9 rola białek w Spliceosomalnym rdzeniu katalitycznym
porównanie wielkości snRNA ze znacznie większymi intronami grupy II podnosi możliwość, że kilka domen intronowych grupy II mogło zostać zastąpionych białkami w spliceosomach podczas ewolucji, dając początek nowoczesnym eukariotycznym maszynom do splicingu rybonukleoprotein (RNP). Chociaż nie istnieje jeszcze korespondencja jeden do jednego, łatwo jest zidentyfikować białka spliceosomalne, które pełnią funkcję pośredniczoną przez elementy RNA w intronach grupy II. Na przykład, wiele białek związanych z U2 działa w inicjowaniu i stabilizowaniu interakcji snRNA z miejscem rozgałęzienia U2 (Fig. 6.3).5,85 w intronach grupy II odpowiednik U2 (część domeny VI)jest kowalencyjnie połączony z miejscem rozgałęzienia za pomocą hiperstabilnej pętli spinki do włosów w układzie zapewniającym tworzenie i stabilność ich interakcji (Fig. 6.2). Z tej ewolucyjnej perspektywy nie jest zaskakujące, że duża część białek spliceosomalnych bezpośrednio wiąże się z snRNA, często wspomagając go w jego funkcji.5,85 jednak wiele białek spliceosomalnych bierze udział w wykonywaniu funkcji regulacyjnych, które nie są wymagane w kontekście samo-splicingującego intronu i prawdopodobnie będą nowszymi dodatkami do dopełniacza białek spliceosomalnych.
jak wspomniano powyżej, uważa się, że ostatni wspólny przodek eukariotów miał wysoko rozwinięty, w pełni funkcjonalny spliceosom, który przypominał te występujące u współczesnych eukariotów.1,2 chociaż ten spliceosom prawdopodobnie zawierał znacznie mniej składników w porównaniu do nawet najmniejszych współczesnych spliceosomów, dane wskazują, że większość kluczowych składników była obecna w najwcześniejszych wersjach spliceosomów.1-4 rzeczywiście, podzbiór proteomu spliceosomalnego, który zawiera białka związane z rdzeniem katalitycznym, wykazuje znaczny poziom ochrony wśród różnych gatunków eukariotycznych, przy czym wiele białek spliceosomalnych należy do najbardziej konserwowanych białek komórkowych.85,86
jak wspomniano powyżej, wiele dobrze scharakteryzowanych rybozymów jest związanych z białkami in vivo, które poprawiają swoją aktywność katalityczną za pomocą kilku znanych mechanizmów.Obejmują one stabilizację struktury funkcjonalnej RNA, pomoc w wiązaniu i pozycjonowaniu substratów oraz pomoc w wiązaniu ważnych funkcjonalnie jonów metali. Jednak jak dotąd nie zaobserwowano bezpośredniego udziału w katalizie żadnego z badanych białek związanych z rybozymem.83,87 jeśli przyjąć, że spliceosom jest enzymem RNA, spliceosomalne snRNA są pod wieloma względami nietypowymi rybozymami. Być może, co najważniejsze, są one niezwykle małe jak na rybozym katalizujący rozszczepienie wiązania fosfodiestrowego poprzez aktywację nukleofila bez osadu. Inne naturalne rybozymy katalizujące takie reakcje, a mianowicie introny grupy i I II oraz Rnaza P, są co najmniej dwukrotnie dłuższe niż łączna długość ludzkich snRNA U6 i U2. Rybozymy te są również znacznie większe niż rybozymy nukleolityczne, które aktywują sąsiedni 2 ’ – hydroksylowy nukleofil do rozszczepiania wiązań fosfodiestrowych.24,88,89 uważa się, że większy rozmiar umożliwia tym rybozymom składanie się w złożone struktury stabilizowane przez wiele trzeciorzędowych oddziaływań, co z kolei umożliwia im tworzenie wyrafinowanych miejsc aktywnych zdolnych do dokładnego pozycjonowania miejsca rozszczepiania, miejsca aktywnego jonów metali i odległego nukleofilu do ataku nukleofilowego w linii. Można sobie wyobrazić, że snRNA U6 i U2, ze względu na ich krótką długość, w najlepszym przypadku tworzą nieefektywny rybozym splicingowy, który wymaga innych czynników spliceosomalnych do stabilnego pozycjonowania aktywnych elementów miejsca i reagujących grup.
prp8, które jest najbardziej zachowanym białkiem spliceosomalnym, uważa się, że odgrywa taką rolę w miejscu aktywnym spliceosomalnym. Prp8 jest prawdopodobnie najciekawszym z białek spliceosomalnych, ponieważ jest niezwykle konserwowany z 61% tożsamością między drożdżami a ludźmi.86 ma jednak niewiele wyraźnie odróżnialnych motywów funkcjonalnych w długości aminokwasu ~ 2300, a domeny funkcjonalne, które zostały dotychczas rozpoznane, są zdegenerowane i prawdopodobnie pełnią funkcje niezwiązane z komórkową rolą pierwotnego motywu założycielskiego.Z drugiej strony Prp8 wyraźnie odgrywa bardzo kluczową rolę w miejscu aktywnym spliceosomalnie. Został usieciowany do miejsc splotu 5′ I 3′ oraz do miejsca rozgałęzienia RNA premessengera, oprócz snRNA U5 i U6, co wskazuje, że jest obecny w spliceosomalnym rdzeniu katalitycznym i bezpośrednio kontaktuje się z krytycznymi graczami w reakcji splicingu.86,90 ponadto wykazano, że Prp8 oddziałuje z kilkoma kluczowymi białkami spliceosomalnymi, w tym Snu114 i Brr2 (patrz poniżej).86,91,92
mutacje w Prp8 są związane z szerokim spektrum wad spliceosomalnych, w tym ze zmianami w zdolności spliceosomów do odrzucania nieoptymalnych miejsc splicingu i supresją wad spowodowanych mutacjami w innych czynnikach spliceosomalnych, takich jak snRNA Prp28, Brr2, U4 i U6.86,93,94 podzbiór mutantów Prp8 selektywnie moduluje wydajność pierwszego lub drugiego etapu splicingu, zwłaszcza w substratach nieoptymalnych.58,86,95-97 obserwacje te najlepiej wyjaśnić hipotezą stwierdzającą, że Prp8 jest zaangażowany w stabilizację alternatywnych, wzajemnie wykluczających się konformacji miejsc aktywnych, które są gotowe do katalizy pierwszego lub drugiego etapu splicingu, oraz że niektóre mutanty Prp8 mogą prowadzić do selektywnej hiperstabilności jednego z tych stanów.58,96,98 chociaż znaczące dowody sugerują, że Prp8 jest prawdopodobnie zaangażowany w pozycjonowanie substratów i stabilizację miejsca aktywnego, obecnie nie istnieją żadne bezpośrednie dowody, które sugerują lub odrzucają jego dodatkowy udział w koordynacji jonów metali lub bezpośredni udział w katalizie spliceosomalnej.
ta niepewność wynika z faktu, że bardzo niewiele wiadomo o sposobie, w jaki Prp8 pełni swoją funkcję. Innowacyjny test przesiewowy z udziałem transpozonów wykazał, że duże regiony Prp8 są bardzo wrażliwe na wstawianie transpozonów i prawdopodobnie działają jako pojedyncza jednostka strukturalna, chociaż możliwe było wstawianie transpozonów lub nawet dzielenie Prp8 na dwa fragmenty w wielu innych pozycjach bez utraty żywotności.90,92 oprócz zdegenerowanego sygnału lokalizacji jądrowej w pobliżu jego końca N i zdegenerowanego motywu RRM (RNA recognition motif) w środku białka, tylko dwie inne domeny funkcjonalne zostały zidentyfikowane w tym około 2300 aminokwasowym białku.
zdegenerowany wariant domeny MPN/Jab1, który jest związany z enzymami deubikwitynującymi, znajduje się w pobliżu końca C Prp8.Analiza struktury o wysokiej rozdzielczości fragmentu Prp8 zawierającego tę domenę wykazała, że miejsce wiązania jonów metali w centrum izopeptydazy jest zaburzone, a zatem prawdopodobnie nie działa jako enzym deubikwitynujący.99 100 in vitro fragment Prp8 zawierający tę domenę mógł bezpośrednio wiązać się z ubikwityną z powinowactwem porównywalnym z innymi znanymi białkami wiążącymi ubikwitynę.Kilka znanych mutacji Prp8, które zakłócały splicing, również zakłóciło Wiązanie ubikwityny in vitro, zwiększając w ten sposób możliwość funkcjonalnej roli ubikwitynacji w regulacji splicingu. Co ważne, analizy proteomiczne wykazały, że kilka czynników spliceosomalnych, w tym Sad1, Snu114, rse1 i Prp8, jest ubikwitynowanych in vivo, a ponadto spliceosomalne białko rdzeniowe Prp19 wykazuje aktywność ligazy ubikwityny E3 in vitro.101-105 ponadto ubikwityna odgrywa rolę w tworzeniu i utrzymaniu tri-snRNP, prawdopodobnie poprzez modulowanie regulowanej przez Prp8 funkcji Brr2.102 alternatywnie, możliwe jest również, że domena MPN/Jab1 funkcjonuje jako platforma interakcji białko–białko. Szereg mutacji w Prp8, które wchodzą w zakres tej domeny, prowadzi do dziedzicznej ślepoty retinitis pigmentosa, 86 i te mutacje osłabiają interakcję Prp8 z Brr2 i Snu114.
określono strukturę innego fragmentu Prp8 o wysokiej rozdzielczości, która obejmuje wysoce zachowany region (69% identyczności aminokwasowej między drożdżami a człowiekiem) znajdujący się w pobliżu jego domeny C-końcowej. Analiza struktury wykazała obecność β-spinki do włosów przypominającej te znajdujące się w białkach rybosomalnych i zdegenerowanej domeny podobnej do RNazy H.106-108 podczas gdy ogólna geometria motywu podobnego do RNazy H na poziomie struktury drugorzędowej i trzeciorzędowej była dobrze zachowana, Sekwencja pierwotna wykazała znacznie niższy poziom ochrony i tylko jedna z trzech pozostałości katalitycznych jest obecna w miejscu aktywnym. Zachowywana pozostałość, asparaginian, bierze udział w koordynowaniu dwóch katalitycznych jonów metali w miejscu aktywnym kanonicznych domen RNazy H. W jednym z badań mutacja tej pozostałości w Prp8 u drożdży nie spowodowała wykrywalnego defektu wzrostu, który mógłby wskazywać na redundancję lub brak funkcji krytycznej.W innym badaniu nie można było zbadać jego wpływu, ponieważ mutacja wywołała nieprawidłowe fałdowanie fragmentu białka.107 nie zaobserwowano wiązania jonów metali w regionie odpowiadającym miejscu aktywnemu domeny H RNazy, gdy kryształy były hodowane w nawet 200 mM MgCl2, co wskazuje, że zdegenerowane miejsce aktywne nie ma zdolności wiązania jonów metali. Ponadto fragment Prp8 zawierający tę domenę wykazywał bardzo słabą zdolność wiązania RNA, z Kd od 20 µM do ponad 200 µM w zależności od badanych gatunków RNA.106-108 chociaż fragment wykazywał bardzo niskie powinowactwo do wiązania RNA, wykazywał Preferencje do wiązania dupleks RNA zawierających połączenia czterodrożne.108 w aktywowanych ludzkich spliceosomach przewiduje się, że snRNA U2 i U6 tworzą taką strukturę.53,69 to, co sprawiło, że ta domena podobna do RNazy H była szczególnie interesująca, to fakt, że aminokwasy odpowiadające jej miejscu aktywnemu znajdują się w sąsiedztwie reszt w Prp8, które wcześniej wykazywały sieciowanie do miejsca splicingu 5′ w spliceosomach prekatalitycznych.Jednakże skuteczność tworzenia tego sieciowania zmniejszała się, gdy prekatalityczne spliceosomy rozwijały się w katalitycznie aktywne kompleksy spliceosomalne.Obserwowany spadek skuteczności sieciowania można interpretować w taki sposób, aby wskazywać, że interakcja ta jest zaburzona w aktywowanych spliceosomach. Alternatywnie, interakcja może się utrzymywać, ale samo tworzenie sieciowania zostaje zniesione z powodu niewielkiej zmiany w środowisku sieciowanych pozostałości. Jeśli ta zdegenerowana domena H-podobna do RNazy jest rzeczywiście umieszczona w pobliżu miejsca splicingu 5 ’ w katalitycznie aktywnych spliceosomach, możliwe jest, że może ona uczestniczyć w stabilizowaniu aktywnej konformacji snRNA, pozycjonowaniu substratów w miejscu aktywnym i/lub koordynowaniu katalitycznych jonów metali. Podczas gdy domena sama w sobie nie może wiązać RNA ani jonów metali, możliwe jest, że w obecności innych aktywnych elementów miejsca może stanowić część substratu lub kieszonek wiążących jony metali. Pomimo tych intrygujących możliwości, rola Prp8 w katalizie spliceosomalnej pozostaje niepewna.