- Streszczenie
- 1. Wprowadzenie
- 2. Metody
- 2.1. Materiały
- 2.2. Króliki i preparaty tkankowe
- 2.3. Ocenę histologiczną chrząstki
- 2.4. Test TUNELA
- 2.5. Fluorescencyjny ilościowy PCR
- 2.6. Analiza statystyczna
- 3. Wyniki
- 3.1. Zwyrodnienie histologiczne wywołane przez ACLT u królików zostało zmniejszone przez DHJST
- 3.2. DHJST hamowało apoptozę komórek chrząstki
- 3.3. Hamowanie ekspresji VEGF i HIF-1α w komórkach chrząstki jest związane z DHJST wywiera efekt terapeutyczny
- 4. Dyskusja
- 5. Wnioski
- finansowanie
Streszczenie
Du-Huo-Ji-Sheng-Tang (DHJST) jest tradycyjnym chińskim lekiem ziołowym stosowanym w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów. W niniejszym badaniu badano terapeutyczny wpływ DHJST na degradację chrząstki w króliczym modelu choroby zwyrodnieniowej stawów. W stawach kolanowych królików przeprowadzono przecięcie więzadła krzyżowego przedniego (ACLT) w celu wywołania Doświadczalnej choroby zwyrodnieniowej stawów. Pod koniec szóstego tygodnia 30 królików z ACLT podzielono na sześć grup, grupę kontrolną, grupę DHJST i Grupę Osaminethacine (OSA), które były obserwowane przez kolejne 4 tygodnie. Pozostałe trzy grupy królików z ACLT nie były leczone DHJST lub OSA, które poświęcano po 6 tygodniach i służyły jako 6-tygodniowa Kontrola punktu czasowego. Wyniki wskazywały, że pod koniec szóstego tygodnia po zabiegu stwierdzono znamienne zwyrodnienie histologiczne w grupie kontrolnej w porównaniu z grupą prawidłową. W grupie kontrolnej średni wynik degeneracji histologicznej był dalszy wzrost w 10 tygodniu, a w grupie DHJST był znacznie niższy średni wynik degeneracji histologicznej w porównaniu z grupą kontrolną. W celu zbadania potencjalnego mechanizmu wykryto poziom ekspresji VEGF i HIF-1α. Ekspresja mRNA VEGF i mRNA HIF-1α jest niska w grupie normalnej, podczas gdy aktywność zwiększa się stopniowo w grupie kontrolnej. Jednak w porównaniu do tej samej grupy modelu punktu czasowego aktywność VEGF i HIF-1α znacznie spadła w grupie DHJST. Podsumowując, DHJST wywiera znaczący wpływ terapeutyczny na króliki z chorobą zwyrodnieniową stawów, a mechanizmy są związane z hamowaniem ekspresji VEGF i HIF-1α.
1. Wprowadzenie
choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest postępującą i wyniszczającą chorobą, która może minąć lata, aby klinicznie ujawnić się u dotkniętych osób. Starzenie się chrząstki i starzenie chondrocytów odgrywają ważną rolę w patogenezie i rozwoju OA. Podczas rozwoju OA często dochodzi do ogniskowego wzrostu obumierania komórek. Wiele doniesień wykazało, że starzenie chondrocytów przyczynia się do ryzyka degeneracji chrząstki poprzez zmniejszenie zdolności chondrocytów do utrzymania i naprawy tkanki chrząstki stawowej . Ponieważ teoretyzuje się, że każdy chondrocyt jest odpowiedzialny za utrzymanie otaczającej go macierzy pozakomórkowej, a cząsteczki macierzy wytwarzane w jednym obszarze tkanki mają bardzo ograniczoną zdolność do trawersowania tkanki, ogniskowa utrata żywotnych komórek może być częściowo odpowiedzialna za niezdolność tkanek do naprawy drobnych uszkodzeń .
obecnie nie ma lekarstwa na OA, a dostępne zabiegi tylko spowalniają postęp choroby . W ciągu ostatnich 20 lat tradycyjna medycyna chińska (TCM) odnotowała znaczny postęp w stosunku do OA, na przykład w poprawie wyników klinicznych pacjentów, hamowaniu reakcji zapalnych i degeneracji chrząstki . Badania In vivo i in vitro wykazały również, że formuła chińskich ziół ma wiele kompleksowych działań przeciwko OA . Du-Huo-Ji-Sheng-Tang, który składa się z Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi i Poria, jest szeroko stosowany w leczeniu OA. Może poprawić objawy kliniczne, funkcję kolana i jakość życia pacjentów . Opierając się na naszej wiedzy na temat patogenezy OA w TCM, zbadaliśmy wpływ DHJST na zapobieganie degeneracji chrząstki OA u królików i zaobserwowaliśmy jego mechanizmy.
2. Metody
2.1. Materiały
kolorymetryczny system wykrywania apoptozy (test tunelowy) uzyskano z Nanjing Jiancheng Biotech Company (Chiny). Trizol total RNA extraction kit, DNA molecular marker, SYBR Premix EX TaqTM i Perfect Real time kit zostały zakupione od Invitrogen Co. USA). Zioła w DJST (złożone z Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi i Poria, dostarczone przez Shanghai Huayu Chinese Herbs Co. Ltd., Chiny) zostały akredytowane przez farmakognozystę zgodnie ze standardowymi protokołami, przygotowanymi przez Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, składniki zostały zmieszane w kolejności ze stosunkiem 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 (Sucha masa), leki ekstrahowano standardowymi metodami zgodnie z chińską Farmakopeą (China Pharmacopoeia and Committee, 2000). Te surowe leki moczono w wodzie destylowanej i gotowano przez 30 minut dwa razy, a roztwór leku przesączono przez siatkę, a następnie przesącz zatężono do 4 g mL−1 za pomocą pompy próżniowej, a następnie przechowywano w temperaturze -20°C do czasu użycia. Osaminethacine (OSA), każda tabletka zawiera 25 mg indometacyny i 75 mg aminoglukozy (dostarczanej przez Hebei Jizhong Pharmaceutical Co. Ltd., Chiny), był stosowany jako lek kontroli pozytywnej.
2.2. Króliki i preparaty tkankowe
czterdzieści osiem-Miesięczne Nowozelandzkie białe króliki zostały dostarczone przez Centrum zwierząt doświadczalnych Chińskiej Akademii Nauk. Trzydzieści królików poddano jednostronnemu przecięciu więzadła krzyżowego przedniego (ACLT) w znieczuleniu ogólnym. Normalne króliki nie przeszły procedury.
pod koniec szóstego tygodnia 30 królików z ACLT podzielono na sześć grup, grupę kontrolną, grupę DHJST i grupę OSA, które były obserwowane przez kolejne 4 tygodnie. Pozostałe trzy grupy królików z ACLT nie były leczone DHJST lub OSA, które poświęcano po 6 tygodniach i służyły jako 6-tygodniowa Kontrola punktu czasowego. Wywary podawano doustnie w dawce 0.923 g (kg−1·d−1) przez 4 tygodnie królikom z grupy OSA podawano osa 0,09 g (kg−1·d−1) przez okres 4 tygodni, modelową grupę kontrolną i grupę normalną podawano doustnie z taką samą objętością fizjologicznego roztworu soli fizjologicznej.
do pobierania próbek poświęcano króliki. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. eksperymentów na zwierzętach Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Szanghaju w Chinach. Usunięto kości piszczelowe królika i natychmiast magazynowano chrząstkę stawową piszczelową w temperaturze -80°C. Kości piszczelowe zostały starannie rozcięte i usunięte z sąsiednich mięśni i natychmiast zamocowane w 10% formalinie przez 24 godziny. Kości piszczelowe następnie przez 4 tygodnie odwapniano w 100 g / l kwasu tetraoctowego etylenodiaminy, przemyto w PBS, odwodniono szeregiem etanolu i osadzono w parafinie w standaryzowany sposób w celu zapewnienia właściwej orientacji. Fragmenty tkanki parafinowej (7 µm) wycięto w standaryzowany sposób. Sekcje były deparaffinizowane do analiz histochemicznych.
2.3. Ocenę histologiczną chrząstki
przeprowadzono na stawach kości udowej królików w grupie DHJST, OSA i grupie kontrolnej. Sekcje zostały zabarwione Safraniną o-fast green. Te sekcje histologiczne z każdego miejsca zostały ocenione przy użyciu zmodyfikowanego systemu klasyfikacji Mankina (Tabela 1) przez dwóch niezależnych, certyfikowanych przez Zarząd patologów weterynaryjnych.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.4. Test TUNELA
apoptozę indukowaną przez H2O2 wykryto poprzez wykonanie testu końcowego deoksynukleotydowo-transferazy dUTP nick end-labeling (TUNEL) z użyciem zestawu Apo-DirectTM (CalBiochem, San Diego, CA). TUNEL został wykonany zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko, po wstępnej obróbce i ekspozycji na H2O2, komórki zbierano, przemywano, utrwalano, przenikano i znakowano w celu przerwania nici DNA, a następnie analizowano na cytometrze przepływowym Epics Elite (Beckman-Coulter, Miami, USA). Wszystkie testy przeprowadzono w trzech egzemplarzach.
2.5. Fluorescencyjny ilościowy PCR
całkowity RNA wyekstrahowano z 50 mg chrząstki stawowej kości piszczelowej przy użyciu odczynnika Trizol. Syntezę cDNA przeprowadzono przy użyciu 4 µg całkowitego RNA na próbkę z losowymi starterami i odczynnikami zawartymi w zestawie do syntezy cDNA pierwszej nici Revert Aid. W systemie Rotor-Gene 2000 (Australia) wykorzystano dwa mikro litry (2 µL) każdej próbki do badania PCR w czasie rzeczywistym. Względną ilość obliczono stosując próg cyklu delta () względną ilość. Wyznaczono cykl progowy () dla endogennego kontrolnego mRNA CAPDH i sygnałów docelowych, a względną kwantyfikację RNA obliczono metodą porównawczą, gdzie sekwencje
starterów stosowanych dla naczyniowego czynnika wzrostu śródbłonka (VEGF) wynoszą: 5′-TGCCCCCCGAGGTTCA-3(naprzód) i 5′-GGCCCTGGTGAGGTTTGAT-3(rewers) (Długość produktu: 75 bp).Sekwencje starterów stosowanych do czynnika indukowanego niedotlenieniem-1α(HIF-1α) są następujące: 5′-CAGTGCAAAAGACAGGTGGAAG-3 (do przodu) i 5′-CCCTGTATGGTGGTGATGTTGT-3 (do tyłu) (Długość produktu: 107 Pz).Sekwencje starterów używanych do GAPDH to: 5′-CCGAGGCCACTAAAGG-3(do przodu) i 5 ’ -GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3(do tyłu) (Długość produktu: 88 bp).
2.6. Analiza statystyczna
wszystkie wyniki zostały wyrażone jako średnia i odchylenie standardowe (SD). Dane pomiarowe analizowano przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA, SPSS 11.0). Dane Rank były analizowane z ridit. Wynik P <.05 uznano za istotne statystycznie.
3. Wyniki
3.1. Zwyrodnienie histologiczne wywołane przez ACLT u królików zostało zmniejszone przez DHJST
reprezentatywne sekcje histologiczne przedstawiono na fig. 1. Pod koniec 10 tygodnia obserwowaliśmy prawidłową integralność powierzchni stawowej w normalnej grupie (ryc. 1(A)). W grupie kontrolnej, ze zwiększoną degeneracją, zaobserwowano utratę Safraniny o-fast green barwienia towarzyszącego powstawaniu rozszczepów, które rozciągały się na strefy środkowe i głębokie (Fig.1(b)), a w grupie DHJST utracono wczesne łagodne migotanie i zaobserwowano utratę Safraniny o-fast green barwienia wraz z grupowaniem chondrocytów (Fig. 1(c)). Grupa OSA, z utratą Safraniny o-fast green barwienie zmiany te były podobne do grupy DHJST (rycina 1 (d)). Pod koniec szóstego tygodnia po zabiegu stwierdzono istotne różnice histologiczne w grupie kontrolnej w porównaniu z grupą prawidłową (P < .01). W grupie kontrolnej średni wynik dla szybkiego zielonego zabarwienia Safraniną o był dalszy wzrost w 10. tygodniu w porównaniu z wynikiem w 6. tygodniu (P < .01) (Rysunek 2 (A)). W 10 weekend, były znaczące różnice w wyniku Mankina między grupą kontrolną a grupą DHJST, był znacznie niższy średni wynik dla Safranin o-fast green barwienia w grupie DHJST w porównaniu z grupą kontrolną (p <.2(B)) oraz brak istotnych statystycznie różnic w wyniku Mankina między grupą DHJST a grupą OSA (P >.05).
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. Wyniki przedstawiono jako średnie ± SD (n = 5 na grupę) w każdej kolumnie. *P <.01 w porównaniu z grupą kontrolną choroby zwyrodnieniowej stawów w 6. tygodniu, * * p < .01, w porównaniu z grupą kontrolną choroby zwyrodnieniowej stawów.
3.2. DHJST hamowało apoptozę komórek chrząstki
pod koniec szóstego tygodnia po zabiegu wskaźnik komórek apoptozy w grupie kontrolnej w porównaniu z grupą prawidłową wykazywał istotne różnice (P <.01). W grupie kontrolnej wskaźnik komórek apoptozy był nadal znacznie zwiększony ( ze średniej ± SD 0,35 ± 0,13 w szóstym tygodniu do 0,62 ± 0,10 w dziesiątym tygodniu; p <.01) (Rys. 2 lit. c)). Pod koniec 10 tygodnia, w porównaniu z grupą DHJST, wskaźnik komórek apoptozy znacząco wzrasta w grupie kontrolnej (P < .01) (Rysunek 2 (d)). Nie stwierdzono istotnych różnic w indeksie komórek apoptozy między grupą OSA a grupą DHJST (P >.05).
3.3. Hamowanie ekspresji VEGF i HIF-1α w komórkach chrząstki jest związane z DHJST wywiera efekt terapeutyczny
Fluorescencyjny ilościowy PCR wskazuje, że ekspresja mRNA VEGF i HIF-1α mRNA są niskie w grupie normalnej; podczas gdy aktywność zwiększa się stopniowo i znacząco w grupie kontrolnej w porównaniu z grupą normalną (P < .01); w grupie kontrolnej HIF-1α w chondrocytach stawowych zaczyna wzrastać w szóstym tygodniu po operacji, dalej wzrasta w 10 tygodniu w porównaniu z szóstym tygodniem (średnia ± SD 94,21 ± 20.12 w szóstym tygodniu i 160,35 ± 72,27 w dziesiątym tygodniu; p <.05) (Tabela 2). W dziesiąty weekend ekspresja mRNA VEGF i mRNA HIF-1α w grupie DHJST była znacznie zmniejszona w porównaniu z grupą kontrolną po podaniu (P < .01). Chociaż poziom mRNA VEGF i mRNA HIF-1α w grupie OSA zmniejszał się o 4 tygodnie leczenia OSA w porównaniu z grupą kontrolną, nie stwierdzono istotnej różnicy (Tabela 3).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||
| wartości jako średnie ± SD uzyskano dla każdej grupy 5 zwierząt. * P < .05 w porównaniu ze zwierzętami z grupy kontrolnej w szóstym tygodniu. * * P < .01 w porównaniu ze zwierzętami z grupy kontrolnej w tej samej grupie kontrolnej w punkcie czasowym. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Values as means ± SD. †P > .05 compared with control group animals. ** P < .01 compared with control group animals. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Dyskusja
model ACLT jest jednym z najczęściej używanych modeli eksperymentalnych OA. ACLT królików jest coraz częściej stosowany w badaniach OA, ponieważ początek choroby jest szybki. Zastosowanie eksperymentalnych modeli ACLT ma szczególne znaczenie kliniczne, ponieważ pęknięcie ACL występuje u ludzi i prowadzi również do rozwoju OA. Badanie wskazuje, że duża ilość apoptozy chondrocytów występuje w progresywnym Stadium OA u królików wywołanym operacyjnie. Apoptoza chondrocytów jest jedną z charakterystycznych zmian chrząstki OA. Patologiczna apoptoza pod warunkiem szkodliwej stymulacji może skutkować uwolnieniem chemotaksji lub czynników zapalnych, co z kolei pogarsza uszkodzenie chrząstki i aktywuje ból . Dlatego hamowanie apoptozy chondrocytów może być ważną strategią przeciwko zmianom zwyrodnieniowym stawów kolanowych królików. Wskaźnik apoptozy chondrocytów w grupie DHJST znacznie zmniejsza się w porównaniu z grupą modelową, co sugeruje, że hamowanie apoptozy chondrocytów może być jednym z ważnych mechanizmów DHJST przeciwko zmianom zwyrodnieniowym.
poprzednie badania wykazały niedotlenienie mikrośrodowiska chondrocytów stawowych. Co ciekawe, stawy kostno-stawowe wykazywały dalszy spadek poziomu tlenu, rolę niedotlenienia w patogenezie OA . Ostatnie badania opisały, że w chondrocytach stawowych stres kataboliczny i niedotlenienie są silnymi induktorami czynnika transkrypcyjnego HIF-1, który jest głównym regulatorem adaptacji komórkowej do niskiego poziomu tlenu. HIF-1 ma kluczowe znaczenie dla przetrwania i zatrzymania wzrostu chondrocytów podczas rozwoju chrząstki, a także wytwarzania energii i syntezy matrycowej chondrocytów w zdrowej, a także chrząstce kostno-stawowej. W chrząstce kostno-stawowej poziom białka HIF – 1 jest znacznie zwiększony, a jego aktywność koreluje z nasileniem zmian zwyrodnieniowych chrząstki. Niniejsza praca dokumentuje znaczenie czynnika transkrypcyjnego HIF-1α dla utrzymania integralności niedotlenienia chrząstki stawowej. Nadmiar HIF – 1α zbiegł się ze zwiększoną apoptozą chondrocytów stawowych i doprowadził do zmian zwyrodnieniowych w stawach kolanowych królików. Po podaniu DHJST, ekspresja HIF-1α zmniejsza się w porównaniu z grupą modelową. Wyniki pokazują, że działanie DHJST na regulację funkcji chondrocytów może być spowodowane hamowaniem aktywności HIF-1α.
interesujące jest to, że różnica ekspresji VEGF i HIF-1α między grupą DHJST a grupą OSA jest znacząca po podaniu. Kilka badań wykazało, że niektóre niesteroidowe leki przeciwzapalne, takie jak indometacyna, powodują działanie przeciwzapalne niezależnie od aktywności HIF-1α, ponieważ indometacyna nie hamuje kinazy 3-fosfatydyloinozytolu lub zewnątrzkomórkowego szlaku kinazy regulowanej sygnałem/aktywowanej mitogenem kinazy białkowej, a także aktywności Erk . Natomiast indometacyna jest w stanie aktywować receptor γ aktywowany przez proliferatory peroksysomów, który nie jest wrażliwy na salicylan sodu lub aspirynę. Hamowanie kinazy 3-fosfatydyloinozytolu lub szlaku Erk jest związane z hamowaniem czynników HIF-1α i angiogennych .
hipoksja i różne czynniki wzrostu/cytokiny zwiększają ekspresję VEGF . VEGF jest nie tylko jednym z najważniejszych czynników angiogenezy, ale jest również zaangażowany w procesy zapalne w OA i przyczynia się do objawów takich jak ból i obrzęk poprzez ukierunkowanie na błony maziowe , przewlekłe odpowiedzi zapalne są często związane z produkcją czynników angiogennych, które indukują proliferację naczyń, aw reumatoidalnym zapaleniu stawów VEGF jest silnie wyrażony w komórkach maziowych . Ponieważ przeciążenie mechaniczne jest jednym z czynników sprawczych OA, zbadaliśmy jego wpływ na ekspresję VEGF na chrząstkę królika, że ekspresja VEGF zmniejsza się po podaniu DHJST, wynik wskazuje, że DHJST może chronić chrząstkę stawową poprzez hamowanie ekspresji VEGF w chondrocytach(ryc. 3).
hipotetyczne mechanizmy ochronne DHJST na degradację chrząstki.
5. Wnioski
do tej pory bioaktywne składniki w DHJST są nieznane, ale nasze badania wskazują, że DHJST wywiera znaczący wpływ terapeutyczny na OA u królików, poprzez mechanizmy hamowania apoptozy chondrocytów i regulowania ekspresji VEGF, HIF-1α w chondrocytach. Zapewnia to dowody naukowe dla kliniki, aby zastosować DHJST w leczeniu OA.
finansowanie
The Natural Science Foundation of Shanghai (numer grantu: 08jc1418800).