interaktomy wzmacniaczy POU5F1 i SOX2 w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Identyfikacja interaktomów wzmacniaczy POU5F1 i SOX2

przypuszczalne regiony wzmacniaczy POU5F1 i SOX2 są ewolucyjnie zachowane w kręgowcach (44 gatunki), z aktywnymi sygnaturami wzmacniającymi określonymi przez znaki epigenetyczne, takie jak P300 ACETYLOTRANSFERAZA histonowa i H3K27AC, ale nie h3k27me3 w hescs7 ( dodatkowe rys. 1a). Zastosowaliśmy technikę 4C, aby zidentyfikować interakcyjnych partnerów domniemanych wzmacniaczy” przynęty ” POU5F1 i SOX2 w pluripotencjalnej linii komórkowej H9. Krótko mówiąc, komórki zostały przymocowane do chromosomów sieciujących w pobliżu. Chromosomy zostały następnie rozdrobnione przez sonikację. Interakcyjne fragmenty chromatyny ligowano i fragmenty DNA oczyszczano. Regiony genomowe oddziałujące z „przynętą” były następnie wzmacniane przez zagnieżdżone PCR (Fig. 1B, tabela uzupełniająca 1). Zaprojektowaliśmy startery odwrotnego PCR w celu ukierunkowania na domniemane wzmacniacze genów POU5F1 i SOX2. Skonstruowana biblioteka 4C może być wizualizowana za pomocą elektroforezy DNA, podczas gdy kontrola bez ligacji nie wykazała prawie żadnych produktów PCR(dodatkowe rys. 1B), wskazując, że biblioteka 4C została wzmocniona z produktów ligacji.

przeprowadziliśmy sekwencjonowanie DNA nowej generacji za pomocą sekwencera Illumina HiSeq i sklasyfikowaliśmy zidentyfikowane interakcje 4C jako interakcje proksymalne lub dystalne (patrz metody). Interakcje dystalne obejmują interakcje między chromosomami i interakcje wewnątrz chromosomowe na odległościach genomowych większych niż 20 kb, podczas gdy interakcje proksymalne obejmują regiony wewnątrz chromosomowe z odległościami genomowymi od 300 bp do 20 kb. Zgodnie z wynikami badań opartych na 3C, nasze dystalne odczyty interakcji stanowią tylko niewielką część całkowitych interakcji, w przybliżeniu 10% ~ 20% dla bibliotek 4C (dodatkowa Tabela 2). Użyliśmy dwóch różnych partii komórek H9 do skonstruowania bibliotek 4C dla POU5F1 i SOX2 niezależnie do sekwencjonowania nowej generacji. Dwa replikaty dystalnych interakcji POU5F1 i SOX2 pokrywają się odpowiednio o 35% i 25%. Jest to zgodne z umiarkowanym nakładaniem się obserwowanym w biologicznych replikatach interaktywnych chromatyny mediowanych przez CTCF w komórkach es mysich27 i może odzwierciedlać różnorodność i dynamikę interakcji wzmacniających, wydajność ligacji, złożoność amplifikacji PCR, jak również głębokość sekwencjonowania. Aby odfiltrować interakcje, które prawdopodobnie wynikały z efektów stochastycznych, użyliśmy modelu statystycznego opartego na false discovery rate (FDR), aby zidentyfikować wzbogacone domeny oddziałujące w całym genomie. Dodatkowo połączyliśmy wzbogacone domeny interakcji, które nakładają się między replikatami biologicznymi, jako domeny o wysokim zaufaniu, często oddziałujące. W sumie zidentyfikowano 23 i 9 domen o wysokim zaufaniu, często oddziałujących ze sobą odpowiednio dla INTERAKTOMÓW POU5F1 i SOX2 ( Fig.1, Tabela uzupełniająca 3 , 4), a większość z nich to interakcje między chromosomami, które obejmują regiony bogate w geny, podobne do wyników e4c20.

Mapy oddziaływań dystalnych Circos są prezentowane przy użyciu oprogramowania Circos52.

niebieski pierścień zewnętrzny reprezentuje profil gęstości genu.

interaktomy wzmacniaczy POU5F1 i SOX2 pokrywają się z domenami wczesnej replikacji DNA, ale nie z regionami heterochromatycznymi

następnie zbadaliśmy, czy domeny wzmacniaczy POU5F1 i SOX2 (rozmiar od 1 Mb do 4 Mb, dodatkowa Tabela 3, 4 ) mają unikalne cechy epigenetyczne. As Ryba et al. pokazano 28, czas replikacji DNA koreluje z przestrzenną bliskością chromatyny mierzoną za pomocą analizy Hi-C, co sugeruje, że wczesna i późna replikacja DNA występuje w przestrzennie odrębnych przedziałach w jądrze. Zauważyliśmy, że loci genów POU5F1 i SOX2 znajdują się we wczesnych domenach replikacji DNA w hESCs i zastanawialiśmy się, czy ich interakcyjne domeny mają podobny czas replikacji DNA. Jak pokazano na fig. 2A, domeny wzmacniające POU5F1 i SOX2 oddziałujące głównie pokrywają się z wczesnymi domenami replikacji DNA w hESCs. Rozkład ocenianych wartości czasu replikacji w obrębie regionów genomowych otaczających zidentyfikowane miejsca interakcji wzmacniaczy POU5F1 i SOX2 (zakres 50 kb) wykazuje przesunięcie w kierunku wartości dodatnich w porównaniu z wartościami tablicy genomu (p < 2.2 × 10-16 dla obu, przez niesparowany test sumy Rang Wilcoxona; rys. 2b). Ta obserwacja ujawniła interesującą cechę epigenetyczną, że struktury wyższego rzędu otaczające wzmacniacze POU5F1 i SOX2 zsynchronizowały czas replikacji DNA. Ponieważ wczesne domeny replikacji DNA zostały połączone z aktywną transkrypcją genu w hESCs28, jest prawdopodobne, że interakcje wzmacniaczy POU5F1 i SOX2 z zidentyfikowanymi regionami dystalnymi mają znaczenie funkcjonalne. Ta obserwacja jest zgodna z tym, co widzieliśmy w INTERAKTOMIE wzmacniacza POU5F1 w komórkach myszy ES (dane nie pokazane). 2A, interakcyjne domeny POU5F1 i SOX2 nie pokrywają się z regionami heterochromatycznymi oznaczonymi silnymi sygnałami H3K9me3 w hESCs29, co sugeruje, że interaktomy znajdują się w aktywnej części genomu pod względem regulacji genów. Ponadto zbadaliśmy potencjalny związek z domenami związanymi z laminą jądrową (LADs) ludzkich chromosomów30, ale nie zaobserwowaliśmy żadnego związku, prawdopodobnie ze względu na fakt, że LADs zostały określone w ludzkich fibroblastach.

związek interakcji z domenami replikacji DNA i regionami heterochromatycznymi.

strony interakcji w obrębie domen często interakcji są przedstawione w (2a) (tylko Chr1 i Chr2 są pokazane). (2b), Comparison of distribution of DNA replication timing (RT) array values for the regions within ±50 kb of the interacting sites to the whole genome.

interaktomy wzmacniacza sąsiadują z miejscami rozpoczęcia transkrypcji i posiadają aktywne cechy epigenetyczne

aby zbadać korelację interaktomów wzmacniacza POU5F1 i SOX2 z przypisanymi lokalizacjami genów, przeanalizowaliśmy rozkład odległości genomowej miejsc interakcji wzmacniacza do najbliższego miejsca rozpoczęcia transkrypcji genu (TSS) ( rysunek 3A ). Wykresy gęstości jądra obu stron oddziałujących wzmacniacz POU5F1 i SOX2 wyraźnie pokazują ostry szczyt wyśrodkowany w TSS. W porównaniu do piku dystrybucji losowo symulowanych miejsc w całym genomie, piki obserwowane w interakcjach wzmacniacza są znacznie wyższe w wąskim oknie wokół TSS (P = 0,0018, P = 0,0047, odpowiednio, test Kołmogorowa-Smirnowa). Wzbogacenie oddziałujących miejsc wokół TSS sugeruje, że wzmacniacze POU5F1 i SOX2 preferują interakcje z regionami genomowymi zawierającymi geny. Dalej badaliśmy dystrybucję miejsc oddziałujących wzmacniająco na POU5F1 i SOX2 w różnych regionach genomowych31. 3b, sekwencje promotora genu są jednym z wzbogaconych regionów dla interaktomów wzmacniających POU5F1 i SOX2. Dodatkowo, frakcja dystalnych regionów międzygenicznych jest konsekwentnie zmniejszana dla dwóch interaktomów. Dlatego nasze obserwacje sugerują, że struktura chromosomów wyższego rzędu otaczająca aktywne wzmacniacze może być bezpośrednio zaangażowana w regulację genów. Zauważono również, że gdy losowe miejsca we wczesnych obszarach replikacji DNA (szczegóły patrz metody) są wybierane w celu porównania rozkładu odległości do TSS, interaktomy POU5F1 i SOX2 są nadal bardziej wzbogacone wokół TSS, chociaż statystycznie nieistotne (P = 0,390,1 P = 0,2098, odpowiednio, test Kołmogorowa-Smirnowa, Fig. 2 ).

(a) oszacowanie gęstości jądra genomowej odległości od oddziałujących witryn do najbliższych witryn TSS. Odległości obliczano za pomocą oprogramowania HOMER34. Mapy gęstości 100 000 losowych miejsc w całym genomie są również uwzględnione. B) Analiza wzbogacenia interaktomów w różnych regionach genitalnych. Analizę dystrybucji przeprowadzono przy użyciu oprogramowania CEAS31.

wiadomo, że modyfikacja histonów bierze udział w regulacji transkrypcji poprzez dekondensowanie zwartych struktur chromatyny w celu wiązania czynnika transkrypcyjnego. Badania interaktomów oparte na genomie 3C zidentyfikowały aktywne i nieaktywne przedziały chromatyny w jądrze, z aktywnymi przedziałami wzbogaconymi znakami histonów, które aktywują transkrypcję genu, takimi jak H3K9ac32. Dlatego zapytaliśmy, czy aktywne wzmacniacze POU5F1 i SOX2 selektywnie oddziałują z regionami dystalnymi wykazującymi aktywną transkrypcję genów. Profile tagów ChIP-Seq H3K27me3, h3k4me1, H3K4me2, h3k27ac, H3K9ac, H4K20me1 i h3k36me3 w komórce H1 ES line33 zostały użyte do analizy wzorców histonowych związanych z interaktomami. Znaczniki ChIP-Seq wokół stron interakcji enhancer zostały policzone i znormalizowane 34 i wizualizowane jako boxplot. Jak zauważono, interaktomy POU5F1 i SOX2 mają wyższe profile intensywności H3K4me1, H3K4me2 i H4K20me1, które są znakami aktywnej regulacji genów (Fig. 4a). W porównaniu z przypadkowymi miejscami we wczesnych obszarach replikacji DNA, badane znaki histonowe są na ogół bardziej wzbogacone w INTERAKTOMIE POU5F1 niż w interaktomie SOX2, przy czym H3K4me1 i H3K9ac są najistotniej wzbogaconymi miejscami w INTERAKTOMIE POU5F1 (P < 2 .2 × 10-16 dla obu znaków, niesparowany test rangi Wilcoxona-suma). Co ciekawe, znak wyciszania genu h3k36me335 za pośrednictwem Polikomb nie jest wzbogacony w żaden interaktom (odpowiednio P = 0,485, P = 0,922). Zbadaliśmy również związek interakcji wzmacniaczy POU5F1 i SOX2 z miejscami 5-hydroksymetylocytozyny (5-hmC) w genomie. Jak wykazały poprzednie badania, genomowe miejsca 5-hmC są wzbogacane aktywnymi wzmacniaczami w hESCs36. Ponieważ wzmacniacze POU5F1 i SOX2 przylegają do stron 5-HMC (w granicach 5 kb), zapytaliśmy, czy interaktomy wzmacniacza są również wzbogacone o Strony 5-hmC. 4B, miejsca 5-hmC są wzbogacone w bliskości INTERAKTOMÓW POU5F1 i SOX2 w porównaniu do losowych miejsc we wczesnych obszarach replikacji DNA (P< 2,2 × 10-16, P = 0,047, odpowiednio, test Kołmogorowa-Smirnowa). Tak więc, dwa enhancer interaktomy w hESCs posiadają epigenetyczne cechy aktywnych wzmacniaczy, które mogą ułatwiać aktywną regulację transkrypcji genów.

(a) Boxplot różnych znaków histonów wokół oddziałujących witryn i losowych witryn. Znaczniki ChIP-Seq w granicach ±5 kb od strony interakcji zostały zliczone i znormalizowane. B) porównano rozkład odległości między oddziaływującymi miejscami i przypadkowymi miejscami do najbliższego miejsca 5-hmC. 100 000 losowych miejsc zostało wygenerowanych z wczesnych obszarów replikacji DNA dla porównania.

(a) porównanie wartości rpkm dla oddziałujących genów (geny o TSS ≤ 10 Kb z oddziałujących stron) ze wszystkimi ludzkimi genami Ensembl (wykorzystano średnie wartości rpkm z replikowanych danych RNA-Seq w kodowaniu). (B)analizowano ekspresję różnicową w celu porównania genów interactome w hESCs i fibroblastach płodu.

Status transkrypcyjny genów wzmacniających POU5F1 i SOX2 oddziałujących na siebie

aby zrozumieć status transkrypcyjny genów związanych z wzmacniaczami POU5F1 i SOX2, przeanalizowaliśmy dane z transkryptomu RNA-Seq w hESCs i fibroblastach płodu płucnego 37, koncentrując się na genach, które mają właściwości wzmacniające POU5F1 i SOX2.TSS w granicach 10 Kb od stron oddziałujących na enhancer. W przypadku hESCs ekspresja genów oddziałujących wzmacniająco POU5F1 i SOX2 jest znacznie wyższa niż w przypadku wszystkich genów w hESCs (P = 7,5 × 10-6 i P = 1.2 × 10-6, odpowiednio, przez niesparowany test sumy Rang Wilcoxona; Fig. 5A), wskazujący, że interaktomy są wzbogacone o aktywnie transkrybowane geny. Tak więc, aktywne wzmacniacze POU5F1 i SOX2 mogą być zaangażowane w pośredniczenie w transkrypcji powiązanych genów dystalnych. Analiza transkryptomu RNA-Seq wykazała również, że geny pierwotnie związane z aktywnymi wzmacniaczami POU5F1 i SOX2 w hESCs są regulowane w dół w zróżnicowanych fibroblastach płuc (P = 1,2 × 10-5 i P = 0,013, odpowiednio, przez sparowany test Wilcoxona rank-sum; Fig.5B). Wyniki te wskazują, że wzmacniacze tych dwóch genów związanych z stemnessem oddziałują z grupą genów, która jest silnie wyrażona w hESCs, ale tłumiona w fibroblastach.

geny dystalne związane z wzmacniaczem POU5F1 są zaangażowane w obwody regulacyjne pluripotencji

aby zbadać, czy geny wzmacniające POU5F1 i sox2 przyczyniają się do samoodnawiania i pluripotencji hESCs, przeanalizowaliśmy dane z ekranu interferencji RNA w całym genomie za pomocą testu reporterowego promotora POU5F1 w hESCs38. Interferencja transgenicznej ekspresji POU5F1-GFP jest oznaczana ilościowo za pomocą wartości Fav odzwierciedlających intensywność fluorescencji GFP, która reprezentuje skłonność do wiązania się z stemness ( Fig.6A). W porównaniu do wszystkich badanych genów, geny oddziałujące wzmacniacz POU5F1 (geny najbliżej oddziałujących miejsc, z odległością genomową od TSS do oddziałujących miejsc mniejszą niż 10 kb) wykazują tendencję do zmniejszania się wartości Fav, chociaż statystycznie nieistotne (P = 0,08, niesparowany test Wilcoxona rank-sum). Jednak w przypadku genów ukierunkowanych na SOX2 wartości Fav są podobne do wszystkich genów przesiewanych (P = 0.98, niesparowany test Wilcoxona rank-sum). W związku z tym, na podstawie tych danych, geny w INTERAKTOMIE POU5F1 wydają się być ważniejsze dla pluripotencji komórek macierzystych niż geny w interaktomie SOX2.

(a) korelacja genów interaktomów z pluripotencją. Interakcyjne geny przesiewane w teście siRNA przy użyciu genu reporterowego POU5F1-GFP w hESCs zostały włączone do analizy. Rozkład wartości Fav (zmiana fluorescencji) dla oddziałujących genów porównuje się ze wszystkimi 21122 genami przesiewanymi w oryginalnym teście. B) Analiza ekspresji różnicowej zidentyfikowanych regulatorów transkrypcyjnych w hESCs i fibroblastach płodu.

analiza ontologii Genu39 39 genów oddziałujących ze sobą POU5F1 i 20 genów oddziałujących na SOX2 wykazała, że znaczna część z nich bierze udział w regulacji transkrypcji (odpowiednio 30,8% i 35,0% dla INTERAKTOMÓW POU5F1 i SOX2; Tabela uzupełniająca 5, 6) i dystrybuowane do 8 i 4 różnych oddziałujących domen w interakcjach POU5F1 i SOX2, odpowiednio, z nie więcej niż 3 genami w jednej oddziałującej domenie. Analiza ekspresji różnicowej tych regulatorów transkrypcyjnych w hESCs i fibroblastach płodu wykazała, że 9 z tych w interaktomie POU5F1 (11 z 12 zidentyfikowanych regulatorów transkrypcyjnych ma Dane RNA-Seq) ma wyższą ekspresję w hESCs ( Fig.6b), co sugeruje aktywną rolę tych genów w sieci regulacyjnej pluripotencji w hESCs. Dla tych regulatorów transkrypcyjnych w interaktomie SOX2, 3 z 5 wykazało zwiększoną ekspresję w hESCs. Dlatego też POU5F1 enhancer interactome może odgrywać większą rolę w pluripotencji komórek macierzystych niż sox2 enhancer interactome.

kilka miejsc wiążących czynnik transkrypcyjny jest wzbogaconych interakcjami wzmacniacza POU5F1 i SOX2

Wiązanie czynnika transkrypcyjnego jest jedną z cech, które posiadają wzmacniacze i może ułatwiać interakcje chromatyny z chromatyną dalekiego zasięgu wzmacniacza z dystalnymi genami. Domniemane wzmacniacze POU5F1 i SOX2 są znanymi gorącymi punktami asocjacji wielu białek wiążących DNA w hESCs. Aby zrozumieć, czy pewne czynniki transkrypcyjne są wzbogacone w regiony oddziałujące wzmacniająco na POU5F1 i SOX2, systematycznie analizowaliśmy Profile ChIP-Seq 32 białek wiążących DNA w hESCs (patrz metody). Znormalizowane liczniki znaczników ChIP-Seq wokół środka stron interakcji 4C zostały obliczone i wizualizowane za pomocą boxplot (rysunek 7A). W ramach kontroli obliczono również liczby wokół środka losowych miejsc we wczesnych obszarach replikacji DNA. Analiza statystyczna wykazała, że miejsca ATF3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG, RAD21 i YY1 były najbardziej wzbogaconymi białkami w obu interaktomach wzmacniających w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,01, niesparowany test Wilcoxa rank-sum). Jednakże, czynnik transkrypcyjny OCT4 związany z pluripotencją nie jest wzbogacony w INTERAKTOMIE POU5F1 ani SOX2. Dlatego atf3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG, RAD21 i YY1 są charakterystycznymi białkami w interakcjach wzmacniaczy POU5F1 i SOX2 w hESCs, a ich obecność może być funkcjonalnie ważna.

(a) Pudełka różnych białek wiążących DNA wokół miejsc interakcji wzmacniacza i losowych miejsc (z wczesnych obszarów replikacji DNA). Znaczniki ChIP-Seq w granicach ±5 kb od strony interakcji zostały zliczone i znormalizowane. (B) RAD21 współlokalizuje się z innymi czynnikami transkrypcyjnymi w interaktomach. Profile średniej intensywności wokół miejsc szczytowych RAD21 w interaktomach POU5F1 i SOX2 w hESCs są wykreślane dla czynników transkrypcyjnych ATF3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG i YY1.

RAD21 jest potencjalnie w kompleksie z innymi czynnikami transkrypcyjnymi pośredniczącymi w interakcjach wzmacniacza

jak pokazano na fig. RAD21 jest częścią kompleksu spójności znanego jako sieciujący łańcuch DNA. Wykazano, że kohezyna pośredniczy w zapętleniu dystalnego wzmacniacza Pou5f1 z promotorem genu Pou5f1 w komórkach myszy ES40. Zgodnie z poprzednim raportem, że Rad21 współpracuje z Ctcf i innymi czynnikami transkrypcyjnymi w utrzymaniu tożsamości komórek ES myszy 40, miejsca RAD21 w interakcjach POU5F1 i SOX2 w hESCs są współwystępowane przez czynniki transkrypcyjne. Wykresy agregacji wyraźnie ilustrują sygnały szczytowe profili wiązania ATF3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG i YY1 w centrum miejsc RAD21 w interaktomach POU5F1 i SOX2 ( Fig.7B). Knockdown Gabpa w komórkach ES myszy zmniejsza ekspresję Oct3 / 4, podczas gdy nadekspresja Gabpa utrzymuje ekspresję Oct3 / 4 nawet bez LIF w hodowli komórek ES myszy 41. W całym genomie siRNA w hESCs38, knockdown większości wzbogaconych białek, takich jak RAD21, CTCF, GABPA, JUND, NANOG i YY1, znacznie zmniejszył ekspresję transgenicznego promotora POU5F1 połączonego z reporterem GFP, z wartościami Fav -1.50421, -1.05828, -1.44161, -1.07731, -1.82749, -2.57204, odpowiednio (w obrębie 25% wszystkich badanych genów). Aby lepiej zrozumieć interakcje chromatyna-chromatyna, zastosowaliśmy fluorescencyjną hybrydyzację DNA in situ (FISH) w celu wizualizacji współlokalizacji dwóch genomowych loci na poziomie pojedynczej komórki. Locus genu RARG na chromosomie 12 został zidentyfikowany w interaktomie POU5F1 w hESCs. Ostatnio wykazano, że RARG odgrywa bardzo ważną rolę w pluripotencji i może zwiększać indukcję komórek iPS o dwie magnitude42. Inny locus na chromosomie 12, który nie jest częścią INTERAKTOMU POU5F1 został użyty jako kontrola. Częstotliwość współlokacji między locus RARG (chr12: 51751589-51956291) i locus POU5F1 (chr6: 31169844-31340561) okazały się 1,67 razy wyższe niż częstotliwość między locus kontrolnym (chr12: 80380971-80564119) i locus POU5F1 (9,35% versus 5,61%, p < 0.05, rys. uzupełniające 3A). Wyższa częstotliwość kontaktu między loci RARG i POU5F1 jest zgodna z naszymi danymi dotyczącymi sekwencjonowania i sugeruje, że między tymi dwoma loci powstają bardziej stabilne interakcje. Badanie loci RARG i control (dodatkowe rys. 3b) ujawnił, że istnieje więcej RAD21 i innych miejsc wiążących czynnik transkrypcyjny w locus RARG z częstą Ko-lokalizacją. Zbieżność częstości interakcji chromosomowych z miejscami wiązania wielu czynników transkrypcyjnych zawierającymi RAD21 sugeruje, że RAD21 może współpracować z innymi czynnikami transkrypcyjnymi w celu organizowania oddziaływań chromatyna-chromatyna dalekiego zasięgu. Tak więc RAD21, wraz z wieloma czynnikami transkrypcyjnymi, prawdopodobnie przyczyni się do budowy chromosomów wyższego rzędu otaczających wzmacniacze POU5F1 i SOX2 w hESCs jako część sieci pluripotencji. Konieczne są jednak dodatkowe badania molekularne, aby potwierdzić tę hipotezę pochodzącą z badania 4c-Seq.