Medycyna eksperymentalna i terapeutyczna

wprowadzenie

astma oskrzelowa jest przewlekłą zapalną chorobą dróg oddechowych z udziałem wielu komórek zapalnych i mediatorów. Limfocyty T, szczególnie T helper (Th) 1 i Th2. odgrywają kluczową rolę windukcji zapalenia dróg oddechowych u pacjentów z astmą (1). Skomplikowane odpowiedzi immunologiczne są zdolne do indukowania niedoboru Th1 i nadpobudliwości Th2, co powoduje brak równowagi Th1 / Th2. Zaburzenie to pobudza wydzielanie immunoglobulin (Ig) i uwrażliwia mastocyty i eozynofile poprzez zmienione wydzielanie cytokin oraz powoduje zapalenie alergiczne i reaktywność dróg oddechowych (2,3).Interferon (IFN) – γ i interleukina (IL) -4 są typowymi cytokinami odpowiednio 1 i Th2.

u chorych na astmę, uporczywe zapalenie dróg oddechowych jest inicjowane przez komórki prezentujące antygen (APC), które integrują różne alergeny w sygnał dla limfocytów T i wzmacniają odpowiednią odpowiedź immunologiczną (4,5).Aktywacja komórek T wymaga sygnałów, które są inicjowane przez kompleks theTCR i klaster różnicowania (CD)28. Dojrzałe komórki dendrytyczne (MDC) wyrażają wysokie poziomy cząsteczek Ko-stymulujących D80 i CD86, które dostarczają sygnału wymaganego do aktywacji, ekspansji i różnicowania komórek T poprzez interakcję z CD28 (6). Wcześniejsze badania wykazały, że poziomy CD80 i CD86 są podwyższone u pacjentów z astmą (7,8).

w poprzednich badaniach dotyczących modeli astmatycznych wykazano,że MDC indukują polaryzację Th2, zwiększają wydzielanie IL-4, zmniejszają produkcję IFN-γ i indukują zapalenie eozynofilowe (9,10). Jednakże brak jest badań oceniających wpływ knockdown CD80 i CD86 w DCs na różnicowanie i wydzielanie cytokin przez limfocyty pomocnicze T w modelach astmy astmatycznej.

w niniejszym badaniu sygnały Ko-stymulujące aktywację limfocytów T były blokowane przez supresję ekspresji cząsteczek CD80 i Cd86 w DCs z wykorzystaniem małego interferującego RNA (siRNA), a także oceniano wpływ knockdown CD80 i CD86 na poziomy ekspresji typowych cytokin th1 / Th2 IFN-γ i IL-4. W związku z tym zbadano potencjał CD80 i CD86 jako celów zastosowania interferencji RNA (RNAi) w celowaniu terapeutycznym astmy.

materiały i metody

Zwierzęta

łącznie 20 zdrowych myszy bez swoistych patogenów gradeBALB / c (6-8 tygodni; średnia waga, 18±2 g) zostały zakupione odcentrum zwierząt doświadczalnych Uniwersytetu Sun Yat-Sen (Guangzhou, Chiny). Eksperymenty przeprowadzono według toprotokoli zatwierdzonych przez Komitet Badań nad zwierzętami Sun Yat-SenUniversity.

modele astmy

w sumie 20 myszy zostało losowo przydzielonych do dwóch grup: i) grupy astmatycznej I ii) grupy kontrolnej group.In Grupa astmatyczna, każda mysz była uczulona na albuminę jajową(OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dootrzewnowo w dniach 1, 14 i 21 z 100 µg komórek jajowych, które emulgowano w 20 mg ałunu(Guangzhou Chemical Reagent Co., Guangzhou, Chiny). Następnie w dniach 28-34 myszy poddawano prowokacji aerozolowej 5% komórek jajowych przez 30 minut/dobę w hermetycznych pojemnikach (o wymiarach 50×50×50 cm). W normalnej grupie kontrolnej myszy uwrażliwiono i poddano działaniu równoważnej ilości roztworu soli zamiast roztworu białka komórki jajowej. W ciągu 24 godzin od ostatniej próby myszy zostały uśmiercone przez zatwierdzoną procedurę zwichnięcia szyjki macicy przeprowadzoną przez wykwalifikowany i w pełni wyszkolony personel. Płuczki usunięto, a następnie utrwalono w 10% etanolu przez 24 godziny.próbki odwodniono, osadzono w parafinie i zabarwiono hematoksyliną i eozyną, jak opisano wcześniej (11). Patologiczne zmiany w oskrzelach i tkance płucnej oceniano w ramach mikroskopu świetlnego Nikon Eclipse Ti (Nikon Corporation, Tokio, Japonia).

rozdzielenie szpiku kostnego

wszystkie myszy zostały uśmiercone przez zwichnięcie szyjki macicy 24h po ostatnim wyzwaniu. Szpik kostny został wypłukany z kości piszczelowej i piszczelowej pożywką hodowlaną Rpmi-1640 (Gibco; ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Po centryfugacji przy 250 × g przez 5 minut, komórki leczono buforem do lizy krwinek czerwonych (RBC) (CWBio Co., Ltd., Pekin, Chiny), przemyto roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), odwirowano w temperaturze 250 × gfor 5 min i hodowano w RPMI-1640 uzupełnionym rekombinowanym czynnikiem stymulującym kolonie makrofagów granulocytów (Rmgm-CSF;Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ, USA; 10 ng/ml) i rmIL-4(Peprotech; 10 ng/ml) były używane z kolei. Po 6 dniach hodowli dodano 1µg / ml lipopolisacharydu (LPS; Sigma-Aldrich), a te adhezyjne mDCs zebrano w dniu 7. DCs barwiono w temperaturze 4°Cfor 30 min izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)-skoniugowanym anty-CD11c (5 µg/ml; 11-0114), fikoerytryną (PE)-skoniugowanym anty-CD80 chomika (5 µg/ml; 12-0801), FITC-skoniugowanym anty-CD86 (5 µg/ml; 11-0862) i PE-skoniugowanym kompleksem przeciw-majorhistokompatybilności szczura (MHC) Ii (5 µg/ml; 12-5322; allebioscience, Inc., San Diego, CA, USA) przeciwciała monoklonalne, a następnie analizowano je za pomocą cytometrii przepływowej (BD FACSVerse; BDBiosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)w celu określenia pozytywnego tempa ekspresji znakowanego antygenu.

siRNA i transfekcja

specyficzne sekwencje siRNA (Tabela I) skierowane na CD80 i CD86 zostały zaprojektowane i wybrane zgodnie z metodami gu i wsp. (12). Wszystkie siRNA zostały zakupione od Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Szanghaj, Chiny). Transfekcję przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta forLipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.).Krótko mówiąc, DCs hodowano w 24-studzienkowej płytce do hodowli tkankowej przy wielkości 1×105 komórek/studzienkę w dniu poprzedzającym transfekcję. Toprepare lipid-siRNA kompleksy, 3 µl Lipofectamine 2000 został inkubowany w 50 µl Opti-MEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a 12 µl wskazanego siRNA łączono z 50 µl Opti-MEM. Rozcieńczoną lipofektaminę 2000 i siRNA następnie mieszano i inkubowano przez kolejne 20 minut w temperaturze pokojowej w celu utworzenia kompleksu.Następnie kompleks inkubowano z DCs w płytce 24-studziennej w temperaturze 37°C w 5% nawilżonym CO2 w atmosferze powietrza przez 6 godzin. po przeprowadzeniu cotransfekcji do każdej studzienki dodano równoważne ilości sirna CD80:Lipofectamine 2000 i siRNA CD86:Lipofectamine 2000. FAM-scrambled-siRNA został użyty jako kontrola negatywna w celu określenia skuteczności transfekcji. Ustalono trzy grupy transfekowanych DCs: w grupie innej niż siRNA dodano tylko Lipofektaminę 2000, bez dodawania do DCs żadnej z nich. W grupie siRNA MDC były transportowane przez siRNA specyficzne dla CD80 i CD86. W grupie negativesiRNA, MDC były transfekowane przez niespecyficzny nie targetingFAM-siRNA, który nie ma homologii z docelowymi RNA.Eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach dla każdej próbki.Skuteczność transfekcji określono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Nikon Eclipse Ti, Nikon Corporation) i wykryto za pomocą cytometrii.

odwrotna transkrypcja-ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (RT-qPCR)

w celu oceny poziomu ekspresji mRNA CD80 i CD86PO zakończeniu transfekcji przeprowadzono RT-qPCR. Sekwencje starterowe (tabela II) zostały zaprojektowane zgodnie z genbankiem i zsyntetyzowane przez DaAn Gene Co., Ltd. Sun Yat-SenUniversity (Guangzhou, Chiny). Po 24 godzinach po transfekcji, całkowity RNA 1×106 DCs ekstrahowano przy użyciu odczynnika TRIzol (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) oraz odwrotną transkrypcję i amplifikację za pomocą QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit (Qiagen GmbH,Hilden, Niemcy) W Roche LightCycler 480 (Roche Diagnostics,Bazylea, Szwajcaria). Amplifikacje przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta dla QuantiTect SYBR Green RT-PCRkit (Takala, Japonia). Warunki amplifikacji wynosiły 40 cykli 93°C przez 3 minuty, 93°C przez 30 sekund, 55°C przez 45 sekund i 72°C przez 45 sekund. każda próbka była podawana do każdej z trzech studni. Relativegene expression levels were calculated using the quantificationcycle (Cq) method with normalization to glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) as the reference gene using 2−∆∆Cq(13).

cytometria przepływowa

aby wykryć dodatnie szybkości ekspresji CD80 i cd86 w DCs po transfekcji, przeprowadzono cytometrię przepływową na bramce MHC II / CD11c dla CD80 i cd86. Sześć godzin po transfekcji DCs przemyto dwukrotnie PBS i inkubowano z przeciwciałem znakowanym fluorescencyjnie w temperaturze 4°C przez 30 minut.Następnie komórki przemyto ponownie PBS i utrwalono 10 g/l paraformaldehydu. Stosowano następujące przeciwciała monoklonalne przeciwko mysim: PE-anti-MHC II, FITC-anti-CD11c, PE-anti-CD80 i FITC-anti-CD86, jak wspomniano powyżej. Wszystkie analizy flowcytometryczne przeprowadzono przy użyciu izotypowych kontrolek IgG.

oddzielenie komórek T

śledziony usuwano po poddaniu myszy leczeniu przez zwichnięcie szyjki macicy. Limfocyty T oddzielono przy użyciu własnego ośrodka oddzielającego limfocyty, zgodnie z receptorem producenta (Dakewe Biotech Co., Ltd., Chiny). Przed dalszym przetwarzaniem gęstość komórek dostosowano do 1×109/l.

Mieszana reakcja limfocytów (MLR)

w płytkach 96-studzienkowych w stosunku 1:10 hodowano DCs Pochodzące ze szpiku kostnego myszy z astmą(1×104/Studzienka) i zdrowe komórki T (1×105 / studzienka). Systemy współkulturowe podzielono na trzy grupy: i) grupę Nie-siRNA, ii) grupę siRNA, III) ujemną grupę siRNA, z DCs z odpowiadających im grup, jak opisano powyżej. Następnie do każdej studzienki dodawano komórki jajowe do stężenia 10 mg/l w całkowitej objętości 200 µl. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C w 5% nawilżonym CO2 w atmosferze powietrza przez 72 godziny.

enzyme-linked immunosorbent assays(Elisa)

Po 3 dniach współkultury supernatant pobrano. Poziomy IFN-γ i IL-4 analizowano przy użyciu zestawów ELISA specyficznych dla IFN-γ i IL-4 (Dakewe Biotech Co., Ltd.) zgodnie z instrukcją producenta. Wartości absorbancji odczytano przy 450 Nm przy użyciu Multiskan MK3 (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

Analiza statystyczna

analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania SPSSsoftware w wersji 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Dane są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Badania przeprowadzono w trzech egzemplarzach dla każdej myszy. Porównania statystyczne między grupami przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji,a porównania w grupie przeprowadzono za pomocą testu studenta. Różnice między grupami uznano za statystycznie istotne, gdy P < 0,05.

wyniki

Model astmatyczny

20 zdrowych myszy BALB / c klasy SPF przydzielono do grup kontrolnych astmatycznych i normalnych, z 10 myszami w każdej. Allmice oceniano w końcowej analizie bez eksperymentalnej utraty zwierząt. Zgodnie z patologią tkanki płucnej, sekcje płuc od myszy immunizowanych komórkami jajowymi wykazały wyraźne zapalenie dróg oddechowych z naciekami okołooskrzelowymi i okołonaczyniowymi. Naciekanie to składały się głównie z eozynofili i limfocytów, a narządy oddechowe wykazywały pogrubienie błony śluzowej oskrzeli i mięśni gładkich,zwiększone wydzielanie śluzu, wydzielanie komórek nabłonka dróg oddechowych, stenozę dróg oddechowych i komórki zapalne rozrzucone w śródstopiu. Nie obserwowano istotnych zmian patologicznych w grupach z prawidłową grupą kontrolną. Reprezentatywne dane histopatologiczne przedstawiono na Fig.1.

ekspresja cząsteczek powierzchni Komórkowejdcs

poziomy ekspresji CD11c, CD80 i CD86 na ich powierzchniachdc wykryto za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją(FACS). MDC z grupy astmatycznej wyrażało CD11c na poziomie porównywalnym z tym w normalnej grupie kontrolnej; nie stwierdzono znaczącej różnicy między tymi dwiema grupami (P>0,05). Jednak w porównaniu z normalną grupą kontrolną, Grupa astmatyczna wykazywała znacznie wyższe poziomy ekspresji CD80 i CD86(p<0,05; Fig. 2).

transfekcja MDC

konstrukcje siRNA specyficzne dla CD80 i CD86 zostały pomyślnie przeniesione do MDC. Transfekowane MDC były obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym 6 godzin po transfekcji.Skuteczność transfekcji siRNA wykryta przez FACS wynosiła ~75% (Fig. 3).

ekspresja mRNA i białka CD80 i CD86 przez mDCs po transfekcji

poziomy ekspresji mRNA i białka CD80 i cd86 w transfekowanych mDCs wykryto odpowiednio w 24 i 72 h po transfekcji. Poziomy ekspresji mRNA CD80 i CD86 wykryte przez RT-qPCR wykazały, że poziomy ekspresji mRNA CD80 w grupach innych niż siRNA, siRNA i negativesiRNA wynosiły odpowiednio 2,09±0,46, 0,60±0,17 i 2,04±0,93, a poziomy ekspresji mRNA CD86 wynosiły odpowiednio 3,58±0,20, 0,91±0,48 i 2,83±0,83. Dane dostarczone przez FACS wykazały, że dodatnie wskaźniki ekspresji białka CD80 w grupach thenon-siRNA,siRNA i ujemnych siRNA wynosiły odpowiednio 82,45±15,80, 30,79±7,07 i 81,83±10,07%, a wskaźniki ekspresji białka CD86 wynosiły 89,45±10,22, 27,29±6,99 i 87,66±11.Odpowiednio 74%. Poziom ekspresji mRNA i szybkość ekspresji proteinpozytywnej wykazywały porównywalne wyniki. Nie stwierdzono istotnego znaczenia pomiędzy grupą niebędącą siRNA a grupą podlegającą działaniu siRNA (P>0,05). Ekspresja CD80 i CD86 na poziomie RNA i białka w grupie siRNA zmniejszyła się znacząco w porównaniu z grupą nie-siRNA i ujemną (P< 0,05; Fig. 4 i 5). Pokazuje to, że interferencja ukierunkowana na siRNA może znacząco tłumić poziomy mRNA i ekspresji CD80 i CD86.

wydzielanie IFN-γ i IL-4 przez komórki TCO-hodowane z mDCs

Po 72 godzinach współkultury, poziomy IFN-γ i IL-4 w supernatancie systemu współkultury mDC i limfocytów T zostały wykryte za pomocą testu ELISA. Ekspresja IFN-γ była istotnie zwiększona w grupie siRNA (132,73±25,04 pg/ml), w porównaniu z grupami thenon-siRNA i ujemnymi siRNA (odpowiednio 72,56±26,30 i 80,21±24,42 pg/ml; P<0,05), podczas gdy nie wykryto istotnych różnic pomiędzy grupami nie-siRNA i ujemnymi siRNA(p

0.05). Poziom ekspresji IL-4 był istotnie zmniejszony w grupie siRNA (93,04±23,13 pg/ml) w porównaniu z grupami bez sirna i ujemnymi (odpowiednio 150,69±29,50 i 163,19±25,36 pg/ml; P<0,05), podczas gdy nie wykryto istotnych różnic pomiędzy grupami bez siRNA i ujemnymi siRNA(P<0,05).> 0.05; rys. 6).

dyskusja

astma oskrzelowa jest przewlekłym zapalnym dróg oddechowychchoroba z udziałem różnych komórek zapalnych, w tym mastcells, eozynofilów, limfocytów i innych składników komórkowych (14-17).Zaburzenie równowagi Th1/Th2 jest kluczowym czynnikiem wpływającym na nasilenie astmy (18). APC, w tym DCs,makrofagi i komórki B (19), odgrywają kluczową rolę w stymulacji komórek T (3). Wśród nich DC jest najbardziej silnepc, przyczyniając się do pierwotnej i wtórnej odpowiedzi immunologicznej,w tym odporności alergicznej. Dojrzałe DCs (mDCs) z wysokim poziomem ekspresji cząsteczek Ko-stymulujących CD80 i CD86 mogą aktywować komórki T, podczas gdy niedojrzałe komórki dendrytyczne (iDCs) z niskim poziomem ekspresji CD80 i CD86 tłumią odpowiedź limfocytów T i indukują tolerancję immunologiczną (20,21). Wykazano, że pacjenci z DCsin z astmą są nadpobudliwi(22).

CD80 i CD86 są dwoma rodzajami białek, które są ekspresowane na powierzchni APC i które działają w tandemie, aby dostarczyć sygnały stymulujące niezbędne do aktywacji komórek T i przystawki. Wcześniejsze badania wykazały, że poziom ekspresji współstymulujących cząsteczek CD80 i CD86 na powierzchni mDC jest ściśle związany z reakcją komórek Th2 i zapaleniem dróg oddechowych (23,24). U pacjentów z astmą MDC, które wykazują dużą ekspresję CD80 i CD86, mogą stymulować naiwną aktywację limfocytów T pomocniczych CD4+w celu różnicowania się w kierunku komórek Th2, co prowadzi do nierównowagi Th1/Th2. Następnie niewystarczające wydzielanie cytokin Th1, takich jak IFN-γ, wraz ze zwiększonym wydzielaniem cytokin Th2, takich jak IL-4 i IL-5, powoduje zapalenie seozynofilowe i alergiczne zapalenie dróg oddechowych(10,24,25). Do promowania aktywacji komórek Th2 wymagane są dwa sygnały (26-28). Pierwszy sygnał to tworzenie kompleksów antigen-MHC na powierzchni mDC, które wiążą się specyficznie z kompleksem receptora limfocytów T-CD3 na powierzchniach limfocytów T, a drugi sygnał to ekspresja cząsteczki Ko-stymulującej i aktywacja funkcjonalna na powierzchniach mDC, które specyficznie wiążą toreceptory na naiwnych komórkach T; dwa sygnały tworzą drogę Ko-stymulatorową (29). Stwierdzono również, że istnieje trzeci sygnał (30), ponieważ niektóre cząsteczki komórkowe wytwarzane przez DCs, takie jak limfopoetyna zrębowa grasicy (TSLP), wpływają na kierunek różnicowania komórek Th. Jednak spośród wszystkich wyżej wymienionych sygnałów, droga Ko-stymulacyjna CD80/CD86-CD28 jest najbardziej klasyczna i ważna. Wcześniejsze badania wskazywały, że szlak współstymulacyjny CD80/CD86-CD28 może być skutecznymatrakcją w leczeniu astmy, wykazując, że blokowanie szlaku współstymulacyjnego CD80/CD86 przy pomocy przeciwciał monoklonalnych może hamować stan zapalny u myszy astmatycznych (25). Ponadto hamowanie szlaku stymulującego CD80/Cd86 przy użyciu antysensownych oligonukleotydów może powodować nadpobudliwość dróg oddechowych (31).

RNAi jest zjawiskiem wyciszania genów, w którym dwuniciowe RNA endogenne lub egzogenne wywołują degradację homologicznego mRNA i indukują utratę odpowiadających im fenotypów funkcjonalnych. Ponieważ technika ta została po raz pierwszy odkryta w 1998 r. przez Fire et al (32), technika ta została poddana dalszemu rozwojowi w celu osiągnięcia wysokiego stopnia specyficzności i skuteczności. Terapeutyczne zastosowanie technologii Rnaitechnologia jest tematem, który przyciąga wysoki poziom zainteresowania w podstawowych badaniach medycznych i klinicznych w ostatnich latach.Zdolność RNAi do hamowania zjadliwej ekspresji genów została szeroko wykorzystana w leczeniu różnych chorób (33-35).Ponadto, szereg badań donosiło, że RNAi może być stosowany inDCs do diagnozowania i leczenia astmy oskrzelowej (36-39).Darcan-Nicolaisen i wsp. (40)odkryli, że dwa główne objawy astmy alergicznej w mysim modelu astmy indukowanej astmą, którymi są zapalenie dróg oddechowych i nadpobudliwość, zostały znacząco złagodzone przez przetwornik sygnału i aktywator wyciszania transkrypcji 6 (STAT6) w komórkach oddechowych przy użyciu kropli do nosa siRNA.Moriwaki i wsp. (41)wykazali, że pośredniczący w siRNA supresor wyciszania genu cytokin sygnalizujących 3(SOCS3) może tłumić reaktywność dróg oddechowych i naciek eozynofilowy, który był indukowany przez stymulację alergenową u myszy astmatycznych. Zheng i wsp. (42) stwierdzili, że zastosowanie siRNA można hamować ekspresję genu kinazy białkowej tyrozynowej (TPK) w DCs myszy astmatycznych, tłumiąc funkcjonalną zdolność DCS jako komórek prezentujących antygen, hamując tym samym aktywację i różnicowanie komórek T. Jednakże brak jest badań dotyczących wpływu POŚREDNICZONEGO przez siRNA knockdown CD80 i CD86 w DCs na różnicowanie komórek T u myszy z astmą. W obecnym badaniu, mRNA CD80 i CD86 oraz ekspresja białka w mysich DCs pochodzących z bonemarrowa została skutecznie zmniejszona za pomocą siRNA ukierunkowanego na CD80 i cd86, co zweryfikowało skuteczność RNAi.

w niniejszym badaniu wykorzystano mysi model astmatyczny, który został ustalony zgodnie z wcześniej opisanymi metodami(43). Wyniki wskazują, że MDC uzyskane z grupy astmatycznej wykazywały zwiększone poziomy ekspresji CD80 i CD86, co oznacza, że zdolność CD80/Cd86 może być zwiększona u pacjentów z astmą. Po transfekcji mDCs z siRNA ukierunkowanymi na CD80 i CD86, poziom ekspresji themRNA i dodatnie wskaźniki ekspresji białka CD80 i CD86 uległy znacznemu zmniejszeniu, potwierdzając hamujący wpływ podejścia siRNA na współstymulatorowe cząsteczki CD80 i CD86 na poziomie transkrypcji i translacji. W supernatancie ze współkultury mDCs i limfocytów T RNAi wywołało wzrost ekspresji IFN-γ i zmniejszenie poziomu ofIL-4, co wskazuje, że zmniejszenie ekspresji cząsteczek stymulujących CD80 i CD86 w mDCs osłabiło szlak Ko-stymulujący D80 / CD86-CD28 u myszy astmatycznych. RNAi wpływał również na ekspresję cytokin Th1 / Th2, co wskazuje na zmianę teoretycznej nierównowagi Th1 / Th2 i w konsekwencji indukowano immunetolerancję. Wyniki te wskazują, że CD80 i Cd86 mogą być potencjalnymi celami stosowania RNAi w leczeniu astmy i stanowią nową drogę do terapii genowej astmy.

podziękowania

to badanie było wspierane przez otwarty projekt grants from the State Key Laboratory of Respiratory Disease (Guangzhou,Chiny) (grant no. 2007DA80154F1107).

	Cell. 140:777–783. 2010. Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Holgate ST: wrodzone i adaptacyjne immunerespondses w astmie. Nat Med. 18:673–683. 2012. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Larché m, Robinson DS i Kay AB: rola limfocytów T w patogenezie astmy. J Allergy ClinImmunol. 111:450–464. 2003. Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lambrecht BN and Hammad H: the role ofdendritic and epithelial cells as master regulators of allergicairway inflammation. Lancet. 376:835–843. 2010. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Holt PG and Upham JW: the role ofdendritic cells in asthma. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 4:39–44.2004. Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lim TS, Goh JK, Mortellaro a, Lim CT,Hämmerling GJ i Ricciardi-Castagnoli P: CD80 i Cd86diferencyjnie regulują mechaniczne interakcje komórek T z komórkami dendrytycznymi prezentującymi antygen i komórkami B. PLoS 1.7:. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Wong CK, Lun SW, Ko FW, Ip WK, Hui DS i Lam CW: Zwiększona ekspresja osocza i powierzchni komórek cząsteczek stymulujących CTLA-4, CD28 i CD86 u dorosłych pacjentów z astmą alergiczną. Clin Exp Immunol. 141:122–129. 2005.Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Shi HZ, Xie ZF, Deng JM, Chen YQ i XiaoCQ: rozpuszczalne białko CD86 w próbkach surowicy pacjentów z astmą.Klatka piersiowa. 59:870–875. 2004. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Van Rijt LS i Lambrecht BN: Komórki dendrytyczne w astmie: funkcja poza uczuleniem. Alergia Na Clin Exp.35:1125–34. 2005. Zobacz artykuł : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Van Rijt LS, vos N, Willart M, Kleinjan a,Coyle AJ, Hoogsteden HC i Lambrecht BN: zasadnicza rola kostymulacji komórek CD80/CD86 w indukcji, ale niereaktywacji, efektorowe odpowiedzi Th2 w mysim modelu astmy.J Allergy Clin Immunol. 114:166–173. 2004. Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wu SG, Wang GL, Li LY i Ji J: wpływ mikroRNA-21 na przetwornik sygnału interleukiny 12 / i aktywator szlaku sygnałowego transkrypcji 4 u myszy astmatycznych. Cent EUR JImmunol. 39:40–45. 2014. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	gu X, Xiang J, Yao Y i Chen Z: wpływ interferencji RNA na ekspresję CD80 i CD86 w mysich komórkach dendrytycznych pochodzących z bonemarrowa. Scand J Immunol. 64:588–594.2006. Zobacz artykuł : Google Scholar: PubMed/NCBI
	Livak KJ and Schmittgen TD: Analysis ofrelative gene expression data using real-time quantitative PCR andthe 2−∆∆ct method. Metody. 25:402–408. 2001. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	N Engl J Med.360:1002–1014. 2009. Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lambrecht BN i Hammad H: dendrytyczne komórki płuc w infekcji wirusowej układu oddechowego i astmy: od ochrony do immunopatologii. Annu Rev Immunol. 30:243–270. 2012. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Wenzel SE: astma fenotypy: Theevolution from clinical to molecular approaches. Nat Med.18:716–725. 2012. Zobaczartykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hansel TT, Johnston SL i Openshaw PJ:mikroby i śluzówkowe odpowiedzi immunologiczne w astmie. Lancet.381:861–873. 2013. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Compalati e, Braido F i Canonica GW: Anupdate on allergen immunotherapy and asthma. Curr Opin Pulm Med.20:109–117. 2014. Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Goyvaerts C, Dingemans J, De Groeve K,Heirman C, Van Gulck E, Vanham G, de Baetselier P, Thielemans K,Raes G i Breckpot K: celowanie w komórki prezentujące ludzki antygen. J Virol. 87:11304–11308. 2013. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Reise Sousa C: komórki dendrytyczne w okresie dojrzewania. Nat Rev Immunol. 6:476–483. 2006. Zobaczartykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Gill MA: rola komórek dendrytycznych w organizmie człowieka. J Allergy Clin Immunol. 129:889–901. 2012. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Shi JH, LI YG and LI TS: the role ofdendritic cells in antigen presentation and the pathogenesis ofasthma. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 28:22–27. 2005.(Inchiński). PubMed/NCBI
	Wong CK, Lun SW, Ko FW, Ip WK, Hui DS andLam CW: zwiększona ekspresja plazmy i powierzchni komórek cząsteczek stymulujących CTLA-4, CD28 i CD86 u dorosłych pacjentów z astmą alergiczną. Clin Exp Immunol. 141:122–129. 2005.Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Bellou a i Finn PW: Costimulation:Critical pathways in the immunologic regulation of astma. CurrAllergy Asthma Rep. 5: 149-154. 2005. Zobacz Artykuł : Google Scholar: PubMed/NCBI
	Chen YQ i Shi Hz: CD28/CTLA-4-CD80/CD86and ICOS-B7RP-1 Szlak kostymulacyjny w astmie oskrzelowej. Alergia.61:15–26. 2006. Zobacz artykuł: Google Scholar:PubMed/NCBI
	Bieber T, Novak N, Herrmann N I Koch S: rola komórek dendrytycznych w atopowym zapaleniu skóry: aktualizacja. Clin RevAllergy Immunol. 41:254–258. 2011. Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hespel C i Moser m: rola komórek zapalnych w odporności wrodzonej i adaptacyjnej. Eur J Immunol.42:2535–2543. 2012. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Novak N: an update on the role of humandendritic cells in patients with atopic dermatitis. J Allergy ClinImmunol. 129:879–886. 2012. Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lombardi V, Singh AK i Akbari o: Therole of costimulatory molecules in allergic disease and asthma. IntArch Allergy Immunol. 151:179–189. 2010. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Zhang Y, Zhou X i Zhou B: DC-derivedTSLP Promuje polaryzację Th2 w LPS-primed alergiczne zapalenie dróg oddechowych. Eur J Immunol. 42:1735–1743. 2012. Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Crosby JR, Guha M, Tung D, Miller DA,Bender B, Condon TP, York-DeFalco C, Geary RS, Monia BP, Karras Jgand Gregory SA: Inhalated CD86 antisense oligonucleotide suppressepulmonary inflammation and airway hyper-reaktywność w ALLERGICMICE. J Pharmacol Exp Ther. 321:938–946. 2007. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA,Driver SE i Mello CC: Silna i specyficzna interferencja genetyczna dwuniciowego RNA w Caenorhabditis elegans. Natura.391:806–811. 1998. ViewArticle : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Ghafouri-Fard S: siRNA and cancerimmunotherapy. Immunoterapia. 4:907–917. 2012. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Gavrilov K i Saltzman WM: TherapeuticsiRNA: Principles, challenges and strategies. Yale J Biol Med.85:187–200. 2012.PubMed/NCBI
	Yan WJ, Xu SJ, Xie MM i Wu Bl: wpływ egzogennego cyklicznego dimerycznego guanozynemonofosforanu na ekspresję genów Streptococcus mutans. Zhongguo Zu Zhi GongCheng Yan Jiu. 16:1451–1454. 2012.(Po Chińsku).
	Lee CC, Huang HY i Chiang BL:lentiviral-mediated interleukin-4 i interleukin-13 rnainterferencja zmniejsza zapalenie dróg oddechowych i nadczynność.Hum Gene Ther. 22:577–686. 2011. Zobacz Artykuł : Google Scholar: PubMed/NCBI
	Li Y, Sun m, Cheng H, Li s, Liu L, Qiao H,Hua S I Lu J: Wyciszanie ekspresji IL-23 za pomocą małej szpilki do włosów Rnprotects against astma u myszy. Exp Mol Med. 43:197–204. 2011.Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Woska JJ i Gillespie ME:identyfikacja i regulacja kompleksu SNARE pośredniczącego w degranulacji komórek tucznych RBL-2H3.Scand J Immunol. 73:8–17. 2011. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Lu XX, McCoy KS, Xu JL, Hu WK i Chen HB:Małe interferujące RNA skierowane na komórki T IG Mucin-3 zmniejszają alergiczne zapalenie dróg oddechowych i nadczynność. Zapalenie.36:582–591. 2013. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Darcan-Nicolaisen Y, Meinicke H, Fels G,Hegend O, Habland a, Kühl a, Loddenkemper C, Witzenrath M, KubeS, Henke w I Hamelmann E: Mały interferujący RNA przeciwko czynnikowi opisowemu STAT6 hamuje alergiczne zapalenie dróg oddechowych i nadczynność u myszy. J Immunol. 182:7501–7508. 2009.Zobacz artykuł : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Moriwaki a, Inoue H, Nakano T, MatsunagaY, Matsuno Y, Matsumoto T, Fukuyama s, kan-O K, Matsumoto K,Tsuda-Eguchi m, et al: T cell treatment with small zakłócający Rnafor tłumiący sygnalizację cytokin 3 moduluje reakcje alergiczne dróg oddechowych w mysim modelu astmy. Am J Respir Cell Mol Biol.44:448–455. 2011. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Zheng YH, Lu JJ, Guo ZL, Ren T i LiangYJ: Małe interferujące RNA specyficzne dla kinazy tyrozynowej śledziony dojrzewanie komórek dendrytycznych myszy astmatycznych in vitro.Zhongguo Hu Xi Yu Wei Zhong Jian Hu Za Zhi. 8:487–491. 2009.(Inchiński).
	Li JG, Zhuansun YX, Ran px, Zhang w, MoXN, Wu H I Li YQ: Wpływ mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego na limfocyty T regulatorowe CD4 + CD25 + i zapalenie dróg oddechowych u myszy z astmą. Zhongguo Zu Zhi Gong Cheng Yan Jiu.12:9302–9305. 2008.(Po Chińsku).