podwójna blokada CD47 i HER2 eliminuje promieniotwórcze komórki raka piersi

linie komórkowe

ludzki rak piersi MCF-7, MDA-MB-231, bt474, BT549, linie komórkowe SKBR3, glejak U251 i rak jelita grubego linie komórkowe hct116 zostały zakupione od ATCC. Komórki MCF-7, MDA-MB-231, bt474, BT549 i u251 utrzymywano w pożywce dmem uzupełnionej 10% FBS, a komórki SKBR3 utrzymywane w pożywce RPMI-1640 z 10% FBS. Komórki HCT116 utrzymywano w pożywce 5A z 10% FBS. Radiorezystancyjne linie komórkowe MCF7 / C6 i MDA-MB-231 / C5, które zostały sklonowane z ocalałych frakcji komórek MCF7 i MDA-MB-231 po wielokrotnym napromieniowaniu; z MCF7/C626 wyizolowano nadekspresujące HER2 komórki macierzyste raka piersi (HER2+/CD44+/CD24-/low bcscs). Komórki 4T1 myszy z potrójnym ujemnym rakiem piersi utrzymywały się w pożywce dmem z 10% FBS. Ludzkie monocyt THP-1 hodowano w pożywce rpmi-1640 sformułowanej w ATCC, uzupełnionej 10% FBS, 15 mM HEPES, 4,5 g/L glukozy i 2-merkaptoetanolu do końcowego stężenia 0,05 mM. mysz mφ surowy 264.7 komórek hodowano w pożywce DMEM z 10% FBS po zastosowaniu metody hodowli ATCC. Wszystkie linie komórkowe były testowane z ujemnym zanieczyszczeniem mykoplazmą za pomocą MycoSensor PCR Assay kit (Agilent Technologies, Catalog # 302108).

plazmidy i odczynniki

wektor lucyferazy cd47 sterowany promotorem został skonstruowany przez klonowanie ludzkiego regionu promotora CD47 (-1554 nt) do plazmidu zasadowego pGL2 z miejsc KpnI / Hind III. Usunięcie domniemanych miejsc wiązania NF-kB (TGGAAGCT-764-757) przeprowadzono przy użyciu zestawu szybkiej mutacji (Stratagene, La Jolla, CA). Zastosowane sekwencje podkładowe: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Lapatinib (Nr katalogowy S1028 ) został zakupiony w Selleckchem. Przeciwciała anty-CD47 (B6H12) przeciwko IHC, ICC i western blot zakupiono w Santa Cruz (Nr katalogowy sc-12730). Anty-CD47-FITC do cytometrii przepływowej został zakupiony w BD Biosciences ( Nr katalogowy 556045). Przeciwciało przeciw ludzkiemu CD47 (B6H12) do testu fagocytozy ekstrahowano z hybrydomy b6h12.2 (ATCC® HB-9771™). Przeciwciało anty-mysie CD47 do hamowania nowotworu in vivo wyekstrahowano z hybrydomy MIAP301 dostarczonej przez dr Williama Fraziera (Washington University School Of Medicine). Przeciwciało anty-CD11b do barwienia IHC zakupiono od Invitrogenów (Nr katalogowy MA5-17857). Mysie monoklonalne przeciwciało anty-α-tubulinowe przeciwko western blot zostało zakupione od Sigma-Aldrich (Nr katalogowy T6074). Mysie monoklonalne przeciwciało przeciw β-aktynie przeciwko western blot zostało zakupione od Sigma-Aldrich (Nr katalogowy A5441). Przeciwciała anty-HER2/ERBB2 (Nr katalogowy 29d8) do barwienia IHC i western blot zakupiono z technologii sygnalizacji komórkowej (Nr katalogowy 2165). Przeciwciało anty-HER2-APC do analizy cytometrii przepływowej zakupiono w BD Biosciences ( Nr katalogowy 340554).

immunoblotting

białka z komórek lub tkanek nowotworowych ekstrahowano w buforze do lizy RIPA (Pierce) uzupełnionym koktajlem inhibitorów proteazy i fosfatazy (Sygnalizacja komórkowa). Stężenie białka oznaczano za pomocą testu BCA (Pierce). Lizaty poddano następnie denaturacji i próbki zawierające 30 µg białek poddano elektroforezie w 10% żelu poliakrylamidowym SDS, a następnie przeniesiono do membran difluorku poliwinylidenu (Bio-Rad). Po zablokowaniu suchym mlekiem beztłuszczowym w 5%, błonę narażono na działanie pierwotnego przeciwciała i inkubowano w temperaturze 4 °C przez noc. Plamy wizualizowano przez znakowanie wtórnymi przeciwciałami sprzężonymi z HRP (Sigma-Aldrich) i inkubację z odczynnikiem Amersham ECL western blotting detection (Nr katalogowy RPN2106). Bloty zostały opracowane na wywoływaczu Konica SRX101A i oznaczone za pomocą ImageJ.

Analiza cytometrii przepływowej

zebrane komórki przepłukano PBS zawierającym 0,5% BSA w PBS i granulki komórek inkubowano z pierwszorzędowymi przeciwciałami znakowanymi fluorescencją w 37 °C przez 30 minut, a następnie trzykrotnie przemyto 0,5% BSA / PBS. Wszystkie przeciwciała miareczkowano w celu optymalizacji stanu przed zastosowaniem do eksperymentu. Analizę cytometrii przepływowej przeprowadzono za pomocą CYTOMETRU FACS Canto II (BD), a następnie za pomocą oprogramowania FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA). Strategie bramkowania opierały się na właściwościach FSC i SSC i zostały skonfigurowane dla dodatnich populacji komórek w kanałach FITC, APC.

tkanki ludzkiego raka piersi

świeżo zamrożone HER2 dodatnie i ujemne tkanki raka piersi zostały dostarczone przez Bioreposytorium UC Davis Comprehensive Cancer Center (IRB # 283665 i IRB # 218204) finansowane przez UC Davis Comprehensive Cancer Center Support Grant (CCSG) przyznawany przez National Cancer Institute (NCI P30CA093373) z zablokowanymi wszystkimi informacjami o pacjencie, z wyjątkiem wyników diagnostycznych. Dodatkowe patologiczne próbki ludzkiego raka piersi, w tym nieutwardzone odcinki o grubości 4 µm formalin-fixed parafin-embedded (FFPE) sparowane z pierwotnym rakiem piersi i nawracającymi nowotworami piersi, uzyskano z Departamentu patologii Ohio State University z zatwierdzeniem badań IRB (#2002h0089).

immunohistochemiczne (IHC)

immunohistochemiczne barwienie przeprowadzono na tkankach FFPE o grubości 4 µm. Krótko, szkiełka poddano deparaffinizacji i ponownie nawodniono, a antygeny pobrano przez 40 minut w buforze cytrynianowym (pH 6,1) w temperaturze 95 °C. Aktywność endogennej peroksydazy została zablokowana 3% roztworem H2O2. Pierwotną inkubację przeciwciał przeprowadzono w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie przez zestaw VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories) w RT przez 30 minut, zgodnie z instrukcjami producenta. Produkty reakcji wykryto za pomocą zestawu substratów peroksydazy i przeciwstawiono hematoksyliną (Vector Laboratories). Dwóch starszych patologów było odpowiedzialnych za diagnozę klinicznego raka piersi i ocenę nowotworów doświadczalnych. Ekspresję CD47 oceniano stosując zarówno intensywność barwienia, jak i procent zabarwionych komórek. Intensywność barwienia oceniono jako 0: ujemny; 1: słaby; 2: umiarkowany; 3: silny. Wysoka ekspresja została zdefiniowana jako silne natężenie barwienia w ponad 25% komórek nowotworowych; średnia ekspresja była umiarkowana intensywność barwienia w ponad 25% komórek nowotworowych; niska ekspresja była słabą intensywnością barwienia w ponad 25% komórek nowotworowych lub umiarkowanym barwieniem w <25% komórek nowotworowych przy użyciu wytycznych ASCO-CAP 63 wykorzystano do interpretacji IMMUNOHISTOCHEMII HER2 (IHC), a ekspresję białka HER2 oceniono jako ujemną IHC 0 (Brak barwienia lub barwienia błonowego, które jest niekompletne i jest słabe/ledwo wyczuwalne i mieści się w granicach ≤10% inwazyjnych komórek nowotworowych) lub ujemną IHC 1+ (niepełne zabarwienie błony, które jest słabe/ledwo wyczuwalne i w >10% inwazyjnych komórek nowotworowych); niejednoznaczne IHC 2+ (Całkowite zabarwienie błony obwodowej, które jest niekompletne i/lub słabe/umiarkowane oraz w obrębie >10% inwazyjnych komórek nowotworowych; oraz lub całkowite i obwodowe zabarwienie błony obwodowej, które jest intensywne i w granicach ≤10% inwazyjnych komórek nowotworowych); dodatnie IHC 3+ (całkowite zabarwienie błony obwodowej, intensywne w ponad 10% inwazyjnych komórek nowotworowych). Jeśli wyniki były niejednoznaczne (2+), badanie odruchowe przeprowadzono stosując hybrydyzację in situ (ISH). W wykrywaniu ekspresji CD47 napromieniowanych guzów in vivo, leczone guzy myszy usuwano i utrwalano w 4% paraformaldehydu w PBS przez 24 godziny. próbki odwodniono szeregowo etanolem (70%, 95% i 100%) przez 48 godzin przed osadzeniem w roztworze parafiny (Polysciences).

Immunocytochemia (ICC)

komórki wysiewano na okrągłych pokrywkach i hodowano do 60-80% zbiegu, następnie płukano PBS, utrwalano w 4% paraformaldehydu (pH 7,2) i przenikano 0,1% Triton X-100 w PBS. Następnie komórki inkubowano w roztworze blokującym przez 15 minut przed inkubacją z pierwotnym przeciwciałem przez noc w temperaturze 4 °C z rozcieńczeniami 1: 250. Komórki inkubowano z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z TR-lub FITC rozcieńczonymi 1: 1000 w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności i analizowano mikroskopią konfokalną.

Identyfikacja białek antygenowych związanych z promieniowaniem

myszy C57/B6 użyto jako gospodarza immunizacyjnego z komórkami 5 × 106 MCF7 / C6 w 0.1 ml objętości wstrzyknięto u podstawy ogona lub podnóżka myszy, a następnie zwiększono taką samą objętość komórek w 14 dniu. W 5-7 dniu po drugim badaniu myszy poddano eutanazji i zebrano surowicę w celu wykrycia cząsteczek antygenowych ulegających ekspresji w promieniotwórczych komórkach BC. W celu odróżnienia RAAPs od niespecyficznych cząsteczek wyrażonych w normalnych komórkach nabłonka piersi i komórkach mcf7 typu dzikiego przeprowadzono procedurę wstępnego oczyszczenia surowicą w następujący sposób. Dwa miliony ludzkich normalnych komórek nabłonka MCF10A piersi przygotowano w roztworze zawierającym 1 mm EDTA / PBS bez trypsyny, aby uniknąć trawienia niektórych wrażliwych białek, a następnie dwukrotnie przepłukano PBS. Komórki granulowano, a następnie poluzowano, dotykając dna probówki, a następnie dodając 1 ml mysich anty-surowic i obracając w temperaturze 4 °C przez 2 godziny. mieszaninę odwirowywano w temperaturze 9391 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zebrano supernatanty, które powtórzono raz. Pierwszą oczyszczoną surowicę oczyszczono następnie przez inkubację z dzikimi komórkami MCF7 przy użyciu tych samych procedur i powtórzono sześć razy. Ostatecznie oczyszczoną surowicę testowano następnie metodą western blot przeciwko lizatowi białkowemu z komórek MCF10A, komórek MCF7, MCF7/C6 i komórek RD-BCSC, które posortowano według markerów komórek macierzystych raka piersi HER2+/CD44+/ CD24− oraz dehydrogenazy aldehydowej (ALDH) 64. CD47 i HER2 wraz z innymi Raap w radiorezystancyjnych komórkach BC zidentyfikowano przez western blots lub przez immunoprecypitację białek błonowych oczyszczonych z komórek Rd-BCSC, a eluowane frakcje analizowano za pomocą LC / MS. uzyskane raapy błonowe grupowano z wieloma białkami i białkowymi kategoriami funkcjonalnymi.

CRISPR edycja HER2 i CD47

sgrna zostały zaprojektowane zgodnie z instrukcją opublikowaną przez oprogramowanie CRISPR Dr Zhang Lab (http://crispr.mit.edu) I ustanowionym protokołem, który został opisany w poprzedniej publikacji65. Zaprojektowano cztery Oligos odpowiadające ludzkim sgrna zsyntetyzowano i sklonowano do wektora lentiCRISPR v2 zgodnie z protokołem amplifikacji Biblioteki Zhang Lab Gecko. Aby zminimalizować możliwość niespecyficznego celowania, zsyntetyzowano i przetestowano trzy oligos sgRNA każdego genu celującego. Do kolejnych eksperymentów wybrano sgRNA o najlepszej skuteczności knockout określonej przez Western blotting. Sekwencje sgRNA zostały użyte dla komórek ludzkich i mysich w następujący sposób:

hHer2gRNA_F: CACCGCGGCACAGACAGTGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. Po inkubacji przez 12 godzin do komórek Dodano 1 ml supernatantu zawierającego wirus z polibrenem o pojemności 8 ng, a następnie inkubowano przez 6 godzin. następnie dodano 0,5 ml dodatkowego regularnego podłoża zawierającego 10% inaktywowanego termicznie FBS i dalej hodowano przez noc. Podłoże infekcyjne zastąpiono 2 ml pożywki świeżej z 10% FBS i hodowano przez 72 godziny. komórki przepuszczono do 60 mm naczyń do hodowli tkankowej i wybrano przez hodowlę w 0,3 µg/ml Puromysiny przez 1 tydzień, a nokaut docelowego genu zweryfikowano przez immunoblotting.

test Lucyferazy

komórki transfekowano za pomocą reporterów lucyferazy pgl2-basic-CD47 lub pgl2-basic-CD47-ΔNF-kB lub PGL2-NF-kB, a aktywność lucyferazy mierzono za pomocą Luminometru (Promega, Madison, WI). W celu normalizacji skuteczności transfekcji reporterowej, całkowite stężenie białek lizatów mierzono za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA (Pierce, Rockford, IL) z BSA jako standardem.

test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

komórki usieciowano formaldehydem (1% końcowy) przez 10 minut, przemyto zimnym lodem PBS i zebrano w buforze do lizy SDS (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8. 1). Chromatynę ścięto przez sonikację, wstępnie oczyszczono za pomocą sprzężonych z białkiem G kulek agarozowych i inkubowano z anty-p65, anty-C-Rel lub normalnym IgG w 4 ° C przez noc. Po dodaniu białka G przez 2 godziny w temperaturze 4 °C kompleks przemyto w sposób sekwencyjny buforami myjącymi o niskiej i wysokiej zawartości soli (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 plus 150 mM NaCl dla buforów o niskiej zawartości soli i 500 mM NaCl dla buforów o wysokiej zawartości soli), a następnie bufor TE (dwukrotnie). Interakcję DNA z czynnikiem transkrypcyjnym odwrócono po dodaniu NaCl i inkubacji w temperaturze 65 °C przez noc. Po trawieniu Rnazą a i Proteinazą K, fragmenty DNA oczyszczano przez ekstrakcję fenolem / chloroformem i wytrącanie etanolem. DNAs oczyszczano i stosowano do PCR z starterami specyficznymi dla regionu promotora genu obejmującego miejsca wiązania NF-kB. Podkłady CD47 były:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. Monoklonalne szczurze przeciwciało CD47 IgG2a myszy (Miap301) i hybrydoma otrzymano od dr Williama Fraziera (Washington University School Of Medicine). Obie linie komórkowe hybrydomy utrzymywano w pożywce IMDM z 20% FBS. Przeciwciała oczyszczono z supernatantu hybridoma przy użyciu białka G z GenScript (Nr katalogowy L00209) zgodnie ze standardowymi procedurami wytwarzania. Próbki następnie zagęszczano 10-20-krotnie przy użyciu Mikrosepowych urządzeń odśrodkowych firmy Pall Life Sciences. Stężenia oczyszczonego IgG oznaczono mierząc absorbancję przy OD280.

test fagocytozy

zarówno ludzkie monocytowe komórki thp1, jak i myszy mφ surowe 264,7 komórki (ATCC, TIB-71) utrzymywano w 5% inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C66 przy przybliżonej gęstości 1 × 106 / ml. Około 0,8 × 106 komórek/ml surowych 264,5 komórek lub 1 × 106 komórek THP1 wysiewano na 6-studzienkową płytkę. Po 24 h inkubacji uaktywniono surowe 264,7 komórek przez leczenie 0,1 µg/ml lipopolisacharydu (LPS) przez 24 godziny. komórki Thp1 monocytów różnicowano przez 12-mirystynian 13-octanu Forbolu (PMA) (40 nM) przez 48 godzin. Aktywowane makrofagi barwiono Dio przy końcowej koncentracji 40 nM w pożywce przez 20 minut, a następnie trzykrotnie płukano pożywką. Komórki nowotworowe znakowano 1 µM DDAO (5 mM roztwór podstawowy w DMSO przechowywany w temperaturze -20 °C) w PBS w temperaturze 37 °C przez 15 minut i przemyto PBS zawierającym 1% FBS. Znakowane DDAO komórki docelowe (1 × 106) dodano do barwionych DIO Mφs i inkubowano w końcowej objętości 2 ml w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. po inkubacji mφs i komórki docelowe zebrano z trzykrotnym płukaniem EDTA-PBS, a następnie 0,25% trypsynizacją. Fagocytozę oceniano, oceniając podwójnie znakowane komórki (DIO+ / DDAO+), które reprezentują fagocytowane komórki raka piersi przez Dojrzałe Mφs, za pomocą cytometrii przepływowej. Do analizy wykorzystano oprogramowanie FlowJo.

test przeżycia Klonogennego

test przeżycia Klonogennego przeprowadzono po napromieniowaniu z leczeniem lub bez leczenia (lapatynib, 10 µM przez 72 godziny; przeciwciało anty-CD47 10 µg/ml przez noc). Leczone komórki hodowano przez 10-14 dni i utrwalano kolonie, barwione niebieską plamą Coomassie. Kolonie zawierające więcej niż 50 komórek liczono jako przetrwałe klony i znormalizowano do wydajności poszycia każdej linii komórek nowotworowych leczonych pozornie.

test szybkości wypełniania szczelin

pojemność wypełniania szczelin mierzono z 1 × 106 komórkami wyhodowanymi w każdej z 6-studzienkowych płytek do 100% zbiegu, a następnie z 24-godzinnym głodem komórkowym. Następnie szczelina została utworzona przez zeskrobanie naczynia po przekątnej sterylną końcówką pipety. Komórki pozostawały nieleczone lub traktowane 10 µg / ml przeciwciała IgG lub anty-CD47 w czasie trwania eksperymentu. Wydajność napełniania była monitorowana przez 72 godziny, a reprezentatywne zdjęcia wykonano w dniu 0 (dzień skrobania) i dniu 3.

powstawanie guzów

komórki przesiewano za pomocą Sitka komórkowego 40 µm (Nr katalogowy 352340. Corning) i jednokomórkowe zawiesiny wysiewano do płyt Petriego o niskiej przyczepności 60 mm o gęstości 1000 komórek / ml. Komórki hodowano w pozbawionym surowicy pożywce nabłonkowej sutka (MEBM), uzupełnionej B27 (Nr katalogowy 17504-044. Life Technology), 20 ng/ml EGF (Nr katalogowy 4022-500. Bio-vision), 20 ng / ml basic-FGF (Nr katalogowy 13256-029. Invitrogen) i 4 µg/ml heparyny (Nr katalogowy 80603-686 EMD MILLIPORE). Komórki hodowano przez 10 dni i zliczano guzy pod mikroskopem świetlnym.

Transwell invasion assay

Aliquots (0. 4 ml) Matrigel ( Nr katalogowy 356231. BD Biosciences) rozcieńczono w buforze powlekającym: 0,01 M Tris (pH 8,0), 0,7% NaCl do końcowego stężenia 200-300 µg / ml. Około 100 µl zostało załadowanych do górnej komory 24-studziennego transwella (Nr katalogowy 3422. Costar) i inkubowano w temperaturze 37 °C w celu żelowania około 1 godziny. Ostrożnie usunąć pozostały bufor powlekający z przepuszczalnej membrany nośnej bez naruszania Warstwy, a następnie dodać komórki (2,5 × 104/ml). Dolną komorę wypełniono 800 µl mediów MEM zawierających 5 µg/ml fibronektyny (Nr katalogowy SC-29011. Santa Cruz). Transwell z inaczej potraktowanymi komórkami inkubowano przez 48 godzin i zabarwiono zestawem Diff-Quick Stain (Nr katalogowy K7128. IMEB INC).

przygotowanie fragmentów F (ab’)2

cd47 fragmenty f (ab’)2 zostały wytworzone przez cięcie żywicy Papainowej IgG przy użyciu zestawu do przygotowania f (ab’)2 (Nr katalogowy 786272. G-Bioscience) zgodnie z zaleceniami producenta i zgłoszoną procedurą67. Po trawieniu papainy fragment Fab oddzielono od niestrawionych IgG i region Fc z kolumną spinową białka a z zestawu do fragmentacji Fab dostarczono kolumny odsalania SpinOUT GT-600, aby zapewnić, że początkowa próbka przeciwciała będzie optymalnym warunkiem fragmentacji Fab, a oczyszczoną IgG anty-mysi CD47 zebrano do leczenia nowotworu myszy in vivo.

promieniowanie komórek BC z CRISPR-KO CD47 i/lub HER2

do badania in vivo skuteczności hamowania nowotworu przez promieniowanie z niedoborem CD47 i statusem HER2, 5 × 105 komórek 4T1/C2 z CRISPR-knockout CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) lub double (CD47−/−/HER2−/−) wszczepiono do poduszek tłuszczowych piersi BALB/c (n = 105).6 na Grupę). Wzrost guza oceniano mierząc objętość guza co 2 dni, począwszy od dnia 7, aż objętość guza osiągnie ograniczenie. W celu oceny wrażliwości radiologicznej nowotworów o różnym statusie CD47 i HER2, miejscowe promieniowanie nowotworowe dostarczano z 5 Gy do każdego nowotworu w dniu 9, a wzrost guza mierzono co drugi dzień, aż guzy kontrolne osiągnęły maksymalne ograniczenie.

RT myszy BC z leczeniem anty-CD47 i/lub HER2

w przypadku testów in vivo hamowania nowotworu pojedynczym przeciwciałem CD47 w obecności lub bez radioterapii, leczenie anty-CD47 postępowało zgodnie z protokołem Willinghama i wsp.20 z pewnymi modyfikacjami. 8-tygodniowe samice myszy (BALB/c) o właściwościach immunologicznych (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) wstrzyknięto 1 × 105 komórek piersi 4T1 myszy do czwartego gruczołu sutkowego. Pięćdziesiąt mikrolitrów PBS zawierających 100 µg kontrolnych fragmentów IgG lub anty-CD47 F (ab’) wstrzyknięto do miejsca guza (dzień 1) lub do tkanek guza (dzień 15) i powtarzano co drugi dzień do końca eksperymentów. Objętość guza monitorowano co 5 dni. W przypadku leczenia promieniowaniem, anty-CD47 lub promieniowania w połączeniu z anty-CD47, zwierzęta z guzami 4T1 losowo podzielono na różne grupy leczenia i grupę kontrolną (5-10 myszy na Grupę). Miejscowe napromieniowanie guza rozpoczyna się, gdy objętość guza osiągnie 200 mm3 przy użyciu FIR (5 Gy/dzień/guz dla czterech frakcji przy użyciu źródła IR z mikro wiązką; całkowita dawka = 20 Gy) w połączeniu z trzykrotnym wstrzyknięciem guza anty-CD47 f (ab’). Wrażliwość radiologiczną guzów napromieniowanych in vivo z obecnością lub brakiem anty-CD47 F (ab’) oceniano mierząc objętość guza pod koniec eksperymentów. Zwierzęta poddano eutanazji, gdy guzy były ~1400 mm3 lub gdy zwierzęta wydawały się niewygodne, nawet gdy guz był mniejszy niż 1400 mm3, aby spełnić przepisy UCD IACUC dotyczące stosowania zwierząt kręgowych w badaniach. Protokół stosowania i opieki nad Zwierzętami w radioterapii in vivo został zatwierdzony przez Institutional Animal Use and Care Committee of the University of California Davis (IACUC 15315).

w testach in vivo hamowania nowotworu podwójnymi przeciwciałami CD47 i HER2 w obecności lub bez radioterapii, 8-tygodniowe samice myszy odpornościowych (BALB / c) (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) wstrzyknięto 1 × 105 komórek piersi 4T1 myszy do 4 gruczołów sutkowych. Gdy objętość guza osiągnęła około 200 mm3, myszy losowo podzielono na cztery grupy (po 6 myszy na Grupę). Fragmenty PBS, IgG, anty-CD47 F (ab’) (100 µg) lub Herceptin (5 mg/kg mc.) wstrzykiwano do tkanek Guza 4 godziny przed radioterapią miejscową (5 Gy dziennie przez 2 dni). Wykonywano zastrzyki i monitorowano rozmiary guza co drugi dzień do końca eksperymentów. Myszy uśmiercano, gdy guzy były ~1400 mm3 lub gdy zwierzęta wydawały się niewygodne, nawet gdy guz był mniejszy niż 1400 mm3, aby spełnić przepisy UCD IACUC dotyczące stosowania zwierząt kręgowych w badaniach. Protokół stosowania i opieki nad Zwierzętami w radioterapii in vivo został zatwierdzony przez Institutional Animal Use and Care Committee of the University of California Davis (IACUC 15315).

makrofagi naciekane guzem i fagocytoza makrofagów

mysi rak piersi z ekspresją GFP komórki 4T1 wszczepiono do 4.klocków tłuszczu sutkowego myszy BALB / c i leczenie rozpoczęto, gdy guzy osiągnęły około 200 mm3 przez wstrzyknięcie guza 50 µl PBS zawierającego 100 µg kontrolnego IgG, fragmentów anty-CD47 f (ab’), Herceptin lub obu przeciwciał co drugi dzień przez trzy razy. Miejscowa RT guza dostarczono w dniach 10 i 11 z 5 Gy / dzień / guz dla dwóch frakcji, dawka całkowita = 10 Gy, a eksperymenty zakończono 2 dni po zakończeniu leczenia przeciwciałami. Guzy ekstrahowano i sekcje FFPE przygotowywano do barwienia immunofluorescencyjnego zgodnie ze standardową procedurą: szkiełka deparaffinizowano i nawodniono, a antygeny pobierano przez 40 minut w buforze cytrynianowym (pH 6,1) w temperaturze 95 °C. Aby usunąć autofluorescencję, szkiełka wkładano do roztworu de-autofluorescencyjnego (0,5 m CuSO4, 0,05 M NH4COOH w H2O) w RT przez 48 godzin, płukano wodą 5 min 3 razy, a następnie blokowano 1:100 końskich serum. Pierwotną inkubację przeciwciał przeprowadzono w temperaturze 4 °C przez noc: anty-GFP (1:100; DAKO), anty-CD11b (1:100; Millipore); Po umyciu szkiełka inkubowano z wtórnymi przeciwciałami sprzężonymi z rozcieńczonymi fluorescencyjnymi przeciwciałami sprzężonymi w stosunku 1:250 (Rodamina dla CD11b, Alexa Fluor 488 dla GFP) w RT przez 1 godzinę, a następnie zamontowano w roztworze Przeciwfadowym vectashield zawierającym DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Fagocytozę za pośrednictwem makrofagów wykryto mikroskopią fluorescencyjną przy użyciu oprogramowania Axiovision (Zeiss, Niemcy), a mikrofotografy oznaczono ilościowo za pomocą ImageJ.

Analiza statystyczna

wszystkie dane doświadczalne uzyskane z badań komórkowych in vitro i testów na zwierzętach są przedstawione jako średnia ± SE, analizowana przy użyciu dwuogonowego Studenckiego testu T dla dwóch grup lub ANOVA dla wielu grup. Istotność statystyczną krzywych przeżycia Kaplana-Meiera oceniano za pomocą testu Manna-Whitneya. Liczba niezależnych eksperymentów i replik zostały wskazane w legendach rysunku. Wartości P < 0, 05 zostały uznane za istotne i oznaczone gwiazdkami w następujący sposób: *p < 0.05, **P < 0.01, ***p < 0.001, ****P < 0.0001.

Podsumowanie Raportu

Więcej informacji na temat projektu badawczego można znaleźć w podsumowaniu raportu Przyrodniczego połączonym z tym artykułem.