wodorowych Hoogsteena między parą zasad T-A i tyminą oraz między parą zasad C-G i protonowaną cytozyną . Oligonukleotyd zawierający (T, C) wiąże się równolegle z nicią oligopuryny w tzw. motyw pirymidyny. Druga kategoria potrójnych Helis zawiera puryny w trzeciej nici, która jest zorientowana antyrównolegle do nici oligopuryny. Trójniki zasadowe C·G×G i T * A×A powstają po odwrotnym schemacie wiązania wodorowego Hoogsteena . Oligonukleotydy zawierające T I G mogą również tworzyć potrójne helisy, których orientacja zależy od sekwencji zasadowej .

tworzenie potrójnej helisy oferuje bezpośredni sposób selektywnej manipulacji ekspresją genów w komórkach, gdzie potrójne helisy DNA oferują nowe perspektywy w kierunku regulacji genów ukierunkowanych na oligonukleotydy (fig. 2). Syntetyczne triple helix forming oligonucleotides (TFOs) wiążą się z wysokim powinowactwem i swoistością do nici purynowej w głównym rowku sekwencji homopuryny – homopirymidyny w dwuniciowym DNA .

TFO są dobrymi kandydatami do stosowania jako specyficznych dla danego miejsca środków wiążących DNA i są badane pod kątem ich zastosowania jako potencjalnych środków terapeutycznych. Badano je w zastosowaniach antysensownych, gdzie są przeznaczone do celowania w mRNA, w aplikacjach antygenowych, gdzie kontrolują ekspresję genu poprzez tworzenie potrójnej helisy, oraz w aplikacjach, które celują w białka, gdzie są używane jako aptamery .

TFOs mogą być również stosowane w terapii genowej, gdzie celują w sekwencję DNA zmutowanego genu, aby zapobiec jego transkrypcji. Receptory bogate w purynę często znajdują się w regionach promotora genów i wykazano, że TFO skierowane do tych miejsc regulacyjnych selektywnie redukują transkrypcję docelowych genów, prawdopodobnie poprzez blokowanie wiązania aktywatorów transkrypcyjnych i/lub tworzenie kompleksów inicjacyjnych. Modulacja transkrypcji za pośrednictwem Triplex ma potencjalne zastosowanie w terapii, ponieważ może być stosowana; na przykład w celu zmniejszenia poziomu białek uważanych za ważne w procesach chorobowych. TFOs mogą także używać jako molekularnych narzędzi dla studiować gene wyrażenie i oni okazali być skuteczni w różnorodni gene targeting strategie w żywych komórkach. TFOs może wiązać się z regionami polipuryny / polipirymidyny w DNA w sposób specyficzny dla sekwencji. Specyfika tego wiązania podnosi możliwość wykorzystania formacji triplex do ukierunkowanej modyfikacji genomu, z ostatecznym celem naprawy wad genetycznych w komórkach ludzkich. Kilka badań wykazało, że leczenie komórek ssaków TFOs może powodować naprawę i rekombinację DNA w sposób, który można wykorzystać do wprowadzenia pożądanych zmian sekwencji. Opisano szereg badań, w których oligonukleotydy były wykorzystywane jako związki antygenowe w komórkach .

Tworzenie potrójnej helisy DNA

Tworzenie potrójnej helisy jest wynikiem wiązania oligoinukleotydów o wysokiej swoistości rozpoznawania głównego rowka podwójnego helisy DNA poprzez tworzenie wiązań typu Hoogsteena z zasadami purynowymi par zasad Watsona-Cricka, związku racjonalnie zaprojektowanego do sztucznej regulacji ekspresji genów . Tworzenie Triplex wymaga jonów Mg2+, podczas gdy jest hamowane przez jony K+.

w strategii potrójnej helisy lub antygenu, oligonukleotyd wiąże się w głównym rowku dwuniciowego DNA poprzez wiązanie wodorowe Hoogsteena, tworząc potrójną helisę . TFOs wiążą sekwencje homopuryny-homopirymidyny w dwuniciowym DNA. Istnieją cztery motywy strukturalne dla formacji triplex, które zostały opisane w oparciu o kompozycję trzeciej nici i jej orientację w stosunku do bogatej w purynę nici duplex. Motyw purynowy TFOs (te, które składają się z G i A) tworzą trojaczki G*G:C i A*A:T i wiążą się w orientacji antyrównoległej w odniesieniu do nici purynowej dupleksu. Z drugiej strony, TFOs z motywem pirymidyny (C/T) tworzą trypleksy w orientacji równoległej i na ogół tylko przy niskim pH ze względu na konieczność protonowania zasad cytozyny w celu utworzenia wiązań Hoogsteena; tworzą trojaczki C+*G:C i T*A:T. Na koniec, zmieszane TFOs purynowe i pirymidynowe wiążą się w orientacji równoległej lub antyrównoległej i tworzą trojaczki G*G:C i T*A:T. Orientacja, w jakiej wiąże się motyw mieszany TFOs, zależy od liczby stopni GPA i ApG w układzie homopurynowym . Orientacja antyrównoległa jest preferowana przez większą liczbę kroków, podczas gdy mała liczba kroków sprzyja orientacji równoległej .

Po ustaleniu najlepszego motywu do wiązania określonej sekwencji docelowej problemy z naturalnymi oligonukleotydami fosfodiestrowymi ograniczają powodzenie podejścia antygenowego i zastosowania terapeutyczne oligonukleotydów w ogóle. Oligonukleotydy z naturalnym szkieletem fosfodiestru są podatne na endo i egzonukleazy. Dominującą aktywnością degradującą oligonukleotydy jest aktywność 3 ’ – egzonukleazy, ale aktywność endonukleazy zaobserwowano również w niektórych warunkach . Tak więc, do zastosowania jako środki terapeutyczne in vivo TFOs muszą być w stanie oprzeć się zarówno aktywności egzonukleazy, jak i endonukleazy, aby osiągnąć swój cel. Do zastosowań TFOs in vivo wymagana jest modyfikacja szkieletu, która nadaje oporność na nukleazy, ale umożliwia wiązanie się z dwuniciowym DNA o wysokim powinowactwie.

oligomery morfolino Fosforodiamidatu są zmodyfikowanymi oligonukleotydami szkieletowymi, które wcześniej były badane jako środki antysensowne . Oligonukleotydy morfolino mają niezaładowany szkielet, w którym cukier deoksyrybozowy DNA jest zastępowany sześcioczłonowym pierścieniem, a wiązanie fosfodiestrowe jest zastępowane wiązaniem fosforodiamidowym (fig. 3). Oligonukleotydy morfolino są odporne na degradację enzymatyczną i wydają się działać jako środki antysensowne przez zatrzymanie translacji lub zakłócanie splicingu pre-mRNA, a nie przez aktywację RNazy H . Zostały one pomyślnie dostarczone do komórek hodowli tkankowej metodami, które fizycznie zakłócają błonę komórkową, a jedno z badań porównujących kilka z tych metod wykazało, że ładowanie zeskrobowe było najbardziej skuteczną metodą dostarczania; jednak, ponieważ szkielet morfolino jest nieobciążony, lipidy kationowe nie są skutecznymi mediatorami wychwytu oligonukleotydu morfolino w komórkach . Niedawny raport wykazał tworzenie triplex przez oligonukleotyd morfolino, a ze względu na niejonowy szkielet, badania te wykazały, że oligonukleotyd morfolino był zdolny do tworzenia triplex przy braku magnezu .

wykazano, że kationy odgrywają ważną rolę w tworzeniu potrójnej helisy. Gdy fosfodiestrowe oligonukleotydy są używane jako TFOs, magnez jest na ogół wymagany do tworzenia triplex z puryną i mieszanym motywem TFOs; przyspiesza również reakcję i stabilizuje triplex utworzony z motywem pirymidyny TFOs . Wykazano, że inne kationy dwuwartościowe działają w takiej samej zdolności jak magnez w odniesieniu do tworzenia triplex . Magnez występuje w stężeniu ~0,8 mM w komórce i ~1,5 mM we krwi , ale większość reakcji triplex In vitro przeprowadza się w 5-10 mM MgCl2. Potas występuje w komórce przy stężeniu ~140 mM, a we krwi przy 4 mM. Wysokie stężenia potasu mogą hamować tworzenie triplex z bogatymi w guaninę oligonukleotydami zaprojektowanymi jako TFOs poprzez faworyzowanie innych drugorzędowych struktur DNA, takich jak dimery i czworościany . Konieczne będzie przezwyciężenie ograniczonej zdolności Fosfodiestru TFOs do tworzenia triplex w niskiej zawartości magnezu i wysokiej zawartości potasu, aby były skuteczne w warunkach fizjologicznych. W niedawnym badaniu Morfolino TFOs wykazano powstawanie triplex przy braku magnezu i w obecności potasu. Te właściwości sprawiają, że Morfolino TFOs są dobrymi kandydatami do dalszych badań jako leki antygenowe.

modelowanie molekularne

struktura Triplex DNA może być skonstruowana za pomocą technik modelowania molekularnego za pomocą współrzędnych,które prawidłowo uwzględniają konformację cukrową potrójnych Helis (T, C)-motif . Struktura ta jest bliższa dna w formie B, jak donoszono w badaniach NMR, w porównaniu do struktury proponowanej, opartej na dyfrakcji rentgenowskiej włókien. Program JUMNA umożliwia konstruowanie struktur DNA zgodnie z ich parametrami spiralnymi . Miejsce interkalacji można łatwo utworzyć w trójplexie, podwajając parametr wzrostu dla dwóch sąsiednich trójników bazowych T·A×T (wzrost = 6,8 Å), a następnie zmniejszając parametr skręcenia między tymi dwoma trójnikami z 34° do 16°, aby zmniejszyć ograniczenia odległości wiązania.

wykorzystując modelowanie molekularne, można wykazać możliwość utworzenia równoległej potrójnej helisy, w której pojedyncza nić oddziałuje z nienaruszonym dupleksem w mniejszym rowku, poprzez nowe interakcje zasadowe .

JUMNA wykorzystuje mieszaninę współrzędnych spiralnych i wewnętrznych (kąty walencyjne i dihedralne) do opisu elastyczności kwasu nukleinowego. Parametry spiralne pozycjonują każdy 3 ’ monofosforanowy nukleotyd względem układu o stałej osi. Połączenia między kolejnymi nukleotydami są utrzymywane z ograniczeniami kwadratowymi na odległościach O5 ’- C5′. Oprócz zmniejszonej liczby zmiennych w odniesieniu do kartezjańskich programów współrzędnych, wybór fizycznie znaczących zmiennych umożliwia Duże, uzgodnione ruchy konformacyjne podczas minimalizacji, wraz z efektywną kontrolą struktury i łatwym wprowadzeniem ograniczeń lub ograniczeń. Dostępne narzędzia obejmują zarówno mapowanie adiabatyczne, jak i wyszukiwanie kombinatoryczne w odniesieniu do wybranych parametrów strukturalnych. Do specyfiki pola siłowego Flex należy obecność specyficznego terminu uwzględniającego zależność kątową wiązania wodorowego oraz możliwość przesiewania energii elektrostatycznej za pomocą sigmoidalnej funkcji dielektrycznej , ε (R) =D-(D-D0)/2 exp (-RS), gdzie R jest odległością między dwoma ładunkami. Nachylenie s, wartość plateau w dużej odległości D i wartość początkowa D0 funkcji są regulowane, z domyślnymi wartościami odpowiednio 0,16, 80 i 1,przy użyciu dwóch założeń już zastosowanych do budowy potrójnej helisy z małym rowkiem . Po pierwsze, trójki bazowe są ograniczone do współpłaszczyzny, aby uniknąć ewentualnych interakcji między trójkami bazowymi. Takie interakcje łatwo tworzą się podczas budowy rozciągniętych Helis, ale nie mogą odgrywać roli w rozpoznawaniu lub wymianie nici, ponieważ procesy te są niezależne od ogólnej sekwencji. Sprawdzono, że zoptymalizowana struktura triplex z niewielkim rowkiem jest niezależna od tych ograniczeń. Drugim założeniem, zgodnym ze stechiometrią kompleksów RecA/ DNA, które pokazuje trzy nukleotydy na monomer RecA, jest zastosowanie symetrii spiralnej trinucleotide. Z tego powodu wstępne badania ograniczono do sekwencji z powtórzeniem trinukleotydu.

do budowy i manipulacji triplex potrzebne są określone ograniczenia lub ograniczenia. Należą do nich ograniczenia” plateau ” i ograniczenia symetrii trinucleotide, opisane wcześniej . Powściągliwość „plateau” utrzymuje współplanarność baz tworzących triplet, jednocześnie umożliwiając obroty i przemieszczenia wymagane do przełączania par bazowych. Ograniczenie symetrii trinucleotide implikuje równoważność zmiennych opisujących każdą kolejną grupę trzech nukleotydów. Rozciąganie dsDNA w taki sposób, że skręt zmniejsza się, a niewielki rowek otwiera się, zostało wcześniej osiągnięte przez ograniczenie odległości między końcowymi atomami O3′ jednostki symetrii trinukleotydowej. Ogranicznik ten został nieznacznie zmodyfikowany, ponieważ odległość O3′ – O3 ’ może być zmieniona przez boczne przemieszczenie kości grzbietowych podczas wymiany nici. W niedawnej pracy ograniczono jedynie składową wektora O3 ’- O3 ’ równoległą do osi helisy. Ograniczniki szerokości rowka, skalibrowane za pomocą numerycznych obliczeń elektrostatycznych Poissona-Boltzmanna, zostały wykorzystane w celu uniknięcia zwężenia rowka z powodu braku wyraźnych cząsteczek rozpuszczalnika .

przełączanie par zasad jest badane przez rotację bazy, przy użyciu podejścia zdefiniowanego przez Berneta i wsp . Polega to na ograniczeniu kąta θ między wiązaniem glikozydowym (puryna: C1′-N9 lub pirymidyna: C1′-N1) a wektorem łączącym dwa atomy C1′ pary zasad, rzutowanym na płaszczyznę prostopadłą do lokalnej osi spiralnej. θ ma wartość 55° w kanonicznym B-DNA. Modelowanie przełączania pary bazowej dla wybranej bazy obejmuje adiabatyczną zmianę θ od 65° do 10° o stopnie 2° przy zachowaniu zarówno” plateau”, jak i ograniczeń rozciągania.

przeszkody i ograniczenia napotkane w tworzeniu potrójnej helisy

biologiczne zastosowania TFOs są zagrożone przez podstawowe względy biofizyczne, a także ograniczenia narzucone przez Warunki fizjologiczne. Tworzenie Triplex obejmuje podejście i Wiązanie ujemnie naładowanej trzeciej nici do podwójnie ujemnie naładowanego dupleksu. Neutralizacja odpychania ładunku jest zwykle zapewniana doświadczalnie przez poziomy Mg++ (5-10 mM), które są znacznie wyższe niż to, co uważa się za Dostępne w komórkach . Ponadto, formacja triplex obejmuje zmiany konformacyjne na części trzeciej nici i pewne zniekształcenia leżącego pod nią dupleksu . Tripleksy motywu pirymidyny są niestabilne w fizjologicznym pH ze względu na zapotrzebowanie na protonację cytozyny, która występuje przy stosunkowo kwaśnym pH (pKa = 4,5). Jest to konieczne dla drugiego wiązania wodorowego Hoogsteena, chociaż wynikający z niego ładunek dodatni najwyraźniej ma większy wpływ na stabilność triplex . Tripleksy z motywem pirymidyny zawierające sąsiadujące cytozyny są często mniej stabilne niż te z izolowanymi cytozynami. Tradycyjnie przypisuje się to efektowi odpychania ładunku, chociaż ostatnie badania sugerują, że krytycznym czynnikiem może być niepełna protonacja sąsiednich cytozyn . Dodatkowo, trzecie nitki motywu purynowego (które są bogate w G) mogą tworzyć Tetrad G w fizjologicznym poziomie K+, które hamują tworzenie triplex . Wszystkie te czynniki nakładają bariery kinetyczne na tworzenie tripleksu i zmniejszają stabilność tripleksów po uformowaniu (większość tripleksów, nawet w optymalnych warunkach in vitro, jest mniej stabilna niż podstawowy duplex .

strategie przeciwdziałania ograniczeniom

pierwszym i najważniejszym problemem napotkanym w strategii antygenowej triple helikalnej jest niestabilność triplexu utworzonego przez TFOs w warunkach fizjologicznych, co w konsekwencji ogranicza wykorzystanie tej fascynującej strategii przeznaczonej do korekcji genów w zmiennym stopniu. Stąd różne podejścia i strategie zostały zaproponowane w celu nadania stabilności potrójnej struktury spiralnej utworzone.

potrójne helisy skierowane do oligonukleotydów można stabilizować za pomocą ligandów kwasu nukleinowego, które selektywnie stabilizują potrójne helisy. Na przykład wykazano, że bromek etydyny wiąże i stabilizuje potrójną helisę wykonaną z poli (dt)·poli (dA)× poli (DT), która zawiera tylko trojaczki T * A×T. Jednak związek ten słabo stabilizuje (lub nawet destabilizuje) potrójne helisy zawierające zarówno trójki zasadowe T·A×T, jak i C * G×C+, prawdopodobnie w wyniku odpychania elektrostatycznego . Pochodne benzopirydoindolu były pierwszymi cząsteczkami, które silnie stabilizowały ten drugi typ potrójnych Helis, mimo że preferują odcinki T * A×T. Wykazano również, że kilka innych interkalatorów, a także różne ligandy drobnych rowków DNA wiąże się z potrójnymi helisami DNA. Na przykład potrójne helisy mogą być stabilizowane przez chemiczną modyfikację oligonukleotydów, taką jak wykazano, że psoralen przyłączony do oligonukleotydów zwiększa ich aktywność biologiczną po napromieniowaniu UV . Interkalatory Zwykle stabilizują w większym stopniu potrójne helisy zawierające trójki T * A×T, podczas gdy mniejsze spoiwa rowkowe Zwykle destabilizują trójki, z wyjątkiem szczególnego przypadku, gdy potrójna helisa angażuje nić RNA . Ponieważ nie są dostępne dane strukturalne dotyczące kompleksów triple helix-ligand, niewiele wiadomo o oddziaływaniach, które kierują specyficzną interkalację w potrójne helisy. Wykazano, że pochodne BPI interkalują między trójkami zasadowymi T * A×T przez przeniesienie energii fluorescencji wzbudzenia z trójek zasadowych do ligandów oraz przez liniowy i kołowy dichroizm . Stwierdzono, że pirymidynowo-równoległe oligonukleotydy morfolinowe mogą tworzyć triplex z celem duplex. Zgodnie z oczekiwaniami, motyw ten wymagał niskiego pH do tworzenia triplex, zgodnie z wymaganiami fosfodiestru TFO z motywem pirymidynowo-równoległym. Możliwe jest przezwyciężenie tej zależności pH z takimi podstawieniami jak 5-metylocytozyna dla cytozyn w TFO .

alternatywnym podejściem, dzięki któremu można stabilizować potrójne helisy, jest chemiczne modyfikacje oligonukleotydów, takie jak kowalencyjne przyłączenie cząsteczki akrydyny . Wykazano, że podstawienie akrydyny silnie zwiększa hamowanie rozszczepiania enzymu restrykcyjnego, a także nie zaburza swoistości sekwencji w tworzeniu triplex .

zastosowania potrójnej helisy DNA

tworzenie międzycząsteczkowych potrójnych Helis DNA oferuje możliwość projektowania związków o rozległych właściwościach rozpoznawania sekwencji, które mogą być przydatne jako środki antygenowe lub narzędzia w biologii molekularnej . W ciągu ostatniej dekady w chemii medycznej pojawia się nowe podejście wykorzystujące analogi DNA jako środki terapeutyczne. Polega to na regulacji ekspresji genów białek/enzymów związanych z chorobą poprzez blokowanie ich transkrypcji (antygen) lub translacji (antysens) (fig. 4). Wpływa na to poprzez specyficzne dla sekwencji Wiązanie komplementarnych oligonukleotydów do dupleksu DNA poprzez tworzenie triplex w celu hamowania produkcji mRNA lub zakłócania translacji tych ostatnich do białek. Ponieważ oligonukleotydy nie dostają się łatwo do komórek i są podatne na niszczenie przez nukleazy komórkowe, różne chemicznie zmodyfikowane analogi oligonukleotydów są projektowane, syntetyzowane i oceniane pod kątem rozwoju jako środki terapeutyczne.

specyficzne rozpoznawanie regionów homopuryny-homo pirymidyny w DNA duplex przez Oligonukleotydy tworzące triplex (TFOs) stanowi atrakcyjną strategię manipulacji genetycznej, której ostatecznym celem jest naprawa wad genetycznych w ludzkich komórkach. Zdolność do celowania mutacji może okazać się przydatna, jako narzędzie do badania naprawy DNA, oraz jako technika terapii genowej i inżynierii genetycznej .

opracowano efektywne narzędzia oparte na potrójnych helisach do różnych zastosowań biochemicznych, takich jak rozwój wysoce specyficznych sztucznych nukleaz. Strategia antygenowa pozostaje jedną z najbardziej fascynujących dziedzin zastosowania triplex do selektywnej kontroli ekspresji genów (Tabela 1). Ukierunkowanie sekwencji genomowych okazało się obecnie cenną koncepcją w wciąż ograniczonej liczbie badań; lokalna mutageneza jest pod tym względem interesującym zastosowaniem oligonukleotydów tworzących triplex na kulturach komórkowych .

Table 1: Badania kwasów nukleinowych antygenów w komórkach Eukariotycznych80

strategie antygenowe koncentrują się głównie na celowaniu genów przez rekombinację homologiczną lub przez oligodeoksynukleotydy tworzące potrójną helisę . Z wielu powodów technicznych, w tym bardzo ograniczonej dostępności genów w wysoce malariakondensowanej, owiniętej białkami strukturze chromosomalnej, kliniczne zastosowanie tych metod nie postępowało szybko. Kielkopf i wsp. niedawno opisali alternatywne podejście, wykorzystując poliamidy, które mogą dyfundować do jądra i rozpoznawać określone sekwencje DNA . Chociaż jest to bardzo ekscytujące, metodologia ta jest wciąż w powijakach, a jej ostateczna przydatność kliniczna pozostaje nieznana .

zastosowania terapeutyczne technologii antygenowej

Triple helix DNA przyciąga uwagę ze względu na potencjalne zastosowanie TFOs jako środków terapeutycznych, do zastosowań takich jak celowanie wewnątrzkomórkowe genów, jako racjonalne roztwory chemiczne do sekwencjonowania specyficznego rozpoznawania dupleksu DNA i identyfikacji genów odpowiedzialnych za wzrost komórek i transformację złośliwą . Dzięki tej wiedzy pojawiła się naturalna chęć przełożenia tych informacji na nowe, specyficzne dla celu strategie terapeutyczne w leczeniu raka, chorób układu krążenia i innych powszechnych dolegliwości ludzkości (Tabela 2). Niedawny rozwój stosunkowo specyficznego biochemicznego inhibitora białkowej kinazy tyrozynowej bcr/abl u pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową jest oszałamiającym przykładem tego dążenia . W przypadku terapii ukierunkowanych bezpośrednio na zastąpienie, naprawę lub wyłączenie genów chorobotwórczych postęp był znacznie wolniejszy i nie udało się jeszcze osiągnąć sukcesu równoważnego biochemicznemu inhibitorowi BCR/abl. Przyczyny tego są złożone i różnią się w zależności od rodzaju terapii genowej jest używany.

Tabela 2: Niektóre choroby podlegające leczeniu za pomocą leków DNA

Stephenson i Zamecnik wykazali, że krótki (13nt) OLIGONUKLEOTYD DNA odwraca komplementarny w sekwencji (antysensowny) do wirusa mięsaka Rous może hamować replikację wirusa w hodowli. Jedną z najważniejszych właściwości antysensownych i antygenowych oligonukleotydów w ich zastosowaniu jako środków terapeutycznych jest ich odporność na nukleazy. Oligonukleotydy fosforotionianowe są najczęstszym rodzajem oligonukleotydów o stosunkowo wysokiej odporności na nukleazy i zostały wprowadzone na rynek jako leki przeciwko indukowanemu przez wirus cytomegalii zapaleniu siatkówki . Oligonukleotydy z pozostałością 2′-O,4′ – C-etylenowego kwasu nukleinowego (ENA) w drugiej pozycji od końca 3 ’ wykazują znacznie większą odporność na nukleazy niż te z pozostałością zamkniętego kwasu nukleinowego (LNA) w tej samej pozycji .

chociaż Kurreck i wsp.donosili , że oligonukleotydy LNA były stabilne w surowicy ludzkiej, częściowo zmodyfikowane OLIGONUKLEOTYDY ENA były znacznie bardziej odporne na nukleazy niż oligonukleotydy lna w osoczu szczurów. Co więcej, oligonukleotydy modyfikowane stycznie resztami ENA na końcu 3′ i 5 ’ wykazują większą stabilność niż te częściowo zmodyfikowane. Tak więc oligonukleotydy ENA mają wysoki potencjał jako środki antysensowne i antygenowe, które można stosować in vivo . Specyficzna dla sekwencji formacja triplex może być stosowana do celowania genów, wyciszania genów i mutagenezy .

perspektywy na przyszłość

Oligonukleotydy mogą wiązać miejsce-konkretnie do docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania poprzez tworzenie potrójnej helisy. Oligonukleotydy tworzące Triplex są obecnie przeznaczone do wiązania się z genem HER-2 (receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2)/ neu, gen, który jest nadmiernie ekspresyjny w szerokiej gamie ludzkich nowotworów, w tym niedrobnokomórkowego raka płuc, raka piersi, raka jajnika i guzów przewodu pokarmowego. Strategia ta będzie miała szerokie zastosowanie w zapobieganiu ekspresji wielu onkogenów lub innych genów związanych z rakiem. Te” antygenowe ” oligonukleotydy są obecnie używane do dostarczania środków alkilujących DNA do określonych zasad w promotorze HER-2/neu i sekwencji kodującej, aby zapobiec inicjacji transkrypcji i wydłużeniu. W szczególności, do dostarczania musztardy azotowej, takiej jak chlorambucyl, do specyficznej Zasady guaniny w genie HER-2/neu zastosowano oligonukleotydy tworzące triplex, aby zapobiec ekspresji genu. Docelowa strategia przeciwnowotworowa obejmująca oligonukleotydy antygenowe sprzężone z aktywnymi lekami DNA okaże się kamieniem milowym w najbliższej przyszłości.

1. Thuong, N. T. and Helene, C., Angew. Chem. Int., 1993, 32, 666
2. Mirkin, S. M. and Frank-Kamenetskii, M. D., Annu. Rev. Biophys.Biomol. Struct., 1994, 23, 541.
3. Patrizia, A., Paola B. A., Jean-Louis, M., Therese G., Claude H. andJian-Sheng S., Nucl. Kwas. Res., 2002, 30, 5407.
4. Sun, J. S. and Helene, C., Curr. Opin. Struct. Biol., 1994, 3, 345.
5. Le Doan, T., Perrouault, L., Praseuth, D., Habhoub, N., Decout, J. L.,Thuong, N. T., Lhomme, J. and Helene, C., Nucl. Kwas. / Align = „left” / 198715
6. Moser, H. E. and Dervan, P. B., Science, 1987, 238, 645.
7. Beal, P. A. i Dervan, P. B., Nauka, 1991, 251, 1360.
8. Pilch, D. S., Levenson, C. and Shafer, R. H., Biochemistry, 1991, 30,6081.
9. DeBizemont, T., Duval-Valentin, G., Sun, J. S., Bisagni, E., Garestier, T. and Helene, C., Nucl. Kwas. Res., 1996, 24, 1136.
10. McGuffie, E. M. and Catapano, C. V., Nucl. Kwas. Res., 2002, 30,12, 2701.
11. Basye, J., Trent, J. O., Gao, D. and Ebbinghaus, S. W., Nucl. Kwas.Res., 2001, 29, 4873.
12. Helene, C. and Toulme, J. J., Biochem. Biophys. Acta., 1990,1049, 99.
13. Helene, C., Eur. J. Rak, 1994, 30, 1721.
14. Stein, C. A. and Cheng, Y. C., Nauka, 1993, 261, 1004.
15. Wagner, R. W., natura, 1994, 372, 333.
16. Praseuth, D., Guieysse, A. L., Helene, C., Biochem. Biophys.Acta., 1999, 1489, 181.
17. Sun, J. S., DeBizemont, T., Duval-Valentin, G., Montenay-Garestier, T. and Helene, C., C. R. Acad. Sci., 1991, 313, 585.
18. Gamper, H. B. J., Kutyavin, I. V., Rhinehart, R. L., Lokhov, S. G., Reed, M. W. and Meyer, R. B., Biochemistry, 1997, 36, 14816.
19. Eder, P. S., DeVine, R. J., Dagle, J. M. and Walder, J. A., AntisenseRes. Dev., 1991, 1, 141.
20. Fisher, T. L., Terhorst, T., Cao, X. and Wagner, R. W., Nucl. Kwas.RES, 1993, 21, 3857.
21. Stein, D., Foster, E., Huang, SB, Weller, D. I Summerton, J. Akiddugdev, 1997, 7, 151.
22. Summerton, J.niemiecki, Stein, D., Juan, S. B., Matthews, P., Weller, D. andpartridge, M., Antisensenukl. Akiddugdev, 1997, 7, 63.
23. Summerton, J.niemiecki Akiddugdev, 1997, 7, 187.
24. chudziak, R. M., Barof, e., Barof, D. F., Weller, D. L., Juan, S. B. i Weller, D. D., Antysensenukl. Akiddugdev, 1996, 6,267.
25. Gosha, K., Stein, D., Weller, D. i Iversen, P., Methodsenzymol., 2000, 313, 135.
26. Giles, R.V., Spiller, D.G., Clark, R.E. and Tidd, D.M., AntisenseNucl. AcidDrugDev., 1999, 9, 213.
27. Ghosh, C. and Iversen, P.L., AntisenseNucl. AcidDrugDev.,2000, 10, 263.
28. Lacroix, L., Arimondo, P.B., Takasugi, M., Helene, C. and Mergny,J.L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 270, 363.
29. Rougee, M., Faucon, B., Mergny, J.L., Barcelo, F., Giovannangeli, C.,Garestier, T. and Helene, C., Biochemistry, 1992, 31, 9269.
30. Maher, L.J., Dervan, P.B. and Wold, B.J., Biochemistry, 1990, 29,8820.
31. Singleton, S.F. and Dervan, P.B., Biochemia, 1993, 32, 13171
32. Blume, S. W., Lebowitz, J., Zacharias, W., Guarcello, V., Mayfield,C. A., Ebbinghaus, S. W., Bates, P., Jones, D. E., Trent, J. andVigneswaran, N., Nucl. Kwas. Res., 1999, 27, 695.
33. Darnell, J., Lodish, H. and Baltimore, D., in; Molecular CellBiologyScientific American Books, New York, 1990, 531.
34. Suda, T., Mishima, Y., Asakura, H. and Kominami, R., Nucl. Kwas.Res., 1995, 23, 3771.
35. Olivas, W. M. and Maher, L. J., Nucl. Kwas. Res., 1995, 23, 1936.
36. Svinarchuk, F., Cherny, D., Debin, A., Delain, E. and Malvy, C., Nucl.Kwas. / Align = „center” / 2,3858
37. Faruqi, A. F., Krawczyk, S. H., Matteucci, M. D. i Glazer, P. M., Nucl. Kwas. Res., 1997, 25, 633.
38. Blume, S. W., Guarcello, V., Zacharias, W. and Miller, D. M., Nucl.Kwas. Res., 1997, 25, 617.
39. Ouali, M., Letellier, R., Adnet, F., Liquier, J., Sun, J. S., Lavery, R. andTaillandier, E., Biochemistry, 1993, 32, 2098.
40. Macaya, R. F., Schultze, P. and Feigon, J., J. Amer. Chem. Soc.,1992, 114, 781.
41. Radhakrishnan, I. and Patel, D. J., Biochemistry, 1994, 33, 11405.
42. Arnott, S., Bond, P. J., Selsing, E. and Smith, P. J. C., Nucl. Kwas./ Align = „center” / 3,2459
43. Lavery, R. and Sklenar, H., J. Biomol. Struct. Dyn., 1988, 6, 63.
44. Bertucat, G., Lavery, R. and Prevost, C., J. Biomol. Struct. Dyn.,1998, 16, 535.
45. Lavery, R., Peyrard, M., Eds. In; Non-Linear Excitation inBiomolecules, Springer-Verlag, Editions de Physique, Berlin and NewYork, 1995, 57.
46. Hingerty, B. E., Richtie, R. H., Ferrell, T. L. and Turner, J. E., Biopolimers, 1985, 24, 427.
47. Bernet, J., Zakrzewska, K. i Lavery, R., J. Mol. Struct.Teochem., 1997, 398-399, 473.
48. Pesco, J., Salmon, J. M., Vigo, J. i Viallet, P., Anal. Biochem.,2001, 290, 221.
49. Gilbert, D. E. and Feigon, J., Curr. Opin. Struct. Biol., 1990, 9, 305.
50. 50. Shimizu, M., Konishi, A., Shimada, Y., Inoue, H., and Ohtsuka, E., FEBS. Lett., 1992, 302, 155.
51. Asensio, J. L., Carr, R., Brown, T. and Lane, A. N., J. Amer.Chem. Soc., 1999, 121, 11063.
52. Asensio, J. L., Lane, A. N., Dhesi, J., Bergqvist, S. and Brown, T., J. Mol. Biol., 1998, 275, 811.
53. Volker, J. and Klump, H. H., Biochemistry., 1994,33, 13502 .
54. Sugimoto, N., Wu, P., Hara, H. and Kawamoto, Y., Biochemistry.,2001, 40, 9396.
55. Arimondo, P. B., Garestier, T., Helene, C. and Sun, J. S., Nucl. AcidRes., 2001, 29, 15.
56. Michael, M., Seidman, M. M. and Peter, M. G., J. Clin.Inwestuj., 2003,112, 487.
57. Panas Scaria, P. V. and Shafer, R. H., J. Biol. Chem., 1991, 266,5417.
58. Mergny, J. L., Collier, D., Rougee, M., Montenay-Garestier, T. andHelene, C., Nucl. Kwas. Res., 1991, 19, 1521.
59. 59. Mergny, J. L., Duval-Valentin, G., Nguyen, C. H., Perrouault, L., Faucon, B., Rougee, M., Montenay-Garestier, T., Bisagni, E. andHelene, C., Science, 1992, 256, 1681.
60. Lee, J. S., Latimer, L. J. P. and Hampel, K. J., Biochemistry, 1993, 32,5591.
61. Park, Y. W. and Breslauer, K. J., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,1992, 89, 6653.
62. Durand, M., Thuong, N. T. and Maurizot, J. C., J. Biol. Chem., 1992,267, 24394.
63. Durand, M., Thuong, N. T. and Maurizot, J. C., J. Biomol. Struct.Dyn., 1994, 11, 1191.
64. Kulka, M., Smith, C. C., Aurelian, L., Meade, K., Miller, P. i Ts ’ o, P. O. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1989, 86, 6868.
65. Chang, E. H., Miller, P. S., Cushman, C., Devdas, K., Pirolo, K. F., Ts ’ op.O.P. i Yu, Z. P., Biochemistry, 1991, 30, 8283.
66. Pilch, D. S. I Breslauer, K. J., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,1994, 91, 9332.
67. Pilch, D. S., Waring, M. J., Sun, J. S., Rougee, M., Nguyen, C. H., BisagniE., Garestier, T. and Helene, C., J. Mol. Biol., 1993, 232, 926.
68. Kim, S. K., Sun, J. S., Garestier, T., Helene, C., Bisagni, E., Rodger, A. and Norden, B., Biopolimers, 1997, 42, 101.
69. Lin, S. B., Kao, C. F., Lee, S. C. I Kan, L. S., AnticancerDrugDes., 1994, 9, 1.
70. Grigoriev, M., Praseuth, D., Robin, P., Hemar, A., Saison-Behmoaras, T., Dautry-Varsat, A., Thuong, N. T. i Helen, C., Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A., 1991, 88, 3389.
71. Grigoriev, M., Praseuth, D., Robin, P., Hemar, A., Saison-Behmoaras,T., Dautry-Varsat, A., Thuong, N. T., Helen, C. and Harel-Bellan, A.,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1992, 267, 3389.
72. Gowers, D. M. and Fox, K. R., Nucl. Kwas. Res., 1999, 27, 1569.
73. 73. Nagatsugi, F., Sasaki, S., Miller, P. S. and Seidman, M. M., Nucl.Kwas. Res., 2003, 15, 31.
74. Melton, D. W., BioEssays, 1994, 16, 633.
75. Helene, C., rak, 1994, 30, 1721.
76. Majumdar, A., Khorlin, A. and Dyatkina, N., Nat. Genet., 1998, 20,212.
77. Kielkopf, C. L., Baird, E. E. and Dervan, P. B., Nat. Struct. Biol.,1998, 5, 104.
78. Alan, M. and Gewirtz, M. D., J. Clin. Oncol., 2000, 18, 1809.
79. Rao, N. R. i Nalluri, B. N., Ind. J. Pharm. Edu., 2003, 37, 132.
80. Varmus, H. E., I. Biosci. / Align = „left” / 1990 10413
81. Fearon, E. R. and Dang, C. V., Current Biol., 1999, 9, R62.
82. Hahn, W. C., Counter, C. M. and Lundberg, A. S., Nature, 1999, 400,464.
83. Druker, B. J. and Lydon, N. B., J. Clin. Inwestuj., 2000, 105, 3.
84. Natl. Acad. Sci.U. S. A., 1978, 75, 285.
85. Geary, R. S., Henry, S. P. and Grillone, L. R., Clin. Farmakokinet.,2002, 41, 255.
86. Morita, K., Hasegawa, K., Kaneko, M., Tsutsumi, S., Sone, J.,Ishikawa, T., Imanishi, T. I Koizumi, M., Bioorg. Miód. Hem., 2002, 12, 73.
87. Kurreck, J., Wyszko, E., Gillen, C. and Erdmann, V. A., Nucl. Kwas.Res, 2002, 30, 1911.
88. Koizumi, M., Morita, K., Daigo, M., Tsutsumi, S., Abe, K., Obika, S. i Imanishi, T., Nukl. Kwas. Res., 2003, 31, 3267.