Frontiers in Pharmacology

wprowadzenie

białka błonowe uczestniczą w podstawowych zdarzeniach fizjologicznych w każdym systemie biologicznym, od bakterii po ludzi. >50% wprowadzanych do obrotu leków jest ukierunkowanych na białka błonowe, podczas gdy farmakologiczne ukierunkowanie wielu innych białek błonowych jest uważane za potencjalnie korzystne w wielu zastosowaniach biomedycznych (Overington et al., 2006; Yıldırım et al., 2007; Arinaminpathy et al., 2009). Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw ich funkcji i regulacji pozostają w dużej mierze nieznane ze względu na brak informacji strukturalnych. Rzeczywiście, podczas gdy białka błonowe stanowią ~26% ludzkiego proteomu, ich struktury stanowią tylko ~ 2% struktur w banku danych o białkach (Fagerberg et al., 2010; Pandey et al., 2016). Kilka przeszkód utrudniają badania strukturalne białek błonowych, wymagających rozwoju state-of-the-art technologii do wyjaśnienia ich architektury molekularnej (Pandey et al., 2016; Masson et al., 2017; Hagen et al., 2018; Ravula and Ramamoorthy, 2019; Redhair et al., 2019). Główną przeszkodą jest to, że ich nadekspresja i oczyszczanie oraz badania strukturalne za pomocą większości technik (np. krystalografii rentgenowskiej) pozostają w wielu przypadkach ograniczone. Te przeszkody w konsekwencji utrudniają racjonalny rozwój leków kandydatów ukierunkowanych na białka błonowe związane z chorobą (Vinothkumar and Henderson, 2010; Lounnas et al., 2013; Marciano et al., 2014).

Transportery wtórne to białka związane z błoną, które selektywnie katalizują ruch słabo przepuszczalnych substancji rozpuszczalnych (np., jony, neuroprzekaźniki, leki) przez błonę komórkową, wspierając różnorodne funkcje komórkowe w zdrowiu i chorobie. Transportery wtórne są zgodne z paradygmatem dostępu zmiennego, zgodnie z którym kieszeń wiążąca ligand białkowy staje się alternatywnie dostępna po przeciwnych stronach błony, przyjmując kolejno Stany skierowane do wewnątrz (IF) i skierowane na zewnątrz (OF) (Jardetzky, 1966; Forrest et al., 2011). Ostatnie przełomy w biologii strukturalnej białek błonowych dostarczyły bogactwa struktur transporterów związanych z błoną w różnych stanach konformacyjnych (Drew and Boudker, 2016; Bai et al., 2017), dostarczając wgląd w mechanizmy ich transportu i rozpoznawania. Zapewniają jednak statyczne migawki wieloetapowego procesu z natury (Seeger, 2018). Tak więc, istnieje rosnąca potrzeba opracowania nowych podejść do badania dynamiki białek błonowych (Konermann et al., 2011; Smith et al., 2012; Sim et al., 2017; Mandala et al., 2018; Burke, 2019). Należą do nich połączenie dynamiki molekularnej (MD) symulacje (Roux et al., 2011; Zdravkovic et al., 2012; Zhekova et al., 2016; Zhekova et al. Harpole i Delemotte, 2018) z zaawansowanych technik eksperymentalnych, w tym technik spektroskopowych i jednocząsteczkowej kriogenicznej mikroskopii elektronowej (Smith et al., 2012; Pandey et al., 2016; Castell et al., 2018; Hagen et al., 2018; Ravula i Ramamoorthy, 2019; Sun i Gennis, 2019).

spektrometria mas wymiany wodoru i deuteru (HDX-MS) zyskała w ostatnich latach uwagę na badanie dynamiki białek błonowych, mimo że była stosowana od dziesięcioleci do scharakteryzowania rozpuszczalnych białek (Konermann et al., 2011; Vadas et al., 2017). HDX-MS monitoruje zależną od czasu wymianę rozpuszczalnika D2O z białkami amidowymi w Warunkach natywnych. Kurs wymiany deuteru zależy od dostępności rozpuszczalnika, struktury wtórnej i sztywności strukturalnej (Konermann et al., 2011). W połączeniu z trawieniem proteolitycznym i separacją peptydów, HDX-MS umożliwia kwantyfikację kursów wymiany w krótkich segmentach białkowych, aż do rozdzielczości pojedynczej pozostałości. Dwie główne zalety HDX-MS to to, że małe ilości białka (< 0,1 mg) są wymagane do analizy i że chemiczne etykietowanie białek nie jest wymagane, unikając niepożądanych zaburzeń strukturalnych. Tutaj podsumowujemy ostatnie postępy i zastosowania w wykorzystaniu HDX-MS do badania dynamiki strukturalnej transporterów.

Zasady spektrometrii masowej wymiany wodoru i deuteru

Zasady HDX-MS są krótko i jakościowo opisane poniżej, aby umożliwić omówienie ich zastosowań do badania transporterów. W celu dogłębnych wyjaśnień dostępnych jest kilka doskonałych artykułów przeglądowych(Konermann et al., 2011; Rand et al., 2014; Engen and Wales, 2015; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019).

w doświadczeniach HDX Deuter wymienia się z labilnymi białkowymi wodorami w sposób zależny od czasu po rozcieńczeniu białka w buforze D2O (Masson i wsp., 2017) (Rys. 1). HDX-MS monitoruje głównie wymianę wodorów amidowych szkieletu, ponieważ i) przy neutralnym pH są one wymieniane w tempie, które można wykryć za pomocą HDX-MS (sekundy do dni) I ii) ich wymiana może być skutecznie hartowana (Marcsisin and Engen, 2010; Gallagher and Hudgens, 2016). Szybkość HDX zależy od kilku parametrów. Wodory amidowe mogą wykazywać „stan zamknięty”, wynikający z udziału w stabilnych wiązaniach wodorowych w strukturach wtórnych lub z niedostępności rozpuszczalnika, co nie pozwala na ich wymianę z rozpuszczalnikiem deuterem, lub „stan otwarty”, w którym może wystąpić abstrakcja protonów, etap ograniczający szybkość HDX (Oganesyan et al., 2018). Ponadto reakcja ma wewnętrzną stałą szybkości chemicznej, która zależy od pH, temperatury i środowiska pozostałości (Oganesyan et al., 2018).

przejście między Stanami zamkniętymi i otwartymi następuje poprzez lokalne wydarzenia. W natywnych warunkach, w których białka są dobrze złożone, szybkość HDX zależy głównie od szybkości przejścia z powrotem do stanu zamkniętego (Weis et al., 2006). Jeśli rozwinięty region białkowy powraca do stanu zamkniętego z szybkością znacznie wolniejszą niż chemiczny kurs wymiany, obserwuje się kinetykę EX1, co skutkuje skorelowanym wychwytem deuteru w sąsiednich resztach. Powoduje to dwie populacje: jedna z niskim m / z i jedna z wysokim m / z, odzwierciedlające peptydy z cząsteczek białka, które nie zostały i które zostały poddane wymianie, odpowiednio. Z czasem wysoka populacja m / z staje się bardziej widoczna kosztem niskiej populacji m/Z. Kinetyka EX1 jest uważana za rzadką w składanych białkach w Warunkach natywnych, ale może być indukowana, na przykład, przez dodanie denaturantów(Weis et al., 2006; Oganesyan et al., 2018). Jeśli białko wraca do stanu zamkniętego z szybkością znacznie szybszą niż chemiczny kurs wymiany, obserwuje się kinetykę EX2. Tutaj wymiana zależy od przejścia pojedynczych pozostałości między stanem otwartym i zamkniętym, zachodzącego w nieskorelowany sposób. Tak więc z czasem obserwuje się pojedynczą populację o stopniowo rosnących wartościach m/z(Weis et al., 2006).

Po deuteracji reakcję hartuje się we wcześniej określonych punktach czasowych, zmieniając pH z obojętnego (7) na pHmin (2,5-3), co skutkuje ~10 000–krotnym zmniejszeniem HDX (Konermann i in., 2011; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018); i poprzez obniżenie temperatury z 25 do 0°C, co prowadzi do ~14-krotnego spadku HDX (Englander, 2006; Oganesyan et al., 2018). Następnie białko jest trawione za pomocą proteazy, a peptydy są oddzielane za pomocą analitycznej chromatografii odwróconej fazy. Obecnie głównym technicznym wąskim gardłem eksperymentów HDX-MS jest uzyskanie wysokiego pokrycia sekwencji, które jest ograniczone przez odporność na enzymy trawienne i warunki proteolityczne. Ostatecznie eluowane peptydy identyfikuje się za pomocą MS, a stopień HDX oblicza się na podstawie uzyskanych wartości m / Z. Szczegóły eksperymentalne i pułapki trawienia białek, separacji peptydów i identyfikacji MS są poza zakresem tego przeglądu(Konermann et al., 2011; Masson i in., 2017; Masson et al., 2019).

spektrometria masowa wymiany wodoru i deuteru badania białek błonowych

pomimo dzielenia paradygmatu zmiennego dostępu, indukowane przez ligand zmiany konformacyjne różnią się między transporterami ze względu na różnice w interakcjach ligand-białko. Na przykład, symportery (współprowadzące dwa lub więcej ligandów) mogą przejść między IF i stanami bez związanych ligandów, podczas gdy Wiązanie ligandów jest obowiązkowe do wymiany między IF i stanami w antyporterach (wymiana ligandów po przeciwnych stronach błony) (Forrest et al., 2011; Drew and Boudker, 2016; Bai et al., 2017).

ogólnie rzecz biorąc, wykrywanie lokalnych zmian dynamicznych w białkach wywołanych ligandem jest trudne. Na przykład struktury krystaliczne białek błonowych zarówno w formach wolnych od ligandu, jak i związanych z ligandem są często niedostępne, co wyklucza wykrywanie indukowanych ligandem zmian konformacyjnych nawet dla białek o znanych strukturach. Co więcej, wysokiej rozdzielczości strukturalne migawki Stanów APO i ligandów mogą nie rozwiązywać istotnych różnic konformacyjnych. Jednakże, małe zmiany konformacyjne wywołane ligandami mogą być wykryte przy użyciu HDX-MS w określonych subdomenach białkowych w Warunkach natywnych poprzez pomiar różnicowego wychwytu deuteru (ΔHDX) w obecności i braku ligandów. Ta zdolność HDX-MS zapewnia unikalne możliwości rozwiązania najtrudniejszych problemów w wyjaśnianiu mechanizmów interakcji ligand-białko i białko-białko(Rand et al., 2014; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019), jak opisano tutaj dla wielu niedawno zbadanych białek transportera.

przejścia konformacyjne leżące u podstaw zmiennego dostępu: Antyporter Na+/h+

białka Nha regulują pH komórkowe i objętość w całym królestwie życia (Padan and Landau, 2016). Głównym modelem strukturalnym wykorzystywanym do badania ortologów Nhaa jest Escherichia coli nhaa, dla którego dostępna jest struktura krystalograficzna stanu nieaktywnego w kwaśnym pH(Hunte i wsp ., 2005). Do badania dynamiki strukturalnej NhaA pod fizjologicznym pH, niedawno użyto HDX-MS (Eisinger et al., 2017). Kluczowe znaczenie dla spostrzeżeń uzyskanych w tym badaniu, HDX-MS dostarcza globalnych danych dynamicznych, w przeciwieństwie do metod opartych na etykietowaniu specyficznym dla danego miejsca, które wykrywają tylko ruchy wstępnie zdefiniowanych regionów białkowych.

w tym badaniu uzyskano wyjątkowo wysokie pokrycie sekwencji wynoszące 88,5% dla nhaa w detergencie, zapewniając wgląd w mechanizm leżący u podstaw zmiennego dostępu po wiązaniu ligandu. Porównując wzorce HDX pomiędzy APO-i związanym z substratem Nha, zaobserwowano powtarzający się wzór zmiany HDX w kilku helisach, gdzie zwiększonemu wychwytowi deuteru w jednym końcu towarzyszyło zmniejszenie wychwytu deuteru w drugim końcu. Wychwyt na środku helisy był w dużej mierze niezmieniony.

opierając się na obserwowanym wzorze zmiany HDX, chociaż nie dostarczając bezpośrednio informacji przestrzennej, zasugerowano, że zachodzi translacja Helis przezbłonowych względem błony, co znajduje odzwierciedlenie w wzajemnych zmianach HDX obserwowanych dla dwóch końców w określonych helisach przezbłonowych. Model ten jest zgodny z” podobnym do windy ” mechanizmem zmiennego dostępu, co sugeruje pionowe tłumaczenie Helis transmembrany podczas cyklu transportu (Ryan and Vandenberg, 2016). Podsumowując, HDX-MS dostarczył nowatorskich wglądów w strukturalne przejścia związane z naprzemiennym dostępem, nieosiągalne przez wcześniej rozwiązane struktury nieaktywnego NhaA.

wpływ interakcji białkowo-lipidowych Na krajobrazy konformacyjne transporterów

Większość transporterów drugorzędowych należy do nadrodziny głównych facylitatorów (MFS), dzieląc zachowaną architekturę pomimo zróżnicowanych funkcji (Radestock and Forrest, 2011). Chociaż struktury krystaliczne członków MFS są dostępne, dostarczyły one niewiele informacji na temat interakcji białko-lipid i ich wpływu na równowagę między Stanami OF I IF. Tak więc, Martens et al. połączone symulacje MD z HDX-MS w celu zbadania wpływu środowiska lipidowego na trzy dobrze scharakteryzowane transportery: laktozę, transporter ksylozy i antyporter glicerolu-3-fosforanu (Martens i wsp ., 2018).

Po pierwsze, mutacja, o której wiadomo, że przesuwa równowagę w kierunku stanu OF, została wprowadzona w przedsionku zewnątrzkomórkowym wszystkich transporterów (Kumar et al., 2014). Porównanie WT i zmutowanych transporterów przy użyciu HDX-MS wykazało, że metoda wykrywa zmianę konformacyjną, przy czym regiony na przedsionku zewnątrzkomórkowym pobierają więcej deuteru w mutantach vs. WT, podczas gdy odwrotnie występuje dla pozostałości w przedsionku wewnątrzkomórkowym. Następnie transportery odtworzono w nanodiski złożone z fosfatydyloglicerolu, tetraoleilokardiolipiny i fosfatydylocholiny lub fosfatydyloetanoloaminy. Co ciekawe, obecność fosfatydyloetanoloaminy przesunęła równowagę w kierunku stanu IF. Następnie, symulacje MD transporterów w dwuwarstwach lipidowych identycznych z kompozycją nanodisków przewidywały bezpośrednie interakcje między naładowaną grupą główną fosfatydyloetanoloaminy i zachowaną cytoplazmatyczną siecią naładowanych reszt, stabilizując stan (Doki i in., 2013). Mutacja naładowanych reszt zniosła efekt fosfatydyloetanoloaminy, silnie sugerując, że specyficzne interakcje fosfatydyloetanoloaminy z białkiem kontrolują wewnętrzną równowagę transporterów. Badanie to jest surowym przykładem łączenia metod eksperymentalnych i obliczeniowych w celu identyfikacji subtelnych, ale funkcjonalnie istotnych interakcji białko-lipid.

odwijanie helisy podczas transportu: badania LeuT

LeuT jest prokariotycznym homologiem z rodziny neuroprzekaźników/na+ symporters (NSS), która obejmuje ważne cele leków, takie jak transportery serotoniny, dopaminy i noradrenaliny (Kristensen et al., 2011). LeuT był szeroko badany, a jego struktury krystalograficzne wzdłuż cyklu transportu są dostępne (Focke et al., 2013). Struktury te sugerowały, że podczas naprzemiennego dostępu wymagane są duże zmiany strukturalne (Krishnamurthy and Gouaux, 2012). Jednak krajobraz konformacyjny pozwalający na przejście między państwami IF I OF pozostaje nieuchwytny i kontrowersyjny.

aby zbadać przejście między różnymi stanami, solubilizowany w detergencie LeuT badano w warunkach, które faworyzują Stany IF lub (Merkle et al., 2018). Co zaskakujące, wiele peptydów, głównie po wewnątrzkomórkowej stronie transportera, wykazywało kinetykę EX1. Jest to dość nietypowe w przypadku złożonych białek w Warunkach rodzimych i uważane za odzwierciedlenie długotrwałego rozwoju wtórnych elementów struktury. Opierając się na przestrzennym rozkładzie peptydów wykazujących kinetykę EX1, wraz z dostępnymi strukturami krystalograficznymi, zaproponowano, że specyficzne helisy ulegają częściowemu odwijaniu podczas zmiennego dostępu i że te zmiany konformacyjne również przyczyniają się do uwalniania substratu. Badanie to podkreśla funkcjonalne znaczenie powolnych (skala czasu sekund) zmian konformacyjnych, które mogą być dobrze rozwiązane za pomocą HDX-MS, w przeciwieństwie do innych metod eksperymentalnych lub obliczeniowych (np. MD).

Spektrometria Mas wymiany wodoru i deuteru białek błonowych w Nanodyskach lipidowych

interakcje białek błonowych z otaczającymi lipidami mogą dramatycznie modulować ich funkcję (Vadas et al., 2017). Rzeczywiście, aktywność eukariotycznych członków NSS znacząco zależy od specyficznych interakcji lipid-białko, które modulują dynamikę białka, a co za tym idzie, od interakcji substratowych (Divito and Amara, 2009). Dlatego Adhikary et al. badany LeuT rozpuszczony w dwuwarstwowych nanodiskach fosfolipidów (Adhikary et al., 2017). Stosując to podejście, LeuT był badany w warunkach sprzyjających konformacji IF I OF. Porównanie wzorców HDX między tymi stanami ujawniło specyficzne zmiany w regionach wcześniej zaangażowanych w cykl transportu, odzwierciedlające istotne funkcjonalnie zmiany strukturalne. Co ciekawe, dane HDX-MS, zgodne z wcześniejszymi badaniami biofizycznymi i obliczeniowymi, wspierały mniejszy kąt nachylenia pierwszej helisy przezbłonowej w konformacji IF w porównaniu do obserwowanego w strukturach krystalicznych. Tę różnicę przypisywano środowisku lipidowemu, ponieważ strukturę krystaliczną uzyskano w detergencie z niewielką ilością lipidów. Podsumowując, HDX-MS zapewnia elastyczną platformę do badania białek błonowych w różnych środowiskach hydrofobowych i w warunkach sprzyjających określonym stanom konformacyjnym, bez potrzeby etykietowania specyficznego dla danego miejsca.

interakcje jonów z wieloma miejscami: Wymiennik na+/Ca2+

NCX uczestniczy w komórkowej homeostazie Ca2+ poprzez wytłaczanie Ca2+ z komórek na tle gradientu elektrochemicznego (Blaustein and Lederer, 1999). NCX wymienia 3NA+: 1ca2+, gdzie na+ i Ca2+ są transportowane w oddzielnych etapach (Khananshvili, 1990). Co zaskakujące, struktura krystaliczna NCX z Methanocaldococcus jannaschii (NCX_Mj) ujawniła cztery miejsca wiązania jonów, jednocześnie zajęte przez trzy jony Na+ w miejscach określanych jako Sint, Smid, Sext i jeden jon Ca2+ w miejscu określanym jako SCA (Liao et al., 2012). Ponieważ ten tryb wiązania był niespójny z poprzednimi badaniami, przeprowadzono symulacje MD i analizy strumienia jonowego mutantów, sugerując, że jony Na+ zajmują Sint, SCa i Sext, podczas gdy Ca2 + zajmuje SCa (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016B; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). W ten sposób jony na+ i Ca2+ są związane w wzajemnie wykluczający się sposób wzdłuż cyklu transportu.

aby eksperymentalnie ustalić przypisanie miejsc wiązania jonów, porównaliśmy stan apo ze Stanami wiązania jonów NCX_Mj za pomocą HDX-MS (Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017). Pomimo niskiego pokrycia sekwencji, nasza analiza obejmowała 10 z 12 reszt koordynujących jony. Wykryliśmy zależne od Na+zmniejszenie wychwytu deuteru w Sint, SCa i Sext, ale nie Smid, podczas gdy w obecności Ca2+ zmniejszenie wychwytu deuteru obserwowano głównie w SCa. Jest to zgodne z przewidywaniami dokonanymi przez symulacje MD i analizy mutacyjne przewidujące zajęcie Smid przez cząsteczkę wody, ale nie Przez na+ lub Ca2+ w stanie podstawowym (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). W szczególności, późniejsze badania krystalograficzne potwierdziły przypisanie naszych miejsc wiązania (Liao et al., 2016). W ten sposób HDX-MS potwierdził tryb wiązania jonów sugerowany przez badania obliczeniowe i funkcjonalne.

selektywność jonowa transportującego li+mutanta NCX

mitochondrialny wymiennik na+ / Ca2+ (NCLX) wykazuje wyjątkową selektywność jonową, wymieniając Ca2+ z Na+ lub Li+, podczas gdy NCX nie transportują Li+ (Palty i in., 2010). Chociaż fizjologiczne znaczenie tej selektywności jonowej pozostaje zagadkowe, należy zauważyć, że 9 (z 12) reszt koordynujących jony w NCLX różni się od tych w NCXs i innych członach nadrodziny antyportowej Ca2+/kation. Aby zrozumieć, w jaki sposób te różnice wpływają na rozpoznawanie i transport wiązań jonowych, przeprowadziliśmy opartą na strukturze wymianę reszt koordynujących jony w NCX_Mj w celu naśladowania miejsc wiązania NCLX (Refaeli et al., 2016). Co zaskakujące, nowo zaprojektowana konstrukcja (zwana NCLX_Mj) pośredniczy na+/Ca2+ i Li+/Ca2+ z porównywalnymi wartościami Km (Refaeli et al., 2016).

następnie staraliśmy się ustalić, czy miejsca wiązania jonów w NCLX_Mj przypominają miejsca wiązania jonów w NCX_Mj (Giladi et al., 2019). Analizy HDX-MS indukowanych jonowo zmian konformacyjnych wykazały, że SCa wiąże Na+, Li+ lub Ca2+, podczas gdy jeden lub więcej dodatkowych miejsc na+/Li+ NCLX_Mj jest niezgodnych z oryginalnymi miejscami na+ (sekt i Sint) przypisanymi do NCX_Mj. Wyniki te sugerują, że NCLX_Mj może transportować jony z elektroneutralną stechiometrią 2NA+:1ca2+ lub 2Li+:1ca2+. Zgodnie z danymi HDX-MS, zaciskanie napięciowe przyspiesza kursy wymiany na+ / Ca2 + w proteoliposomach odtworzonych w NCX_Mj (ze względu na stechiometrię 3NA+:1Ca2+), natomiast nie ma istotnego wpływu na kursy wymiany Na + / Ca2 + lub Li + / Ca2+ w NCLX_Mj(Giladi et al., 2019).

nasze badania wykazały użyteczność HDX-MS w identyfikacji i walidacji miejsc wiązania w transporterach jonów, gdzie stosunkowo niewielkie różnice w indukowanych jonami sygnałach ΔHDX dostarczają ważnych informacji na temat selektywności jonów i zmian konformacyjnych zachodzących po wiązaniu jonów w różnych miejscach. Tak więc, w połączeniu z symulacjami MD i krystalografią rentgenowską, HDX-MS jest szczególnie atrakcyjny dla wyjaśnienia strukturalnych determinantów selektywności jonów i indukowanych jonami zmian konformacyjnych w układach transportu jonów obejmujących wiele miejsc wiązania jonów.

wnioski

w ciągu ostatnich dziesięcioleci Biologia strukturalna ogromnie przyczyniła się do naszego zrozumienia funkcji białek błonowych, głównie poprzez dostarczanie statycznych migawek dyskretnych stanów w wysokiej rozdzielczości. Aby w pełni rozszyfrować relacje struktura-funkcja leżące u podstaw złożonego procesu transportu substancji rozpuszczonych, opracowano rosnącą liczbę eksperymentalnych i obliczeniowych metod, aby wypełnić lukę między tymi statycznymi migawkami i określić podstawowe krajobrazy konformacyjne. HDX-MS jest coraz częściej stosowany do badania nienaruszonych białek błonowych w różnych warunkach zbliżonych do rodzimych, zapewniając nowe możliwości badania interakcji błona-białko, rozpoznawania substratów i związanych z transportem przemian konformacyjnych. Przyszły rozwój automatyzacji oprzyrządowania i analizy danych może pozwolić na wykorzystanie HDX-MS o wysokiej przepustowości, w pełni wykorzystując jego potencjalne zastosowanie w badaniach podstawowych i zastosowaniach biomedycznych, takich jak projektowanie leków.

wkład autora

MG i DK przejrzeli literaturę i napisali rękopis.

finansowanie

praca ta była wspierana przez Israel Science Foundation (Grant #1351/18) (D. K) i Israel Cancer Research Foundation (Grant #19202) (MG). Z wdzięcznością przyznaje się wsparcie finansowe z nagrody Shmuel Shalit dla DK.

konflikt interesów

autorzy oświadczają, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakichkolwiek relacji handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.