Abstract
Mikrosporidia są obowiązkowymi wewnątrzkomórkowymi organizmami eukariotycznymi występującymi w szerokim zakresie żywicieli kręgowców i bezkręgowców. Encephalitozoon cuniculi jest powszechnie spotykany u królików domowych i gryzoni, a także występuje u psów, inne psiaki, i naczelne, w tym ludzi. Sekwencjonowanie DNA rybosomalnych genów RNA zostało wykorzystane do identyfikacji tych pasożytów do poziomu gatunkowego i zdefiniowania szczepów i, II i III E. cuniculi. osiem nowych izolatów psów zostało scharakteryzowanych jako szczep III E. cuniculi przy użyciu metod molekularnych. Szczep ten został również zidentyfikowany w izolatach od ludzi z obniżoną odpornością, co sugeruje potencjał odzwierzęcy tego gatunku pasożytów. Donoszono również o przedłużonym zrzucaniu zarodników mikrosporydialnych z psów bezobjawowych.
Encephalitozoon cuniculi jest obowiązkowym wewnątrzkomórkowym pierwotniakiem z rodziny Microspora i jest częstym pasożytem królików domowych i gryzoni. Sporadycznie te pasożyty były zgłaszane u innych gospodarzy, w tym psów, lisów niebieskich (Alopex lagopus) i niewielkiej liczby innych dzikich zwierząt mięsożernych . Coraz więcej doniesień opisuje również kliniczne choroby u ludzi wywołane przez E. cuniculi, ale źródło(źródła) zakażenia u ludzi nie jest znane .
historycznie tożsamość pasożyta opierała się na cechach morfologicznych, a czasem ultrastrukturalnych. Ostatnio morfologicznie Podobni przedstawiciele rodzaju Encephalitozoon zostali specjalizowani przez zastosowanie cech immunologicznych i molekularną charakterystykę rybosomalnych genów RNA . Izolaty E. cuniculi zostały dalej podzielone jako szczepy I, II Lub III, w oparciu o liczbę powtórzeń 4-zasadowej sekwencji (5 ’- GTTT-3′) w wewnętrznym transkrybowanym obszarze spacerowym (ITS) genu rybosomalnego RNA . Dwie Izolaty psa E. cuniculi zostały oznaczone szczepem III na podstawie obecności 4 powtórzeń sekwencji. Następnie w dwóch raportach z Europy zidentyfikowano 4 Izolaty ludzkie jako szczep III (Izolaty „Donovan” GenBank X98466, CDC:V282 i IPZ:MX-H5) oraz jako szczep I. Badanie to rozszerza tę pracę poprzez identyfikację 8 dodatkowych izolatów psów E. cuniculi z 4 ognisk jako szczep III. chociaż brak danych epidemiologicznych bezpośrednio potwierdziło przenoszenie psa na człowieka, dane molekularne sugerują, że psy mogą służyć jako potencjalne zbiorniki pasożytów. Ponadto udokumentowano długotrwałe zrzucanie zarodników przez psy bezobjawowe, co dodatkowo zwiększa prawdopodobieństwo przeniesienia odzwierzęcego pasożyta.
materiały i metody
izolacje pasożytów
ciała 7 szczeniąt z 3 niepowiązanych miotów i 1 psa zostały przekazane w ciągu 18 miesięcy do weterynaryjnego laboratorium diagnostycznego w Teksasie w celu oceny pośmiertnej. Zwierzęta pochodziły z czterech niepowiązanych ze sobą źródeł z różnych regionów Teksasu. Rozpoznanie encelitozoonozy stawiano w każdym przypadku na podstawie wyników badań histologicznych. Ze świeżych tkanek zwierząt ustalono osiem izolatów pasożytów: 5 izolatów pozyskano z tkanek mózgu lub nerek 5-do 7-tygodniowych szczeniąt Boston terrier (2 samce, 3 samice), które zmarły z powodu choroby neurologicznej (Izolaty 1-5, miot 1). Izolat 6 pochodzi z mózgu 10-tygodniowego samca teriera Maltańskiego, który był 1 z 4 miotów (miot 2), który zmarł na chorobę neurologiczną. Izolat 7 pochodzi z mózgu 10-tygodniowej suki miniaturowego szczeniaka pudla (miot 3), który zmarł na chorobę neurologiczną. Izolat 8 uzyskano z nerki 18-miesięcznej suki jamnika miniaturowego, która zmarła z powodu niewydolności nerek (tabela 1).
podsumowanie izolatów psów charakteryzowanych jako Encephalitozoon cuniculi szczep III na podstawie analizy molekularnej.
podsumowanie izolatów psów charakteryzowanych jako Encephalitozoon cuniculi szczep III na podstawie analizy molekularnej.
Po śmierci pobrano tkanki w warunkach aseptycznych i zhomogenizowano (Ten Broeck tissue homogenizer; Corning, Corning, NY) przy użyciu PBS, pH 7.2, plus 2× roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (Gibco, Gaithersburg, MD). Zarodniki mikrosporydialne oczyszczano z homogeniatu tkanek gospodarza, stosując wcześniej opisaną metodę gradientu gęstości Percollu, zmodyfikowaną przez zmianę prędkości wirowania na 600 g . Mikrosporidię hodowano w komórkach RK-13 (ATCC CCL-37) przy użyciu pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą i 2× roztworem antybiotykowo-antymikotycznym (Gibco), jak opisano wcześniej . Hodowlę pasożytów i analizę DNA przeprowadzono w ciągu kilku miesięcy w oparciu o odbiór różnych próbek przypadków, więc możliwość przypadkowego zanieczyszczenia krzyżowego była znikoma.
Izolacja DNA
w przypadku izolatów 1-6 i 8, pasożyty hodowano w hodowli krótkoterminowej w celu wytworzenia odpowiednich zarodników do charakterystyki molekularnej. W przypadku izolatu 7 pasożyty oczyszczano bezpośrednio ze świeżej tkanki mózgowej szczeniąt w celu izolacji DNA. W przypadku większości izolatów DNA ekstrahowano z oczyszczonych zarodników za pomocą matrycy Instagenowej (BioRad, Hercules, CA), zgodnie z protokołem producenta dla kultur bakteryjnych . W przypadku niektórych prac molekularnych z izolatami 6 i 8, zarodniki były przetwarzane jak wcześniej opisano , a DNA ekstrahowano z zarodników standardową metodą ekstrakcji fenolchloroformu przy użyciu systemu partycjonującego żel microfuge tube system (light phase Lock Gel system; 5 Prime→3 Prime Manufacturer, Westchester, PA) w celu optymalizacji odzyskiwania DNA. DNA wytrącono etanolem, osad ponownie zawieszono w TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6), a stężenie DNA oszacowano przy użyciu współczynników A260 : A280 za pomocą spektrofotometrii UV (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ). DNA wyekstrahowane z zarodników pochodzących z hodowli tkankowej encephalitozoon hellem zastosowano jako kontrolę pozytywną, a kontrola negatywna tylko odczynnika była uwzględniana we wszystkich reakcjach ekstrakcji i sekwencjonowania.
częściowe sekwencjonowanie i analiza DNA małej podjednostki genu rybosomalnego DNA (SSU rRNA)
część 5′ końca genu SSU rRNA z każdego z 8 izolatów została amplifikowana przy użyciu pary starterowej PMP1 i PMP2, jak wcześniej opisano . Reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) dla każdego izolatu przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta (GeneAmp PCR core reagents, n808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). Amplifikację wykonano w termoobiegu (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). Po wstępnej denaturacji przez 5 minut w temperaturze 95°C do każdej reakcji 25-µL dodano polimerazę Taq (0,5 U). Następnie próbki poddano 35 cyklom denaturacji (94°C, 30 s), wyżarzania (60°C, 30 s) i przedłużania (72°C, 1 min), a następnie 10 min w 72°C do ostatecznego przedłużenia. Nieinkorporowane nukleotydy usunięto za pomocą kolumn chromatograficznych (Micro Bio-Spin 30; BioRad). Próbki trzymano w temperaturze 4°C do momentu przetworzenia do automatycznego sekwencjonowania.
analiza DNA regionu its
część regionu its genu rybosomalnego RNA każdego izolatu Amplifikowano PCR parą starterową int530f i int580r , stosując opisane powyżej metody amplifikacji. Otrzymany produkt PCR zsekwencjonowano za pomocą automatycznego sekwencera DNA (model 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems / Roche Molecular Systems, Branchburg).
DNA automated sequencing
amplifikowane PCR DNA każdego izolatu zostało amplifikowane do automatycznej sekwencji za pomocą zestawu komercyjnego (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing ready-Reaction Kit; Promega, Madison, WI) zgodnie z instrukcjami producenta. Wszystkie reakcje przeprowadzono w termocyklerze (MJ Research Minicycler). Następnie próbki poddano 35 cyklom denaturacji (94°C, 30 s), wyżarzania (60°C, 30 s) i przedłużania (72°C, 1 min), a następnie 10 min w 72°C do ostatecznego przedłużenia. Produkty rozszerzenia oczyszczano przy użyciu kolumn chromatograficznych (Micro Bio-Spin; BioRad), suszono w wirówce próżniowej (Savant Instruments, Holbrook, NY) i przechowywano w temperaturze -20°C do momentu zsekwencjonowania w automatycznym sekwencerie (Perkin-Elmer 377 Abi Applied Biosystems).
za pomocą oprogramowania wyrównującego (sekwencer; kody genów, Ann Arbor, MI) uzyskano sekwencje konsensusowe ∼265 zasad dla części genu SSU rRNA dla każdego izolatu pasożyta. Sekwencje te oceniano pod kątem homologii w stosunku do wcześniej zgłoszonych sekwencji Encephalitozoon w bazie danych NCBI GenBank za pomocą prostego wyszukiwania BLASTN.
dwuniciowy test mobilności heteroduplex dna
DNA z izolatu 6 Amplifikowano PCR parą starterową int530f i int580r, jak opisano wcześniej . Produkty amplifikowane metodą PCR oznaczono dla wytwarzania heterodupleksów i homodupleksów przy użyciu wcześniej scharakteryzowanych izolatów E. cuniculi z różnych gospodarzy.
wyniki
w hodowli tkankowej stwierdzono łącznie 8 izolatów pasożytów pochodzących z 4 oddzielnych ognisk klinicznych. Zarówno lekkie cechy mikroskopowe, jak i cechy wzrostu in vitro pasożytów sugerowały, że były to E. cuniculi, mikrosporydian wcześniej zgłaszany u psów, a także innych gospodarzy. Częściowe sekwencjonowanie 5 ’ końca genu SSU rRNA każdego izolatu (GenBank AF144246–AF144253) potwierdziło tożsamość pasożytów jako E. cuniculi, ponieważ wszystkie okazy wykazały 100% homologię z wcześniej opublikowanymi sekwencjami (GenBank L39107dEZORGOA, L17072 / EZORGSMALL; X98470 / ECDSSRR2).
analiza Heterodupleksu i sekwencjonowanie jego regionu genu rybosomalnego RNA dodatkowo scharakteryzowało wszystkie Izolaty psów jako szczep III, potwierdzając wcześniejsze doniesienia o subtelnych różnicach między izolatami E. cuniculi od różnych gryzoni, królików i ludzkich gospodarzy. Fig.1 ilustruje powstawanie homodupleksu DNA pomiędzy izolatem 6 psów a wcześniej scharakteryzowanym izolatem III szczepu, jak również powstawanie heterodupleksu między izolatem 6 a innymi szczepami E. cuniculi.
test mobilności Heterodupleksów identyfikujący izolat psiego Encephalitozoon cuniculi (Ec) jako szczep III. Pasy: 1, markery pary zasad; 2 i 3, homodupleksy z amplikonu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) pasożytów z tkanek mózgu szczeniąt (BR) i nerek (KID); 4-6, homodupleksy każdego szczepu E. cuniculi; 7 i 8, heterodupleksy utworzone między amplikonami PCR pasożytów z nerki szczeniaka i szczepami i I II E. cuniculi (arrow); 9 i 10, homodupleksy między amplikonami PCR pasożytów z nerki szczeniaka i mózgu szczepienia i szczepem III E. cuniculi, co wskazuje, że są one identyczne w sekwencji DNA.
test mobilności Heteroduplex identyfikujący izolat psa Encephalitozoon cuniculi (Ec) jako szczep III. Pasy: 1, markery pary zasad; 2 i 3, homoduplexy z reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) amplikon pasożytów z tkanek mózgu szczeniąt (BR) i nerek (KID); 4-6, homodupleksy każdego szczepu E. cuniculi; 7 i 8, heterodupleksy utworzone między amplikonami PCR pasożytów z nerki szczeniaka i szczepami i I II E. cuniculi (arrow); 9 i 10, homodupleksy między amplikonami PCR pasożytów z nerki szczeniaka i mózgu szczepienia i szczepem III E. cuniculi, co wskazuje, że są one identyczne w sekwencji DNA.
dyskusja
biologiczne znaczenie wielu szczepów E. cuniculi nie zostało jeszcze wyjaśnione; jednak zdolność rozróżniania między szczepami pasożytów może stanowić narzędzie do śledzenia źródeł zakażenia w badaniach epidemiologicznych. Nasze dane molekularne identyfikujące 8 izolatów microsporidian od psów jako szczep III E. cuniculi zgadzają się z poprzednim badaniem, które sklasyfikowało 2 Izolaty psów jako szczep III . Izolaty królika, myszy i Lisa były zgłaszane jako szczepy I lub II . Dane te sugerują, że szczep III może być głównie związany z psami. Izolaty ludzkie zidentyfikowano jako szczep III na półkuli zachodniej oraz jako szczep I w Europie . Chociaż źródłem (- ami) narażenia człowieka na E. cuniculi jest nieznany, coraz więcej dowodów na to, że zwierzęta mogą służyć jako rezerwuary infekcji, a także istnieje możliwość odzwierzęcego przenoszenia organizmu między zwierzętami a ludźmi. Interesujące jest to, że różnice geograficzne i Kulturowe w posiadaniu zwierząt domowych mogą odgrywać rolę w narażeniu ludzi, ponieważ psy są powszechnymi zwierzętami domowymi w Stanach Zjednoczonych, podczas gdy króliki są często trzymane jako zwierzęta domowe lub jako żywność w Szwajcarii i innych krajach europejskich.
badanie próbek kału i moczu od zdrowych klinicznie rodziców Boston terriera i 1 szczeniaka z miotu 1 wykazało niski poziom zrzucania zarodników przez ⩾4 miesiące po śmierci potomstwa (Izolaty 1-5; dane niepublikowane). Obserwacja ta dodatkowo sugeruje możliwy mechanizm bezpośredniego lub pośredniego przenoszenia pasożytów z psów na ludzi poprzez zanieczyszczenie zlokalizowanych środowisk z moczu psa i wydalin kału. Chociaż nie przeprowadzono badań epidemiologicznych dotyczących związku między posiadaniem/narażeniem zwierząt domowych a zakażeniami mikrosporydialnymi u ludzi, w jednym przypadku, w którym dzieci były narażone na szczenięta z jawną encefalitozoonozą, 1 z 3 dzieci poddano serokonwersji . Dodatkowe Izolaty E. cuniculi od różnych gospodarzy muszą być analizowane w celu dalszej oceny ryzyka utrzymania potencjalnie zakażonych zwierząt domowych w gospodarstwach domowych osób z obniżoną odpornością, narażonych na wysokie ryzyko zakażeń mikrosporydialnych.
podziękowania
dziękujemy Patologom Texas Veterinary Medical Diagnostic Laboratory Jayowi Hoffmanowi, Joanne Mansellowi i Bruce ’ owi Abbittowi za dostarczenie tkanek psów do tego badania.
,
.
.
,
,
(str.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, Tom.
(str.
–
)
,
,
i in.
,
,
, Tom.
(str.
–
)
,
,
.
,
,
, Tom.
str.
,
,
,
,
,
.
,
,
, Tom.
(str.
–
)
itp.
tom.
(str.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, Tom.
(str.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, Tom.
(str.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, Tom.
(str.
–
)
,
,
,
.
,
,
, Tom.
(str.
–
)
,
,
. ,
,
2nd ed.
,
.
,
,
, Tom.
(str.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, Tom.
(str.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(str.
–
)
to badanie zostało sfinansowane przez grant AI-40232 z National Institutes of Health.