- Streszczenie
- 1. Wprowadzenie
- 2. Materiały i metody
- 2.1. Zwierzęta
- 2.2. Hodowle komórek
- 2.3. Test barwienia immunofluorescencyjnego
- 2.4. Western Blot
- 2.5. Ilościowa (w czasie rzeczywistym) Reakcja łańcuchowa polimerazy (w czasie rzeczywistym PCR)
- 2.6. Analiza statystyczna
- 3. Wyniki
- 3.1. Dystrybucja astrocytów znakowanych przez NDRG2, GFAP i S100ß w różnych regionach mózgu
- 3.2. Morfologie astrocytów oznaczonych przez NDRG2, GFAP i S100ß w różnych regionach mózgu
- 3.3. Kolokalizacja NDRG2, GFAP i S100ß w Astrocytach w różnych regionach mózgu
- 3.4. Ekspresja białek Ndrg2, GFAP i S100ß w różnych regionach mózgu
- 4. Dyskusja
- dostępność danych
- ujawnienie
- konflikty interesów
- wkład autorów
- podziękowania
- Materiały uzupełniające
Streszczenie
astrocyty mają różne cechy morfologiczne w zależności od regionu mózgu, w którym się znajdują. Jednak żaden z obecnych markerów astrocytowych nie może pomyślnie oznaczyć wszystkich subpopulacji. Tak więc określenie odpowiedniego markera dla konkretnego badania naukowego ma kluczowe znaczenie. Tutaj porównaliśmy rozkład i ekspresję białek trzech markerów astrocytów: NDRG2, GFAP i S100ß, w korze mózgowej, hipokampie i wzgórzu. Ndrg2-i s100ß-dodatnie astrocyty były rozmieszczone bardziej równomiernie niż GFAP-dodatnie astrocyty w całym móżdżku. Aktywność immunologiczna NDRG2 i S100ß była najsilniejsza w korze grzbietowej i wzgórzu, podczas gdy aktywność immunologiczna GFAP była najsilniejsza w hipokampie. Ponadto, poziom ekspresji białka NDRG2, GFAP i S100ß u dorosłych myszy był najwyższy odpowiednio w korze mózgowej, hipokampie i wzgórzu. Wykryliśmy również morfologię astrocytów i odkryliśmy, że w ciele modzelowatym i szypułce mózgowej stwierdzono astrocyty dodatnie GFAP z liczniejszymi i dłuższymi procesami niż astrocyty dodatnie NDRG2 i s100ß. Wyniki te pokazują, że NDRG2 i S100ß są bardziej odpowiednio wykorzystywane do wizualizacji ogólnego rozkładu i zmian liczby astrocytów, a także astrocytów znakowanych w korze mózgowej i wzgórzach. GFAP jest jednak bardziej odpowiednio stosowany do oznaczania astrocytów w ciele modzelowatym, szypułce mózgowej i hipokampie. Wyniki te pomagają naukowcom w wyborze odpowiedniego markera astrocytów i sugerują różnice w właściwościach immunologicznych astrocytów w oparciu o tkankę, w której się znajdują.
1. Wprowadzenie
astrocyty od dawna uważane są za komórki pomocnicze, które zapewniają neuronom jedynie troficzne, metaboliczne i strukturalne wsparcie . Jednak w ostatnich latach szeroko zakrojone badania wykazały, że odgrywają one kluczową rolę w mózgowych funkcjach fizjologicznych i patologicznych. Astrocyty pomagają w utrzymaniu homeostazy jonowej i barier krew-mózg, tworzeniu i usuwaniu synaps, a także kontrolowaniu przepływu krwi w mózgu i regulacji recyklingu neuroprzekaźników, ekscytotoksyczności glutaminianu i stresu przeciwutleniającego . Co ważne, astrocyty posiadają zróżnicowanie morfologiczne, populacyjne i funkcjonalne w różnych regionach mózgu . Dlatego określenie najbardziej odpowiedniego markera dla polimorficznych i wielokrotnych podgrup astrocytów ma kluczowe znaczenie dla badań nad astrocytami wielofunkcyjnymi.
glejowe włókniste białko kwaśne (GFAP) jest najczęściej stosowanym markerem astrocytowym, ale jako główny włókno pośrednie składające się na cytoszkielet, GFAP immunolabelował tylko około 15% całkowitej objętości astrocytów , a ponad 40% astrocytów okazało się ujemne w hipokampie dorosłego szczura . Dodatkowo, GFAP słabo znakował protoplazmatyczne astrocyty ludzkie i wykazywał późną ekspresję w rozwoju astrocytów włóknistych .
innym powszechnie stosowanym markerem astrocytowym jest s100ß, peptyd wiążący Ca2+ bogaty w cytoplazmę i jądro astrocytów, który bierze udział w regulacji cyklu komórkowego i modyfikacji cytoszkieletu . Jednak S100ß jest również wyrażany w subpopulacji dojrzałych oligodendrocytów, w komórkach nabłonka splotu naczyniówkowego i w kilku neuronach. Braki GFAP i S100ß w znakowaniu astrocytów mogą prowadzić do nieścisłości, a nawet błędów w badaniu funkcji astrocytów.
Gen N-Myc2 (ndrg2) został po raz pierwszy odkryty w normalnej ludzkiej mózgowej bibliotece cDNA za pomocą metody subtraktywnej hybrydyzacji opartej na PCR . Jest to supresor nowotworu i gen związany ze stresem komórkowym związany z proliferacją i różnicowaniem komórek . NDRG2 jest szeroko wyrażany w korze mózgowej, żarówce węchowej, śródmózgowym, hipokampie i wzgórzu . Co najważniejsze, NDRG2 jest wyraźnie wyrażany w astrocytach mózgu . W związku z tym NDRG2 jest uważany za nowy marker astrocytowy, szczególnie dla dojrzałych, niereaktywnych i nieproliferacyjnych astrocytów . Nie opisano jednak, czy NDRG2 jest bardziej wiarygodny niż GFAP i s100ß jako marker astrocytowy, jak również różnic w ich dystrybucji i ekspresji w różnych regionach mózgu.
w obecnym badaniu porównaliśmy dystrybucję, ekspresję białka i wzajemną kolokalizację markerów astrocytowych NDRG2, GFAP i S100ß w całym móżdżku myszy. Naszym celem było zidentyfikowanie najodpowiedniejszego markera dla astrocytów w różnych regionach mózgu.
2. Materiały i metody
2.1. Zwierzęta
Młode, dorosłe i stare myszy C57BL / 6 w wieku 1 miesiąca, 3 miesięcy, 6 miesięcy, 9 miesięcy i 12 miesięcy uzyskano z Centrum zwierząt doświadczalnych Central South University. Zwierzęta mogły swobodnie jeść i pić, były trzymane w temperaturze 25 ± 1°C i trzymane w jasnym i ciemnym okręgu o godzinie 12:12, aby symulować rytm dobowy zwierzęcia. Dołożyliśmy wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt. Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach były zgodne z protokołem zatwierdzonym przez Komitet etyczny ds. eksperymentów na zwierzętach Komitetu Opieki i użytkowania zwierząt Central South University w Chinach.
2.2. Hodowle komórek
komórki HT22 (linia komórkowa neuronów) i komórki MA1800-57 (linia komórkowa astrocytów) hodowano w zmodyfikowanym ośrodku Eagle ’ a Dulbecco (Dmem, HyClone) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, Gibco), 50 U/mL penicyliny i 50 µg/mL streptomycyny. Komórki OLN – 93 (linia komórek oligodendroglialnych) trzymano w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 2 mM glutaminą, 50 U/mL penicyliny i 50 µg/mL streptomycyny. Wszystkie komórki utrzymywano w temperaturze 37°C w mieszaninie 95% powietrza atmosferycznego i 5% CO2. Komórki HT22, komórki OLN – 93 i komórki MA1800 – 57 zaszczepiono na szkiełkach i zabarwiono przeciwciałami odpowiednio przeciwko białku 2 związanym z mikrotubulami (MAP2), α-tubulinie i GFAP.
2.3. Test barwienia immunofluorescencyjnego
po znieczuleniu myszy pentobarbitalem sodu (50 mg/kg), ich mózg ekstrahowano i utrwalano 0,9% zimnej heparynizowanej soli fizjologicznej i 4% paraformaldehydu. Po wymieszaniu, móżdżki były kolejno odwodnione w 20% roztworach sacharozy i 30% roztworach sacharozy. Sekcje o grubości 10 µm przygotowano za pomocą krajalnicy mrożonej Leica CM1900. Sekcje mózgowe inkubowano w 1% H2O2 przez 15 minut i 0,3% Triton X-100 przez 15 minut, z 3×płukaniem w PBS po inkubacji między każdym zabiegiem. Sekcje następnie blokowano w 5% normalnej surowicy koziej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C w pudełku nawilżającym z pierwotnymi przeciwciałami w następujący sposób: przeciwciało myszy anty-GFAP (#3670, 1:500, Technologia sygnalizacji komórkowej); przeciwciało królika anty-ndrg2 (#5667, 1:200, Technologia sygnalizacji komórkowej); przeciwciało myszy anty-ndrg2 (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); przeciwciało królika anty-s100ß (#2017-1, 1:500, epitomics); przeciwciało przeciw syntetazie glutaminowej myszy (GS) (#mab302, 1:200, Millipore); przeciwciało przeciw MAP2 królika (#Ab32454, 1:500, abcam); i przeciwciało przeciw α-tubulinie myszy (#T6199, 1:500, Sigma). Następnie sekcje inkubowano z mieszaninami Alexa-488 (zielony, Invitrogen) i Alexa-647 (czerwony, Invitrogen)-sprzężonych przeciwciałami drugorzędowymi przeciw królikowi lub osłowi przeciw mysim przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej. Do barwienia jąder użyto 4,6-Diamidino-2-fenylindolu (DAPI) (Zli-9557, Zsbio). Sekcje zostały zamontowane z 50% glicerolu. Ostatecznie sekcje zostały obejrzane i sfotografowane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Olympus Bx51 (Japonia). Przeciwciała użyte w naszym badaniu były szeroko stosowane w naszych poprzednich badaniach i przez innych badaczy , a czułość i swoistość tych przeciwciał została potwierdzona.
2.4. Western Blot
kora, hipokamp i Wzgórze zostały zebrane od myszy C57BL/6 w wieku 1 miesiąca, 3 miesięcy, 6 miesięcy, 9 miesięcy i 12 miesięcy. Próbki homogenizowano w buforze RIPA, a stężenie próbek białek mierzono za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA (Pierce Biotechnology, US). Próbki białka oddzielono 10% SDS-PAGE (SDS-PAGE Gel kit, CW0022S, Chiny) i elektrycznie przeniesiono do membran polifluorku winylidenu (PVDF). Składniki zestawu żelowego SDS-PAGE obejmowały 30% ACR-Bis, Bufor żelowy do oddzielania SDS-PAGE, Bufor żelowy do układania SDS-PAGE, ApS (Nadsiarczan amonu) i TEMED (N, N, N’, N’-tetrametyloetylenodiamina). Następnie membrany blokowano w 5% suchym mleku beztłuszczowym rozcieńczonym w TBST (TBS z 0,05% Tween 20) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano ze swoistymi pierwotnymi przeciwciałami: mysimi przeciwciałami anty-GFAP (#3670, 1:1000, Technologia sygnalizacji komórkowej); przeciwciało królika anty-ndrg2 (#5667, 1:1000, Technologia sygnalizacji komórkowej); przeciwciało królika anty-s100ß (#2017-1, 1:1000, Epitomics); i przeciwciało królika anty-GAPDH (#5174, 1:1000, Technologia sygnalizacji komórkowej) przez noc w temperaturze 4°C. membrany inkubowano z wtórnym przeciwciałem anty-królika lub przeciwciałem anty-myszy sprzężonym z HRP (#5667, 1: 1000, Technologia sygnalizacji komórkowej). Thermo Scientific, USA) Przez 2 godziny. sygnały chemiluminescencyjne zostały opracowane przy użyciu odczynnika chemiluminescencyjnego pioruna zachodniego plus (PerkinElmer Life Sciences; Wellesley, MA) i wykrywane przez analizator obrazu LI-COR Odyssey System (LI-COR Biotechnology, USA). Immunoreaktywność pasm białkowych analizowano ilościowo za pomocą oprogramowania Bio-Rad® Image Lab™. Wartości gęstości pasma znormalizowano do GAPDH.
2.5. Ilościowa (w czasie rzeczywistym) Reakcja łańcuchowa polimerazy (w czasie rzeczywistym PCR)
kora, hipokamp i Wzgórze zostały zebrane od myszy C57BL/6 w wieku 1 miesiąca, 3 miesięcy, 6 miesięcy, 9 miesięcy i 12 miesięcy. Całkowity RNA wyizolowano przy użyciu zestawu TransZol Up Plus RNA (kod No. ER501-01, Transgen, Chiny) i oznaczono ilościowo za pomocą NanoDrop 2000. Następnie 1000 ng całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji w reakcji 20 µL w temperaturze 42 ° C przez 15 minut, a następnie 85°C przez 5 sekund stosując Supermiksę syntezy cDNA TransScript® All-in-One dla qPCR (Kod nr. AT341, Transgen, Chiny). W skład zestawu wchodził 5×Transscript® All-in-One SuperMix dla qPCR (TransScript® RT, Inhibitor RNazy, Anchored Oligo(DT)18 Primer, Random Primer(N9), dNTPs, buffer), 5×Transscript® All-in-One no-RT Control SuperMix dla qPCR, zmywacz gDNA i woda bez RNazy. 5×Transscript® All-in-One no-RT Control SuperMix dla qPCR został użyty jako kontrola negatywna. PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono w reakcji 20 µL zgodnie z instrukcją producenta dla Transstart Tip Green Qrna SuperMix(Kod nr. AQ141, Transgen, Chiny). Zastosowane sekwencje starterowe mRNA można znaleźć w tabeli 1. Reakcję przeprowadzono w temperaturze 94 ° C przez 30 sekund, a następnie przez 40 cykli 94°C przez 5 sekund, 60°C przez 15 sekund i 72°C przez 19 sekund w systemie wykrywania PCR ViiA7 w czasie rzeczywistym (2720 Thermal Cycler, Applied Biosystems). Startery i sekwencje Pochodzące ze względnej ekspresji mRNA analizowano za pomocą wzoru .
|
||||||||||||||||||||||||
2.6. Analiza statystyczna
testy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania PRISM v7.0 (GraphPad). Porównania między dwiema grupami przeprowadzono za pomocą testów t ucznia. Porównania między różnymi grupami przeprowadzono przy użyciu jednokierunkowej ANOVA z posttestem Tukey ’ a. Wszystkie wartości przedstawiono jako średnią ± SD. Wartości p < 0,05 uznano za istotne statystycznie.
3. Wyniki
3.1. Dystrybucja astrocytów znakowanych przez NDRG2, GFAP i S100ß w różnych regionach mózgu
regiony móżdżku myszy zidentyfikowano poprzez etykietowanie jąder komórkowych. Dodatkowo, do weryfikacji analizowanych regionów użyto odpowiedniego atlasu mózgu myszy (ryc. 1). Następnie użyliśmy zabarwienia immunofluorescencyjnego do wykrywania dystrybucji astrocytów oznaczonych NDRG2, GFAP i S100ß w różnych regionach mózgu dorosłych samców myszy w wieku 6 miesięcy. Astrocyty NDRG2-i s100ß-dodatnie były bardziej obfite i bardziej równomiernie rozłożone niż astrocyty GFAP-dodatnie w całym móżdżku (fig.2). Astrocyty NDRG2-dodatnie koncentrowały się w korze grzbietowej (Region 1) i wzgórzach (Region 5), ale mniej w hipokampie (Region 4), ciele modzelowatym (Region 3) i korze brzusznej (Region 2), a najmniej w szypułce mózgowej (Region 6) (fig.2(A) i 2(b)). GFAP-dodatnie astrocyty koncentrowały się najbardziej w hipokampie; mniej wykryto w ciele modzelowatym i szypułce mózgowej, a prawie niewykrywalne w korze grzbietowej, korze brzusznej i wzgórzu (fig. 2(A) i 2(c)). S100ß-dodatnie astrocyty koncentrowały się najbardziej w korze grzbietowej i wzgórzu, mniej w hipokampie i korze brzusznej, a najmniej w szypułce mózgowej i ciele modzelowatym (fig. 2 (b) i 2(c)). Rozmieszczenie astrocytów NDRG2-dodatnich było podobne do rozmieszczenia astrocytów s100ß-dodatnich.
(a)
(b)
(a)
(b)
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
astrocyty w różnych regionach mózgu wykazywały nierówne działanie immunoreaktywne na NDRG2, GFAP i S100ß (ryc. 2). Astrocyty w korze grzbietowej i wzgórzu reagowały silnie na NDRG2 i S100ß, ale słabo na GFAP. Astrocyty w hipokampie reagowały silnie na GFAP i umiarkowanie na NDRG2 i S100ß. Astrocyty w korze brzusznej, ciele modzelowatym i szypułce mózgowej reagowały słabo lub umiarkowanie na NDRG2, GFAP i S100ß (Tabela 2).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
rozkład astrocytów oznaczonych NDRG2, GFAP i S100ß w różnych regionach mózgowych samców myszy był podobny do rozkładu starych samców myszy (12 miesięcy) (ryc. 3).
3.2. Morfologie astrocytów oznaczonych przez NDRG2, GFAP i S100ß w różnych regionach mózgu
astrocyty dzielą się głównie na dwa typy: astrocyty włókniste w istocie białej i astrocyty protoplazmatyczne w istocie szarej. Dlatego porównaliśmy morfologie dwóch typów oznaczonych różnymi markerami w ciele modzelowatym (istota biała, Region 3) i hipokampie (istota szara, Region 4) (Rysunek 4). Wyniki uzyskane od dorosłych samców myszy (6 miesięcy) wykazały, że astrocyty NDRG2 – i s100ß-dodatnie wykazywały kształt Gwiaździsty charakteryzujący się dużym i okrągłym soma wraz z krótkimi i grubymi procesami cytoplazmatycznymi, które miały kilka gałęzi. GFAP-dodatnie astrocyty przedstawiane o promieniowym kształcie charakteryzującym się małym soma, długimi procesami i wielogałęzieniami (ryc. 4). Ponadto w ciele modzelowatym i szypułce mózgowej astrocyty znakowane przez GFAP wykazywały obfite dłuższe procesy niż te znakowane przez NDRG2 i S100ß (Fig.5 i 7).
3.3. Kolokalizacja NDRG2, GFAP i S100ß w Astrocytach w różnych regionach mózgu
NDRG2 była prawie kolokalizowana z GFAP w astrocytach kory brzusznej, ciała modzelowatego i szypułki mózgowej, i głównie kolokalizowana z GFAP w astrocytach hipokampa (Fig. 5 i 8(A)). NDRG2 prawie nie miał kolokalizacji z GFAP w astrocytach kory grzbietowej i wzgórza (ryc. 5). NDRG2 i S100ß przedstawiły prawie całkowitą kolokalizację w astrocytach sześciu regionów mózgu(Fig.6 i 8 (b)). GFAP i S100ß przedstawiały znaczną kolokalizację w astrocytach kory brzusznej, ciałka modzelowatego i szypułki mózgowej oraz prawie całkowitą kolokalizację w astrocytach hipokampa(rycina 7). GFAP i S100ß nie miały prawie żadnej kolokalizacji w astrocytach kory grzbietowej i wzgórza (ryc. 7).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
wykryliśmy również kolokalizację NDRG2 i innego producenta astrocytów, syntetazy glutaminowej (GS), w astrocytach mózgu myszy. NDRG2 i GS miały znaczącą kolokalizację w astrocytach (rysunek s1a). NDRG2 i GS wykazały dokładną kolokalizację w astrocytach włóknistych ciała modzelowatego i w astrocytach protoplazmatycznych hipokampa (rysunek s1b). Wykryto również ekspresję białka ndrg2 w komórkach neuronalnej linii komórek HT22, oligodendroglialnej linii komórek OLN-93 i astrocytowej linii komórek MA1800-57 (rysunek s2). Białko ndrg2 zostało wykryte w komórkach MA1800-57 i ledwo wykryte w komórkach HT22 i OLN-93 (Fig. s2a i S2B).
3.4. Ekspresja białek Ndrg2, GFAP i S100ß w różnych regionach mózgu
użyliśmy western blotting do wykrycia poziomów ekspresji białek ndrg2, GFAP i s100ß w trzech regionach mózgu dorosłych samców myszy (6 miesięcy): kora, hipokamp i Wzgórze (ryc. 8 (c)). Przeanalizowaliśmy poziom ekspresji tych markerów w tym samym regionie mózgu (ryc. 8 (d)). W korze mózgowej poziom ekspresji NDRG2 był znacznie wyższy niż poziom ekspresji GFAP i s100ß (p <0,001, p<0,05). Poziom ekspresji S100ß był również znacznie wyższy niż GFAP (p< 0,05). W hipokampie poziom ekspresji GFAP był wyższy niż NDRG2 i S100ß (p<0.01), a poziom ekspresji NDRG2 był nieco mniejszy niż poziom ekspresji S100ß, chociaż różnica nie była statystycznie istotna. W wzgórzach poziom ekspresji S100ß był znacząco wyższy niż poziom ekspresji GFAP i ndrg2 (p< 0,01), podczas gdy poziom ekspresji ndrg2 był podobny do poziomu GFAP.
następnie przeanalizowaliśmy poziom ekspresji tego samego markera w różnych regionach mózgu (Rysunek 8(E)). Poziom ekspresji NDRG2 w korze mózgowej był znacznie wyższy niż w hipokampie i wzgórzu (p <0,01) i nie zaobserwowano znaczącej różnicy między hipokampem a wzgórzem. Poziom ekspresji GFAP w hipokampie był najwyższy spośród trzech regionów (p<0,001, p< 0,01); nie zaobserwowano znaczącej różnicy między korą a wzgórzem. Poziom ekspresji S100ß w wzgórzu był znacznie wyższy niż w korze mózgowej i hipokampie (p<0.01), nie zaobserwowano znaczącej różnicy między tymi dwoma ostatnimi.
wykryliśmy również poziom białka NDRG2, GFAP i S100ß w korze, hipokampie i wzgórzach samców myszy w wieku 1 miesiąca, 3 miesięcy, 6 miesięcy, 9 miesięcy i 12 miesięcy (Fig.9(A)-9(f)). Poziom białka NDRG2 i GFAP w korze mózgowej, hipokampie i wzgórzach stopniowo wzrastał wraz z wiekiem (p<0,05, p<0,01). Poziom białka S100ß w korze i wzgórzach, ale nie w hipokampie, stopniowo wzrastał wraz z wiekiem (p <0.05, p<0.01, p<0.001). Poziomy mRNA NDRG2, GFAP i S100ß w korze mózgowej, hipokampie i wzgórzach samców myszy w wieku 1 miesiąca, 3 miesięcy, 6 miesięcy, 9 miesięcy i 12 miesięcy były zgodne z poziomami białka (p<0,05, p<0,01, fig.i)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
4. Dyskusja
w tym badaniu odkryliśmy, że astrocyty oznaczone przez NDRG2 i S100ß były rozprowadzane szerzej i równomiernie niż te oznaczone przez GFAP w całym móżdżku młodych, dojrzałych i starych myszy. Sugeruje to, że NDGR2 i S100ß są bardziej odpowiednimi markerami do obserwacji ogólnego rozkładu i zmian liczby astrocytów. Co więcej, nasze wyniki wykazały, że astrocyty w różnych regionach mózgu wykazywały różne poziomy immunoreaktywności wobec NDRG2, GFAP i S100ß, co sugeruje, że w korze mózgowej i wzgórzach NDRG2 i S100ß są bardziej odpowiednimi markerami astrocytowymi niż GFAP. Nierówna immunoreaktywność astrocytów wobec ndrg2, GFAP i S100ß może być również spowodowana czułością i swoistością użytych przez nas przeciwciał. Dodatkowo morfologie astrocytów oznaczonych przez NDRG2 i S100ß były do siebie podobne, ale wyraźnie różniły się od tych oznaczonych przez GFAP, ponieważ markery te oznaczały różne struktury cytoszkieletu. NDRG2 plami cytoplazmę i błony komórkowe oraz słabo plami jądro . GFAP głównie plami soma i procesy, ale nie jądro, podczas gdy S100ß plami jądro i część cytoplazmy i procesy . Porównując morfologię astrocytów oznaczonych przez NDRG2, GFAP i S100ß, odkryliśmy, że GFAP był bardziej odpowiednim markerem dla astrocytów w ciałach modzelowia, szypułce mózgowej, a zwłaszcza hipokampie. Białka NDRG2 i s100ß ulegały ekspresji w większości odpowiednio w korze mózgowej i wzgórzach. Wnioskujemy, że NDRG2 jest bardziej odpowiedni dla astrocytów w korze mózgowej, podczas gdy S100ß jest bardziej odpowiedni dla astrocytów w wzgórzach podczas kwantyfikacji gęstości astrocytowej. Różne wzorce ekspresji białek NDRG2, GFAP i S100ß w korze mózgowej, hipokampie i wzgórzu potwierdziły astrocyty funkcjonalną heterogeniczność.
astrocyty odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy i aktywnie uczestniczą w prawie wszystkich zaburzeniach neurologicznych, takich jak udary niedokrwienne, urazowe urazy mózgu, choroba Alzheimera i choroba Parkinsona . Wykazano, że morfologia astrocytowa, ekspresja genów i funkcja różniły się między różnymi regionami móżdżku . Astrocyty włókniste i astrocyty protoplazmatyczne to dwie główne subpopulacje zidentyfikowane na podstawie ich morfologii . Włókniste astrocyty mają długie, cienkie procesy i wygląd podobny do gwiazdy, podczas gdy protoplazmatyczne mają liczne drobne procesy, które kontaktują się i synapsy otoczkowe . Co ciekawe, wiele genów jest heterogenicznie wyrażanych przez podgrupy astrocytów. Geny te kodują białka , takie jak transportery glutaminianu i kanały jonowe , a także receptory glutaminianu , dopaminy i opioidów .
heterogeniczność ekspresji genów implikowała różnorodność funkcjonalną astrocytów. Na przykład wychwyt glutaminianu różni się w różnych podgrupach . Ponadto spontaniczne oscylacje wapnia różnią się między różnymi warstwami kory somatosensorycznej. Astrocyty warstwy korowej 1 wykazywały częstą asynchroniczną aktywność Ca2+, podczas gdy astrocyty warstwy 2/3 wykazywały rzadką synchroniczną aktywność Ca2+. W korze mózgowej astrocyty reagują na glutaminian i noradrenalinę ze wzrostem wapnia, podczas gdy astrocyty hipokampa wykazują odpowiedzi wapniowe na ATP, GABA, glutaminian, acetylocholinę, prostaglandyny i endokannabinoidy . Badania wykazały również, że hodowane astrocyty z różnych regionów mózgu mają różne zdolności do stymulowania wzrostu i rozgałęzień neurytu . Ponieważ astrocyty w różnych regionach mózgu prezentują różne cechy morfologii i funkcji, identyfikacja najbardziej odpowiedniego markera dla astrocytów w różnych regionach mózgu jest kluczowa dla badaczy astrocytów.
chociaż kilka białek zostało zgłoszonych jako wybiórczo wyrażone przez astrocyty, żadne z nich nie zostało całkowicie ograniczone do wszystkich podtypów astrocytów. GFAP, najczęściej używany marker astrocytowy, jest preferencyjnie wyrażany w astrocytach istoty białej w porównaniu z astrocytami istoty szarej i nie etykietuje wszystkich procesów astrocytów . Co ważniejsze, istnieją podzbiory astrocytów GFAP-ujemnych, które prezentują zależne od napięcia prądy K+, podczas gdy astrocyty GFAP-dodatnie prezentują Klasyczny wzór prądów niezależnych od czasu i napięcia .
poprzednie badania wykazały, że S100ß był w stanie oznaczyć astrocyty zarówno w istocie szarej, jak i białej; jednak wyrażono go również w kilku oligodendrocytach i neuronach . Stwierdzono, że S100ß ulega ekspresji w większości w astrocytach wzgórza, podtypie komórek, które uczestniczą w oczyszczaniu gruzu Daergicznego wytwarzanego przez degenerację końcówek Daergicznych w chorobie Parkinsona, ułatwiając obecność lizosomów i tworzenie autofagosomów . W analizie transkryptomicznej astrocytów zidentyfikowano rodzinę dehydrogenazy aldehydowej 1, członka L1 (ALDH1L1), jako marker astrocytowy . Jednak ALDH1L1 również oznaczał oligodendrocyty . Podobnie, pobudzające transportery aminokwasów transporter glutaminian/asparaginian (GLAST), syntetaza glutaminowa (GS), transporter glutaminian-1(GLT-1), wimentin, connexin 43, aquaporin 4 i glikoproteina powierzchniowa komórki CD44 również miały ograniczenia podczas znakowania astrocytów .
NDRG2 jest specyficznie wyrażany w astrocytach zarówno szczurów, jak i myszy i jest związany ze wzrostem i dojrzewaniem rozwijającego się embrionalnego mózgu . Oprócz proliferacji, różnicowania komórek i transportu przezbłonowego, NDRG2 uczestniczy również w odpowiedziach na stres, depresji, chorobach niedokrwiennych i zaburzeniach neurodegeneracyjnych . U myszy i ludzi NDRG2 bierze udział w rozwoju zespołu nadpobudliwości psychoruchowej (ADHD), choroby związanej z centrum lokomocji w korze mózgowej . Flugge i in. wykrył ekspresję NDRG2 w mózgach ludzi, marmozet, strzępek drzew, szczurów i myszy i zasugerował, że NDRG2 był nowym markerem astrocytowym, szczególnie dla dojrzałych, niereaktywnych i nieproliferacyjnych astrocytów . W tym badaniu po raz pierwszy wykryliśmy wzór dystrybucji astrocytów ndrg2-dodatnich w różnych regionach mózgu i różnice z astrocytami oznaczonymi klasycznymi markerami GFAP i S100ß.
astrocyty i markery astrocytowe zmieniły się podczas normalnego starzenia mózgu. Wcześniejsze prace wykazały, że astrocyty są aktywowane we wczesnym okresie starzenia, a znaczny wzrost astrocytów GFAP-dodatnich stwierdzono w regionach hipokampa starszych myszy . Poziomy zarówno białka GFAP, jak i mRNA GFAP wzrosły w różnych częściach starzejących się mózgów, takich jak kora mózgowa, hipokamp i móżdżek . Rozbieżności pozostają wśród różnych raportów S100ß w starzejącym się mózgu . Coraz częściej badania wykazały, że NDRG2 jest związany z zaburzeniami związanymi z wiekiem, takimi jak choroba Alzheimera. W naszym badaniu poziomy GFAP i ndrg2 mRNA w korze, hipokampie i wzgórzu stopniowo zwiększały się wraz z wiekiem, podczas gdy poziomy mRNA s100ß w hipokampie i wzgórzu zwiększały się wraz z wiekiem, ale nie w korze.
należy zauważyć, że obecnie wiele markerów oprócz tych, które testowaliśmy, takich jak ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44 i vimentin, jest używanych do oznaczania astrocytów. W naszych badaniach porównaliśmy tylko klasyczne astrocyty mózgowe oznaczone przez nowy zaproponowany marker NDRG2 i najczęściej stosowane markery: GFAP, S100ß i GS w móżdżku.
podsumowując, nasze badania wskazują, że NDRG2 i S100ß są bardziej odpowiednimi markerami dla astrocytów odpowiednio w korze mózgowej i wzgórzach, a także do obserwacji ogólnego rozkładu i zmian liczby astrocytów w całym móżdżku. Tymczasem GFAP jest lepszy od NDRG2 i S100ß w znakowaniu procesów i gałęzi astrocytów w ciałach modzelowych, szypułce mózgowej, a zwłaszcza hipokampie. Nasze badania pokazują, jak ważne jest wybranie najbardziej odpowiedniego markera dla astrocytów w różnych mysich regionach mózgu, co zapewnia wskazówki dla badaczy neuronauki podczas badania funkcji astrocytowych.
dostępność danych
dane użyte do potwierdzenia wyników tego badania są zawarte w artykule.
ujawnienie
zengli Zhang i Zhi Ma są współautorami.
konflikty interesów
autorzy oświadczają, że nie występują w nich konflikty interesów.
wkład autorów
Zengli Zhang i Zhi Ma przyczynili się w równym stopniu do tego badania.
podziękowania
ta praca była wspierana przez Beijing Natural Science Foundation (nr 7194321 do Lixia Zhang), National Natural Science Foundation Of China (nr 81801138 Do Yulong Ma, nr 81771206 do Wangyuan Zou), Young Scholar Research Grant Chińskiego Stowarzyszenia anestezjologów (nr 21700001 Do Yulong Ma), Miaopu Foundation of Chinese Anesthesiologists Association (nr 21700001 Do Yulong Ma), Miaopu Foundation of Chinese Anesthezjologists PLA General Hospital (No. 18kmm47 do Lixia Zhang), a Pekin Municipal Science & Technology Commission (no.1811000017180022 do powieszenia Guo).
Materiały uzupełniające
rysunek uzupełniający 1. Kolokalizacja NDRG2 i GS w astrocytach. Rysunek Uzupełniający 2. Ekspresja białka NDRG2 w liniach komórkowych. (Materiały uzupełniające)