biotyna i jej partner wiążący awidyna są obecnie powszechnie stosowane w biologii molekularnej dla szeregu różnych technik i protokołów. W tym poście omówimy naturalną rolę biotyny, biotynylację, odkrycie interakcji biotyna-awidyna i zastosowania biotynylacji w biologii molekularnej!
dowiedz się o biotynylacji bakteryjnych białek fuzyjnych in vivo
Biotyna jest niezbędną witaminą dla życia
chociaż Biotyna jest najczęściej znana ze swojej roli w biologii molekularnej, biotyna (witamina H lub witamina B7) jest najpierw niezbędnym koenzymem, który jest wymagany przez wszystkie organizmy do życia. Biotyna jest syntetyzowana tylko przez rośliny, większość bakterii i niektóre grzyby, dlatego Ssaki muszą uzyskać witaminę ze źródeł zewnętrznych. Ludzie wchłaniają większość biotyny, której potrzebują w jelicie cienkim, z mikroflory, która tam mieszka.
Biotyna jest kofaktorem, który w swojej aktywnej formie jest kowalencyjnie przyłączony do aktywnego miejsca kluczowych enzymów metabolicznych, w tym karboksylazy biotyny i dekarboksylazy. Enzymy te katalizują przenoszenie grup karboksylowych do kwasów organicznych w celu wytworzenia ważnych metabolitów komórkowych. Biotyna działa jako nośnik karboksylowy z jednego związku do drugiego. Te enzymy zależne od biotyny są niezbędne w procesach takich jak glukoneogeneza, lipogeneza, metabolizm aminokwasów i transdukcja energii.
Biotynylacja jest ogólnym procesem, w którym Biotyna jest dodawana do białka lub makrocząsteczek. Biotyna może być dodawana enzymatycznie lub chemicznie. Biotynylacja enzymatyczna występuje naturalnie w komórkach i jest procesem, w którym Biotyna jest kowalencyjnie związana ze specyficzną lizyną w miejscu aktywnym nowo zsyntetyzowanego enzymu. Biotyna protein ligase (BPL) jest odpowiedzialna za tę wysoce specyficzną potranslacyjną modyfikację białek. Większość organizmów ma mniej niż pięć enzymów w całym proteomie, które są biotynylowane. Na przykład w E. coli BPL, BirA, jest odpowiedzialny za biotynylowanie tylko jednej lizyny w całym organizmie na biotyn carboxyl carrier protein (BCCP).
odkrycie interakcji biotyna-awidyna
pod koniec lat 30.XX wieku zaobserwowano, że zwierzęta karmione dietą złożoną głównie z białek jaj rozwijają zmiany skórne i inne straszne problemy zdrowotne. Choroba ta została określona jako „uszkodzenie białka jaja” i ustalono, że jest to spowodowane niedoborem witaminy H, przemianowanej później na witaminę B7 / biotynę. Uraz białka jaja spowodowałby te zwierzęta, nawet jeśli ich dieta była uzupełniana biotyną. Tak więc coś w białku jaja sekwestrowało biotynę przed wchłonięciem. W 1940 Esmond E. Snell był w stanie oczyścić białko odpowiedzialne za Wiązanie biotyny, awidyny. Avidin został trafnie nazwany od kurczaka, „ptasiego”, jaja, z którego został oczyszczony. Snell później potwierdził, że awidyna rzeczywiście była sprawcą uszkodzenia białka jaja przez karmienie szczurów oczyszczoną awidyną(Kresege et al., 2004). Awidyna jest glikoproteiną składającą się z czterech identycznych podjednostek, z których każda może wiązać jedną cząsteczkę biotyny.
biotyna i awidyna mają do siebie niezwykle silne powinowactwo. W rzeczywistości wiązanie między nimi jest jednym z najsilniejszych niekowalentnych oddziaływań białkowo-ligandowych występujących w przyrodzie. Po utworzeniu wiązania nie ma wpływu na zmiany pH, temperatury lub rozpuszczalników organicznych.
zastosowania biotyny w biologii molekularnej
Biotyna jest stosunkowo małą, rozpuszczalną w wodzie cząsteczką, która nie koliduje z makrocząsteczkami, do których jest dodawana. Biotyna ma również odsłonięty łańcuch boczny, który można łatwo manipulować, aby tworzyć reaktywne gatunki bez wpływu na miejsce wiązania awidyny. Przy wszystkich tych cechach nie dziwi fakt, że naukowcy zaczęli wykorzystywać biotynę i jej silne interakcje z awidyną do celów biologii molekularnej i biotechnologii.
Po biotynylowaniu polipeptydu (więcej o tym poniżej) można go inkubować lub współekspresować z awidyną lub strukturalnie podobnym białkiem odkrytym w latach 60-tych, strepawidyną. Kompleks biotyna-awidyna może być następnie używany i / lub manipulowany zgodnie z przeznaczeniem naukowca. Dwa najczęstsze zastosowania biotynylacji w laboratorium to oczyszczanie białek i eksperymenty immunoprecypitacji. Biotynylowane białka lub kompleksy można łatwo oczyszczać za pomocą kolumn lub kulek pokrytych awidyną.
interakcja biotyna-awidyna została również przystosowana do stosowania w immunohistochemii i znakowaniu przeciwciał. W tych eksperymentach Biotyna jest dodawana do pierwotnego lub wtórnego przeciwciała, które celuje odpowiednio w białko będące przedmiotem zainteresowania lub przeciwciało pierwotne. Awidyna związana z reporterem jest następnie dodawana do reakcji w celu łatwego wykrycia. Liczne miejsca wiązania biotyny znalezione na awidynie są również idealne do wzmocnienia sygnału podczas tych eksperymentów. Podczas wykrywania do próbki można dodać biotynylowany enzym reporterowy, który jest wstępnie inkubowany z wolną awidyną. Wszelkie wolne miejsca wiążące biotynę w tym kompleksie mogą wiązać się z przeciwciałem biotynylowanym. Tworzy to dużą siatkę kompleksów biotyny-awidyny związanych z interesującym białkiem, co prowadzi do wzmocnienia sygnału reporterowego i łatwiejszego wykrycia. Strategia ta jest określana jako kompleks Awidyny-biotyny (ABC) immunohistochemia (IHC). Więcej informacji na temat ABC i IHC można znaleźć w Przewodniku naukowym Thermo Fisher.
istnieje szereg innych zastosowań biologii molekularnej dla biotyny i awidyny. Poniżej znajduje się krótka lista innych popularnych aplikacji oraz linki do odpowiednich dokumentów i stron internetowych.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of biotyna i awidyna, makrocząsteczki zainteresowania najpierw muszą być biotynylowane. Naukowcy opracowali kilka metod chemicznie biotynylowania makrocząsteczek będących przedmiotem zainteresowania zarówno in vitro, jak i In vivo.
odczynniki Biotynylacyjne:
odsłonięty łańcuch boczny biotyny może być usieciowany z grupami funkcyjnymi aminokwasów in vivo za pomocą specjalistycznych chemikaliów (odczynniki biotynylacyjne). Istnieje wiele dostępnych odczynników biotynylacyjnych, które różnią się pod względem grup funkcjonalnych lub docelowych pozostałości, a także ich rozpuszczalności, a zatem różne odczynniki są przydatne do biotynylacji w różnych mikrośrodowiskach. Istnieją również odwracalne i rozszczepialne odczynniki biotynylacyjne, które pomagają w specyficznej elucji biotynylowanych białek. Aby uzyskać pomoc w określeniu, którego odczynnika biotynylacyjnego użyć, sprawdź narzędzie wyboru odczynnika Biotynylacyjnego Thermo Fisher Scientific.
białka AviTag i BirA:
można również biotynylować wykorzystując specyficzność E.coli BPL, BirA. Bira biotynyluje tylko jedną lizynę w całym proteomie E. coli. Korzystając z tej wiedzy, naukowcy zidentyfikowali sekwencję 13 aminokwasów wymaganą do rozpoznania BirA i biotynylacji. Ta 13-aminokwasowa Sekwencja nazywana jest Awitagiem. Używając AviTag, można oznaczyć interesujące białko biotyną, po prostu tworząc fuzję, w której AviTag jest dodawany do końca N lub C białka. Wykazano, że BirA skutecznie biotynyluje białka ekspresujące AviTag w komórkach bakterii, drożdży, owadów i ssaków. Sprawdź Kay et al., 2009 for methods on biotinylating proteins with BirA.
w Addgene można znaleźć plazmidy zawierające zarówno AviTag, jak i BirA!
etykietowanie oligonukleotydów:
biotyna może być dodana do dowolnego końca sekwencji DNA podczas reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) za pomocą biotynylowanego startera. Biotyna może być również enzymatycznie włączona podczas PCR przy użyciu znakowanej biotyną dUTP. Istnieje wiele rodzajów etykiet biotyny, które można dodać do oligonukleotydu w zależności od dalszego zastosowania. Oligonukleotydy znakowane biotyną mogą być stosowane w wielu zastosowaniach, w tym między innymi do hybrydyzacji in situ, blottingu (Północnego i Południowego) i wiązania powinowactwa.
Fotobiotinylacja:
Fotobiotyna może być stosowana do selektywnego znakowania DNA i RNA. Octan fotobiotyny składa się z cząsteczki biotyny przyłączonej do fotoreaktywnej grupy arylazydowej. W silnym świetle widzialnym Grupa arylazydowa staje się reaktywna i tworzy połączenie z pobliskimi kwasami nukleinowymi(McInnes et al., 1990). Fotobiotinylacja jest czasami łatwiejsza i tańsza niż inne metody enzymatyczne. Naukowcy powszechnie stosowali tę metodę do przyłączania białek lub polipeptydów do stałego podłoża (Holden and Cremer, 2003).
1. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. „Molecular Biology of Biotin Attachment to Proteins; Symposium: Nutrition, Biochemistry and Molecular Biology of Biotin” J. Nutr, 129 (2009a): 477-484. PubMed PMID: 10064313.
2. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. „The enzymatic biotinylation of proteins: a post-translational modification of exceptional specificity.”Trendy w naukach biochemicznych, 24.9 (1999b): 359–363. PubMed PMID: 10470036
3. Said, H. M. ” biotyna: zapomniana witamina.”American Journal of Clinical Nutrition 75.2 (2002): 179-180. PubMed PMID: 11815306
4. Nicole Kresge, R. D. S. and R. L. H. ” the Discovery of Avidin by Esmond E. Snell.”J Biol Chem 279.e5 (2004). PubMed PMID: 20353954.
5. Kay, B., Thai, S., & Volgina, V. ” High-Throughput Biotinylation of Proteins.”Methods Mol Biol, 498 (2009): 185-196. PubMed PMID: 18988027. PubMed Central PMCID: PMC3223083.
6. McInnes, J. L., Forster, A. C., Skingle, D. C., & „Methods in Enzymology 184 (1990): 588-600. PubMed PMID: 2388593
7. Holden, M. A., & Cremer, P. S. ” aktywowane światłem wzorce cząsteczek znakowanych barwnikiem na powierzchniach.”Journal of the American Chemical Society 125.27( 2003): 8074-8075. PubMed PMID: 12837056
8. Pan, J. feng, Liu, N. hua, Shu, L. yuan, & Sun, H. ” zastosowanie technologii awidyny-biotyny w celu poprawy adhezji komórek na matrycach nanowłóknistych.”Journal of Nanobiotechnology 13.1 (2015): 1–14. PubMed PMID: 25980573. PubMed Central PMCID: PMC4461904.
9. Huang, Q., Mao, Z., Li, S., Hu, J.,& Zhu, Y. „a non-radioactive method for small RNA detection by northern blotting.”Rice 7.1 (2014): 1-7. PubMed PMID: 26224555. PubMed Central PMCID: PMC4884002.
10. Boer, E. de, Rodriguez, P., Bonte, E., Krijgsveld, J., Katsantoni, E., Heck, A., … Strouboulis, J. ” Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.”PNAS 100.13 (2003): 7480-5. PubMed PMID:12802011. PubMed Central PMCID: PMC164612.
11. Liou, Y.-R., Wang, Y.-H., Lee, C.-Y., & li, P.-C. „Buoyancy-Activated Cell Sorting Using Targeted Biotynylated Albumin Microbubbles.”PLoS ONE 10,5 (2015). PubMed PMID: 25993512. PubMed Central PMCID: PMC4439073.
12. Ludwig, L. B., Hughes, B. J.,& Schwartz, S. A. „Biotynylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA–protein interactions.”Nucleic Acids Research, 23.18( 1995): 3792-3793. PubMed PMID: 7479014 PubMed Central PMCID: PMC307283.
13. Howarth, M.,& Ting, A. Y. „obrazowanie białek w żywych komórkach ssaków z ligazą biotyny i monowalentną streptawidyną.”Nature Protocols 3.3 (2008): 534-545. PubMed PMID: 18323822. PubMed Central PMCID: PMC2671200.
14. Bloch, B. ” Biotynylated probe for in situ hybridization histochemistry: use for mRNA detection.”The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society, 41.12 (1993): 1751-1754.PubMed PMID: 8245422.
dodatkowe zasoby na blogu Addgene
- in vivo biotinylation of bacterial fusion proteins
- dowiedz się, jak biotyna jest używana w Split-BioID: ulepszona metoda badania interakcji białko-białko
- dowiedz się, jak biotyna może być stosowana z CRISPR