4.3 BBB-crossing bsAbs engineered with single-domain niweczniki
sdAbs to małe (15 kDa), monomeryczne fragmenty przeciwciał wiążące antygen, które zapewniają różne korzyści w porównaniu z innymi fragmentami przeciwciał jako „budulec” bsab. Występują one w przyrodzie jako część wiążąca antygen ciężkich przeciwciał łańcuchowych u gatunków wielbłądów (zwanych VHH) i ryb chrzęstnych (zwanych VNAR) lub mogą być generowane z konwencjonalnych IgG przez uzyskanie lub inżynierię monomerycznych, stabilnych domen VH lub VL (Hamers-Casterman i in., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdAbs są bardzo stabilne i kompaktowe i mogą uzyskać dostęp do wgłębień epitopów w białkach, takich jak wnęki receptorów lub miejsca aktywne enzymów, które często są „ukryte” przed konwencjonalnymi IgG i mogą osiągnąć docelowe powinowactwo wiązania porównywalne z konwencjonalnymi przeciwciałami (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Te monomeryczne jednostki wiążące antygen nie łączą się z łańcuchami lekkimi, co czyni je doskonałymi budulcami dla heterodimeryzowanych bsab, ponieważ unikają trudności z niewłaściwym parowaniem łańcucha lekkiego (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimeryczne bsab mogą być tworzone z jednym lub dwoma „ramionami” będącymi sdAb, przy czym te ostatnie są podobne w strukturze do wielbłądowych przeciwciał o ciężkim łańcuchu (Fig. 3E). sdAbs można również stosować w różnych fuzjach mono -, bi-lub tetrawalentnych z konwencjonalnymi przeciwciałami terapeutycznymi lub Fabs (Fig. 3E), co zazwyczaj skutkuje mniejszymi, mniej złożonymi cząsteczkami, w porównaniu do tych generowanych za pomocą scfv lub Fab jako bloków konstrukcyjnych, które wydają się być dobrze wychowane biofizycznie i łatwe do wytworzenia (Holliger & Hudson, 2005). Humanizacja VHHs, jak również Inżynieria sdAbs jest dobrze opisana, pozwalając na łatwe generowanie ludzkich (ized) sdAbs o optymalnym powinowactwie docelowym i wyjątkowych właściwościach biofizycznych (Vincke et al., 2009).
w celu oceny potencjalnego zastosowania camelid VHH FC5 jako nośnika BBB w obrębie bispecyficznych przeciwciał ukierunkowanych na OUN zaprojektowano i oceniono monowalentne i dwuwartościowe Fuzje (N-I C – terminus) FC5 z ludzkim Fc in vitro i In vivo (Farrington i wsp., 2014). Pozorne powinowactwo wiązania (kdapp) do szczura BEC fuzji dwuwartościowej fc5fc wynosiło 75 nM, podczas gdy Wiązanie monowalentne fc5fc mieściło się w zakresie mikromolarnym. Analizy pozornych współczynników przenikania (Papp) w modelu BBB in vitro, pozornej ekspozycji na ośrodkowy układ nerwowy uzyskanej z surowicy/CSF farmakokinetyki układowo podawanych konstruktów przeciwciał oraz odpowiedzi farmakologicznych wywoływanych przez chemicznie sprzężone nieprzepuszczalne peptydy neuroaktywne BBB w modelu bólu Hargreavesa, dostarczyły dowodów na zwiększony transport BBB tych dużych (75 kDa) cząsteczek przeciwciał pośredniczonych przez FC5: (1) wartości Papp in vitro wynosiły ~ 200 cm/min zarówno dla mono -, jak i biwalentnych N – końcowych cząsteczek fuzyjnych Fc (FC5Fc) w porównaniu do 4-8 cm/min dla sterowania VHH A20.Fuzje 1fc lub EG2Fc; (2) pozorna ekspozycja na fuzję FC5FC w ośrodkowym układzie nerwowym była 30-krotnie wyższa w porównaniu z fuzjami Fc przeciwciała z domeny kontrolnej; (3) ogólnoustrojowa farmakologiczna siła działania koniugatów fc5fc z neuropeptydami dalargin lub galaniny w modelu bólu zapalnego Hargreavesa była do 60–krotnie wyższa w porównaniu z monomerycznymi koniugatami neuropeptydu FC5. Wynik ten przypisywano długiemu okresowi półtrwania (~ 96 h) fc5fc-w porównaniu do koniugatów neuropeptydu FC5; (4) różne kontrolne koniugaty neuropeptydu VHH-Fc nie wykazały skuteczności ogólnoustrojowej; (5) połączenie FC5 z C-terminusem Fc spowodowało atenuowaną zdolność przekraczania BBB. W przeciwieństwie do przeciwciał BBB-nośnikowych ukierunkowanych na TfR, zarówno jedno -, jak i dwuwartościowe białka fuzyjne FC5Fc wykazywały podobną szybkość transcytozy in vitro, podobny profil farmakokinetyczny osocza/płynu mózgowo-rdzeniowego i podobną moc ogólnoustrojową w modelu farmakodynamicznym in vivo, pomimo różnic w pozornym powinowactwie wiązania i wartościowości (Farrington i wsp ., 2014). Badania te wykazały, że krzyżujące się z BBB przeciwciało jednodomenowe FC5 może być stosowane jako nośnik platformy BBB zarówno w heterodimeryzowanych „pół-przeciwciałach”, jak i jako łatwiej skalowalna fuzja bi – lub tetrawalentna z konwencjonalnymi IgGs (Farrington et al., 2014).
kolejną potencjalną zaletą vhhs jako nośników BBB jest ich naturalna odporność na ekstremalne wyzwania biofizyczne, takie jak temperatura i pH, a także na degradację proteazy (Kim et al., 2014), często spotykany w różnych przedziałach endocytozy podczas transcytozy. Fuzje FC5 i fc5fc są internalizowane do BEC przez pęcherzyki pokryte klatryną i są sortowane do wczesnych endosomów. Co ciekawe, stwierdzono również, że FC5 stymuluje wydzielanie zewnątrzkomórkowych mikrowążów (exosomów)z BEC (Haqqani, Caram-Salas i in., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013), w którym zarówno FC5, jak i podwyższony poziom jego domniemanego receptora Cdc50A zostały wykryte przez Western blot i celowaną spektrometrię masową. Badanie to sugerowało, że exosomy shed mogą być końcowym pęcherzykiem szlaku RMT uwalnianym z powierzchni abluminalnej niosącej kompleks receptor-przeciwciało (schematycznie pokazano na Fig. 4). Szlak RMT i powstawanie egzosomów mają pewne zauważalne podobieństwa. Jak przedstawiono w pierwszym odkryciu exosomów, przeciwciało anty-TfR było śledzone przez mikroskopię elektronową w retikulocytach (Théry, 2011)z powierzchni komórek, do dołów pokrytych klatryną, wewnątrz wczesnych endosomów, na powierzchni wewnętrznych pęcherzyków endosomów wielonarządowych i wreszcie na uwolnionych egzosomach po fuzji endosomów wielonarządowych z błoną plazmatyczną (Fig. 4). Wydaje się, że RMT rozwija się w podobny sposób i wykazano, że zewnątrzkomórkowe mikropęcherzyki BEC zawierają kilka receptorów, o których wiadomo, że przenoszą makrocząsteczki przez BBB przez RMT, w tym TfR, LRPs, LDLR i IR (Haqqani, Delaney i in., 2013).
z opisanych badań wynika, że ramię nośnika BBB bsAb ukierunkowanego na OUN wymaga starannej optymalizacji dla każdego receptora RMT. Ważne kwestie związane z projektowaniem bsab ukierunkowanych na OUN omówiono poniżej, biorąc pod uwagę „wnioski wyciągnięte” z rozwoju Bsab TfR-BACE1 i z naszej własnej pracy z FC5 jako przeciwciałem nośnym BBB.