różne zespoły motywów określają niewymiarowe czynności wiązania DNA członków rodziny AP-1 w makrofagach

analizy statystyczne

na Fig. 1C, różnice w ekspresji genów testowano stosując niezależny test T (stopień swobody = 1, dwuogonowy) na dwóch eksperymentach replikacyjnych (n = 2). Geny o różnej ekspresji na Fig. 1b zostały zidentyfikowane przy użyciu EdgeR55 z domyślnymi parametrami i przy użyciu odcięcia FDR < 0.05 i zmiana Log2 krotnie ≥2. Na Rys. 2C, różnice między każdą grupą (Veh, Shared i KLA 1 h) zbadano za pomocą niezależnego testu T (stopień swobody = 1, dwuogonowy); liczba loci w każdej grupie dla każdego monomeru jest następująca: ATF3 (Veh = 1447, Shared = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), Jun (1351, 5976, 6422). Znaczenie dla motywów na Rys. 4a obliczono za pomocą testu współczynnika prawdopodobieństwa (stopień swobody = 1), porównując przewidywania wykonane przez pełny model TBA i zaburzony model TBA dla wszystkich loci związanych w makrofagach leczonych Veh dla Atf3 (n = 23,160), Jun (N = 15,548) i Jun (N = 19,653). Znaczenie dla motywów na Rys. uzupełniającym 4C obliczono za pomocą testu współczynnika prawdopodobieństwa (stopień swobody = 1), porównując prognozy wykonane przez pełny model TBA i wzburzony model TBA w wszystkich loci związanych przez JunD w GM12878 (n = 7451), H1-hESC (n = 12,931), HepG2 (n = 41,318), K562 (n = 47,477) i SK-N-SH (38,960). Znaczenie dla motywów na Rys. 5b, dodatkowe rys. 5B i dodatkowe rys. 5C obliczono za pomocą testu współczynnika prawdopodobieństwa (stopień swobody = 1), porównując przewidywania wykonane przez pełny model TBA i model TBA na wszystkich loci związanych w makrofagach leczonych KLA dla Atf3 (n = 36,745), Jun (N = 17,481), Jun (N = 31,641), Fos (n = 24,365), Fosl2 (n = 10,619) i JunB (N = 13,376). Wartości istotności dla rys. 6f i S6F obliczono za pomocą testu F; liczba loci analizowanych dla monomerów w makrofagach leczonych nośnikiem to ATF3 (n = 4163), Jun (N = 3004) i JunD (n = 4148); liczba loci analizowanych dla monomerów w makrofagach leczonych KLA to: Atf3 (n = 4577), Jun (N = 3232), JunD (n = 4366), Fos (n = 4477) i JunB (N = 3616).

generowanie niestandardowego genomu dla BALB/CJ

Niestandardowy Genom dla BALB / CJ poprzez zastąpienie niezmiennych pozycji genomu mm10 allelami zgłoszonymi przez Mouse Genomes Project (wersja 3 plik VCF)43. Dla C57BL / 6J użyto referencyjnego genomu mm10 z przeglądarki UCSC genome browser. Aby umożliwić porównanie między BALB/CJ i C57BL/6J podczas analizy, współrzędne niestandardowego genomu BALB / CJ zostały przesunięte w celu dopasowania do pozycji referencyjnego genomu mm10 przy użyciu MARGE34. Nie analizowaliśmy żadnych odczytów, które mieściły się w delecjach w BALB/cJ. Odczyty, które nakładały się z wstawianiem, zostały przypisane do ostatniej nakładającej się pozycji w odkształceniu odniesienia.

Analiza pików ChIP-seq

odczyty sekwencjonowania z eksperymentów ChIP-seq zostały zmapowane do montażu mm10 mysich genomów referencyjnych (lub niestandardowego genomu BALBc / J) przy użyciu najnowszej wersji Bowtie2 z domyślnymi parametrami 56. Zmapowany ChIP-seq odczytuje w celu zidentyfikowania domniemanych miejsc wiązania TF za pomocą polecenia HOMER57 findPeaks (z parametrami-Rozmiar 200-L 0-C 0-fdr 0.9), przy użyciu wejściowego eksperymentu Chipowego odpowiadającego warunkowi leczenia. Aby zmniejszyć liczbę pików fałszywie dodatnich, obliczyliśmy IDR dla każdego piku (używając wersji 2.0.3 programu idr) z wynikiem piku Homera obliczonym dla każdego eksperymentu replikacyjnego jako wejście do IDR, a następnie przefiltrowano wszystkie piki, które miały IDR ≥ 0,0558. Motywy De novo zostały obliczone z Homerem findMotifsGenome.pl polecenie z domyślnymi parametrami. Wzbogacenie motywów de novo obliczono za pomocą findKnownMotifs.pl program w Homerze z domyślnymi parametrami.

kwantyfikacja odczytów ekspresji RNA wygenerowanych z eksperymentów RNA-seq została dostosowana do referencyjnego genomu myszy mm10 (lub niestandardowego genomu BALBc / J) przy użyciu alignera gwiazdowego z domyślnymi parametrami59. Aby określić poziom ekspresji każdego genu, obliczyliśmy RPKM z odczytami, które znajdowały się w eksonie. Unormalizowane odczyty sekwencjonowania zostały wykorzystane do identyfikacji genów różnicowo ekspresji z EdgeR55; uznaliśmy geny z FDR < 0,05 i zmiana ekspresji między dwoma warunkami eksperymentalnymi dwa razy lub więcej różnicowo ekspresji. Aby obliczyć ekspresję powstających RNA, przypisaliśmy nasze piki ChIP-seq liczbą odczytów GRO-seq (znormalizowanych do 10 milionów), które znajdowały się w granicach 500 bps od centrum piku, używając Homera annotatePeaks.pl dowództwo.

szkolenie z modelu TBA

dla każdego monomeru AP-1 w każdym stanie leczenia wytrenowaliśmy model, aby odróżnić miejsca wiązania dla każdego monomeru od zestawu losowo wybranych loci genomowych. Zestaw losowych loci tła używanych do szkolenia każdego modelu został wybrany zgodnie z następującymi kryteriami: (1) rozkład zawartości GC loci tła odpowiada zawartości GC miejsc wiążących dla danego monomeru, (2) nie zawierają niejednoznacznych lub niemożliwych do zidentyfikowania pozycji oraz (3) Liczba sekwencji tła odpowiada liczbie miejsc wiążących K. Dla każdej z sekwencji w połączonym zestawie miejsc wiązania i loci tła obliczyliśmy najwyższy wynik log-odds (zwany także wynikiem motif) dla każdego z N motywów, które zostaną uwzględnione w modelu60 dopasowania motywów w obu orientacjach zostały uwzględnione. Log-wyniki kursów mniejsze niż 0 zostały ustawione na 0. Zgodnie ze standardowymi procedurami wstępnego przetwarzania przed szkoleniem modelu liniowego ustandaryzowaliśmy wyniki kursów logarytmicznych dla każdego motywu, skalując zestaw wyników dla każdego motywu tak, aby Średnia wartość wynosiła 0, a wariancja 1. Standaryzacja skaluje wyniki dla wszystkich motywów do tego samego zakresu (dłuższe motywy mają większy maksymalny wynik), a także pomaga zmniejszyć wpływ multi-collinearity na model treningowy. I tak, Funkcje Używane do treningu naszego modelu jest macierzą N na 2K wyników log-odds standaryzowanych w każdym wierszu. Aby wygenerować odpowiednią tablicę etykiet, przypisaliśmy każdej witrynie wiążącej Etykietę 1, A każdej lokalizacji tła Etykietę 0. Korzystając z tej macierzy funkcji i tablicy etykiet, trenowaliśmy wagi dla każdego motywu za pomocą modelu regresji logistycznej L1, zaimplementowanego przez pakiet scikit-learn Python 61. Wagi Motif przedstawione w naszej analizie są średnimi wartościami w pięciu rundach weryfikacji krzyżowej, wykorzystując 80% danych do treningu i 20% do testów w każdej rundzie. Modele zostały przeszkolone dla chip-SEQ wygenerowanych w tym badaniu, jak również dane pobrane z NCBI Gene Expression Omnibus (numer akcesyjny GSE46494) i encode data portal (https://www.encodeproject.org).

Quantification of multiple collinearity

aby ocenić stopień multi-collinearity w cechach score motif, których użyliśmy do szkolenia naszych modeli, wzięliśmy każdą macierz cech odpowiadającą każdemu doświadczeniu i obliczyliśmy VIF dla każdego motif38. Aby obliczyć VIF, najpierw określamy współczynnik determinacji, R2, dla każdego motywu, regresując wyniki log-odds dla jednego motywu z wynikami log-odds dla pozostałych motywów. Następnie stosując współczynnik determinacji, tolerancję dla każdego motywu można obliczyć jako różnicę między 1 A współczynnikiem determinacji (1 − R2). VIF jest odwrotnością tolerancji \(\frac{1}{{1-R^2}}\). Użyliśmy modułu linear_model pakietu skleparn Python do obliczenia współczynnika determinacji.

grupowanie i łączenie motywów

oceniliśmy podobieństwo wszystkich par motywów sekwencji DNA, obliczając korelację Pearsona z wyrównanymi macierzami prawdopodobieństwa położenia (ppm) odpowiadającymi danej parze motywów62. Korelacja Pearsona dla pary motywów A i B o długości i jest obliczana za pomocą wzoru:

ppm zostały najpierw wyrównane za pomocą algorytmu wyrównania Smith–Waterman63. Krótsze motywy są wyściełane wartościami częstotliwości tła przed wyrównaniem. Luki w wyrównaniu nie były dozwolone, a każda pozycja w wyrównaniu była punktowana z korelacją Pearsona. Korelacja Pearsona została następnie obliczona przy użyciu optymalnego wyrównania. Następnie zestawy motywów, które mają ppm z korelacją Pearsona 0,9 lub większą, zostały połączone przez iteracyjne wyrównanie każdego PPM w zbiorze, a następnie uśrednianie częstotliwości nukleotydów w każdej pozycji.

ocena istotności motywów dla TBA

wartości p dla TBA obliczono za pomocą testu współczynnika prawdopodobieństwa logarytmicznego. Każdy motyw został usunięty z zestawu cech użytych do wytrenowania modelu TBA (przy użyciu pięciokrotnej weryfikacji krzyżowej). Następnie wykorzystaliśmy model pełny (zawierający wszystkie motywy) i model perturbed, aby obliczyć prawdopodobieństwo zaobserwowania wiązania na wszystkich miejscach wiązania i sekwencjach tła dla danego monomeru i wszystkich regionów tła. Następnie do wykonania testu chi-kwadrat dla każdego motywu wykorzystano różnicę prawdopodobieństwa obliczoną przez model pełny i model perturbowany. Test chi-squared został przeprowadzony przy użyciu pakietu python scipy 64.

porównanie z innymi metodami

BaMM motif i gkm-SVM były uruchamiane z domyślnymi parametrami. Użyliśmy najnowszej wersji większej skali gkm-SVM, LS-GKM (skompilowany z kodu źródłowego pobranego z https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm na 8/25/16) i BaMM motif; v1.0 pobrany z https://github.com/soedinglab/BaMMmotif39, 65. Oba modele zostały przeszkolone przy użyciu pięciokrotnej weryfikacji krzyżowej. Wydajność modelu została oceniona za pomocą funkcji roc_auc_score i precision_score z modułu metrics w sklepie.

przewidywanie zmian wiązania AP-1 po jednogodzinnym leczeniu KLA

aby przewidzieć zmianę wiązania po leczeniu Kla, wykorzystaliśmy wagi motywu wyuczone dla każdego z motywów N (wn) przez model TBA przeszkolony na danych traktowanych przez pojazd (Wveh = ) i model TBA przeszkolony na danych traktowanych przez 1-h KLA (Wkla = ) dla każdego monomeru AP-1. Przewidywana zmiana wiązania dla każdej sekwencji jest wówczas różnicą między iloczynem punktowym znormalizowanej punktacji motywu obliczonej dla sekwencji każdego z miejsc wiązania k (Sk=) z ciężarami motywu Kla i iloczynem punktowym punktacji motywu i ciężarami motywu Veh (Δkla-veh, k = Wkla⋅Sk-Wveh⋅Sk). Przewidywania zostały wykonane dla wszystkich loci genomowych, które przecinają się z pikiem dla jednego z monomerów AP-1 w warunkach leczenia nośnika lub Kla.

Przewidywanie wiązania specyficznego dla szczepu za pomocą TBA

aby przewidzieć Wiązanie specyficzne dla szczepu, wykorzystaliśmy wagę motywu wyuczoną dla każdego z N motywów (wn) za pomocą modelu TBA (W = ) dla każdego monomeru AP-1 przy użyciu danych C57BL/6J oraz wyniki motywu obliczone dla każdego z miejsc wiązania k za pomocą sekwencji genomowej dla C57BL/6J i BALBc / J (SC57, k=, SBAL , k = ). Następnie obliczyliśmy różnicę punktów motywu dla C57BL6 / J i BALBc/J (DN=), a następnie standaryzowaliśmy różnice punktowe dla każdego motywu we wszystkich miejscach wiązania K, które miały mutację, porównując BALBc/J Z C57BL/6J, dając znormalizowane różnice punktowe motywu dla każdego miejsca wiązania (Zn = standaryzuj(DN) = ). Na koniec, wykonaliśmy predykcję wiązania specyficznego dla szczepu, obliczając iloczyn punktowy masy motywu i znormalizowaną różnicę punktów motywu między C57BL6 / EiJ i BALBc / J Dla zmutowanego miejsca wiązania KTH (ΔC57−BAL = w⋅).

TBA-2strain model training

dla każdego genomowego loci, które przecięły się ze szczytem dla jednego z monomerów AP-1, w C57BL/6j lub BALBc / J, obliczyliśmy najwyższy wynik log-odds dla każdego z N motywów, które zostaną uwzględnione w modelu,wykorzystując sekwencję genomową obu szczepów , dając dwa zestawy punktów motywu dla każdego z miejsc wiązania K (SC57,k=, SBAL, k = ). Rozważano dopasowanie motywów w obu orientacjach. Log-wyniki kursów mniejsze niż 0 zostały ustawione na 0. Korzystając z punktów motif, obliczamy standaryzowaną różnicę punktów motif dla dwóch szczepów, jak opisano w powyższej sekcji (Zn = ). Tak więc, funkcje używane do treningu naszego modelu to macierz N na k wyników log-odds standaryzowanych w każdym wierszu. Następnie obliczyliśmy log2 krotność liczby odczytów ChIP-seq w C57BL / 6j w porównaniu do BALBc / J, aby określić stopień wiązania specyficznego dla szczepu. Korzystając z tej macierzy funkcji i ustawiając log2 krotnie stosunek wiązania między dwoma szczepami jako zmienną zależną, wytrenowaliśmy wagi dla każdego motywu za pomocą regresji liniowej zaimplementowanej przez pakiet scikit-learn Python. Wagi Motif przedstawione w naszej analizie są średnimi wartościami w pięciu rundach weryfikacji krzyżowej, wykorzystując 80% danych do treningu i 20% do testów w każdej rundzie. Przewidywania dotyczące wiązania specyficznego dla szczepu mogą być dokonywane przy użyciu obliczonych wag zgodnie z procedurą opisaną w poprzednim rozdziale.

Chip protocol

białko a i G Dynabeads 50/50 mix firmy Invitrogen są pozwane za ChIP (10001D, 10003D). Mieszanina IP składa się z 20 µL koralików/2 µg przeciwciała na 2 miliony komórek. Przeciwciała przeciwko członkom rodziny AP-1 zostały wybrane do celowania w nie konserwowane regiony, aby zminimalizować możliwość niespecyficznego wiązania. Przeciwciała są wymienione w dodatkowej Tabeli 3. W celu przygotowania koraliki przemyto 2× 0,5% BSA–PBS, a następnie koraliki–przeciwciało inkubowano z 0,5% BSA–PBS przez co najmniej 1 godzinę na rotatorze (4 °C). Umyć 2× z 0.5% BSA–PBS, następnie zawieszono w buforze rozcieńczającym (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1× inhibitory proteazy). Podwójne sieciowanie dla Chipa: Media dekantowano z komórek w 10-centymetrowych płytkach, przemyto raz krótko PBS (RT). Glutaran disukcynimidylu (Pierce Cat # 20593) (rozcieńczony w DMSO przy 200 mM)/PBS (RT) stosowano przez 10 minut. Następnie dodano formaldehyd do końcowego stężenia 1% przez dodatkowe 10 minut. Reakcję hartowano 1: 10 1 m tris pH 7,4 na lodzie. Komórki zebrano i przemyto dwukrotnie zimnym PBS, wirując w temperaturze 1000 × g przez 5 minut. Izolacja jąder i sonikacja: wymieszać granulki komórek w 1 mL buforu izolacyjnego jąder (50 mm Tris-pH 8,0, 60 mM KCl, 0,5% NP40) + PI i inkubować na lodzie przez 10 minut. Odwirować 2000 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. wymieszać jądra w 200 µL świeżego buforu lizy (0,5% SDS, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 50 mM Tris–HCl (pH 8)) + PI. Sonikacja: Jądra następnie sonikowano (10 milionów komórek) przez 25 minut w Biorupterze ( ustawienia = 30 s = On, 30 s = Off, Medium) za pomocą cienkościennych rurek (Diagenode Cat # C30010010). Po sonikacji wirować maksymalną prędkość przez 10 minut w 4 °C. Chip ustawić: Sonikowany DNA rozcieńczono 5× buforem rozcieńczającym 800 (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1 × inhibitory proteazy). Dla próbek Wejściowych (5%) usuwa się aliquot. Próbki włączone w temperaturze 4 °C podczas obracania. Mycie: ChIP myje się 1× z TSE i (20 mM Tris–HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA), 2× z TSE III (10 mM Tris–HCl pH 7,4, 250 mM LiCl, 1% IGEPAL, 1% deoksycholan, 1 mm EDTA), 1× Z TE + 0,1% Triton X-100, przenieść do nowej rury, a następnie umyć inny czas z te + 0,1% Triton X-100. Elucja: Eluować 200 µL buforu elucyjnego (1% SDS, 10 mM tris pH 7,5) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, wytrząsając wirem lub nutatorem lub rotatorem. Odsieciowanie: dodać 10 µL 5 M NaCl i inkubować w temperaturze 65 °C (lub co najmniej 8 h). Oczyść próbki za pomocą Zymo ChIP DNA Clean i koncentratora. Eluować w 100 µL. Weź 40 µL i przejdź do protokołu przygotowania biblioteki.

izolacja i fragmentacja RNA PolyA

izolacja RNA: RNA wyizolowano przy użyciu odczynnika TRIZOLOWEGO (Ambion Nr kat. 15596018) i zestawu mini-prep RNA DIRECT-ZOL (Nr kat. 11-330MB). Izolacja RNA Poli-A: stosować 0.2 całkowity RNA jako materiał wyjściowy dla idealnej wydajności mapowania i minimalnej klonalności. Zebrać 10 µL kulek oligo (DT) (NEB cat# s1419s) na próbkę RNA. Koraliki przemyto dwukrotnie 1 × DTBB( 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 m LiCl, 2 mM EDTA, 1% LDS, 0,1% Triton X-100). Koraliki zawieszono w 50 µL 2 × DTBB. 50 µL koralików zmieszano z 50 µL RNA i ogrzewano do 65 °C przez 2 minuty. Następnie inkubowano kulki RNA przez 10 minut w RT podczas obracania. Koraliki RNA zebrano następnie na magnesie i przemyto 1× każdy RNA WB1 (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,12 m LiCl, 1 mm EDTA, 0,1% LDS, 0.1% Triton X-100) i WB3 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,5 m LiCl, 1 mM EDTA). Dodać 50 µL Tris–HCl pH 7,5 i podgrzać do 80 °C przez 2 minuty, aby wymyć. Zbierz RNA i wykonaj drugą kolekcję koralików Oligo-dT. Po umyciu drugiej kolekcji zamiast eluować był 1× z 1× buforem pierwszej nici; 250 mM Tris–HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCL2 (ThermoFisher ssiii kit Nr kat. 18080093). Fragmentacja: następnie dodać 10 µL buforu 2× pierwszej nici plus 10 mM DTT i fragmentować DNA w temperaturze 94 °C przez 9 minut. Zbierz kulki na magnesie i przenieś eluat zawierający rozdrobnione mRNA do nowego paska PCR. Powinien odzyskać 10 µL rozdrobnionego RNA. Synteza pierwszej nici: zmieszaliśmy fragmentaryczny RNA z 0,5 µL startera losowego (3 µg/µL) Life Tech #48190-011, 0,5 µL oligo-dT (50 µM z zestawu SSIII), 1 µL dNTPs (10 mM Life Tech, cat 18427088) i 0,5 µL SUPERase-In (ThermoFisher Nr kat. Natychmiast umieścić na lodzie. Następnie dodaliśmy 5,8 µL ddH2O, 0,1 µL aktynomycyny (2 µg/µL Sigma cat # A1410), 1 µL DTT (100 mM Life Tech cat# p2325), 0,2 µL 1% Tween i 0,5 µL indeksu górnego III i inkubowaliśmy w temperaturze 25 °C przez 10 minut, a następnie 50 °C przez 50 minut. Bead clean up: Dodaliśmy 36 µL RNACLEAN XP (Ampure XP) i zmieszaliśmy, inkubując przez 15 minut na lodzie. Następnie koraliki zebrano na magnesie i przemyto 2× 75% etanolem. Następnie kulki suszy się na powietrzu przez 10 minut i eluuje 10 µL wolnej od nukleazy H2O. synteza drugiej nici. 10 µL cDNA/RNA zmieszano z 1,5 µL 10× Blue Buffer (Enzymatics cat# B0110L), 1 µL dUTP/dNTP mix (10 mM Affymetrix cat# 77330), 0,1 µL dUTP (100 mM Affymetrix cat# 77206), 0,2 µL RNase H (5 U/µL Enzymatics cat# Y9220L), 1 µL polimerazy DNA i (10 U/µl enzymatics Cat#p7050l), 0,15 µl 1% Tween-20 i 1.05 µL wody wolnej od nukleazy. Reakcję inkubowano w temperaturze 16 °C przez 2,5 h. oczyszczanie koralików: DNA oczyszczano przez dodanie 1 µL Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) na reakcję w 28 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% stężenie końcowe) i inkubowano w RT przez 10 minut. Następnie koraliki zebrano na magnesie i przemyto 2× 80% etanolem. Kulki suszono na powietrzu przez 10 minut i eluowano w 40 µL wody wolnej od nukleaz. DNA jest gotowe do przygotowania biblioteki.

protokół przygotowania Biblioteki

dsDNA End repair: zmieszaliśmy 40 µL DNA z protokołów ChIP lub RNA z 2,9 µL H2O, 0.5 µL 1% Tween-20, 5 µL buforu ligazy 10× T4 (Enzymatics cat# L6030-HC-L), 1 µL mieszanki dNTP (10 mM Affymetrix 77119), 0,3 µL T4 DNA pol (Enzymatics P7080L), 0,3 µL T4 PNK (Enzymatics Y9040L), 0,06 µL Klenow (Enzymatics P7060L) i inkubowano do 30 minut w 20 °C. Dodano 1 µl speedbeads seradyn 3 EDAC (Thermo 6515-2105-050250) w 93 µl 20% Peg8000/2,5 m NaCl (13% końcowy) i inkubowano przez 10 minut. Czyszczenie koralików: koraliki zebrano na magnesie i przemyto 2× 80% etanolem. Koraliki suszono na powietrzu przez 10 minut, a następnie eluowano w 15 µL Ddh2o. dA-Tailing. DNA zmieszano z 10.8 µL ddH2O, 0,3 µL 1% Tween-20, 3 µL buforu niebieskiego (Enzymatics cat# b0110l), 0,6 µL dATP (10 mM Tech 10216-018), 0,3 µL Klenow 3-5 Exo (Enzymatics P7010-LC-L) i inkubowano przez 30 minut w 37 °C. 55,8 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% końcowy) dodano inkubację przez 10 min. Następnie oczyszczanie koralików zostało zrobione. Koraliki eluowano w 14 µL. Podwiązanie adaptera w kształcie litery Y. Próbkę zmieszano z 0,5 µL adaptera kodów kreskowych BIOO (BIOO Scientific cat # 514104), 15 µL buforu szybkiego ligacji (Enzymatics cat@ l603-LC-L), 0,33 µL 1% Tween-20 i 0.5 µL ligazy DNA T4 HC (Enzymatyki L6030-HC-L) i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. dodano 7 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl i inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej. oczyszczono koraliki i wymyto koraliki w 21 µL. 10 µL wykorzystano następnie do amplifikacji PCR (14 cykli) za pomocą starterów IgA i IGB (AATGATACGGCACCCGA, CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

Gro-seq

rodząca się transkrypcja została przechwycona przez globalne sekwencjonowanie jądrowe (Gro-seq). Jądra wyizolowano z Tgem za pomocą lizy hipotonicznej (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 3 mM CaCl2; 0.1% IGEPAL CA-630) i flash zamrożone w buforze Gro-zamrażającym (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 5 mM MgCL2, 40% glicerolu). Run-on. Jądra 3-5 × 106 BMDM były uruchamiane z NTPs znakowanymi BrUTP z buforem 3× NRO (15 mM Tris-CL (pH 8,0), 7,5 mM MgCl2, 1,5 mM DTT, 450 mM KCl, 0,3 U/µL Superazy w, 1,5% Sarkozylu, 366 µM ATP, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) i 1,2 µM CTP (Roche, aby ograniczyć run–długości do ~40 nukleotydów)). Reakcje wstrzymano po 5 minutach przez dodanie 500 µL odczynnika Trizol LS (Invitrogen), wir przez 5 minut i RNA wyekstrahowano i wytrącono zgodnie z opisem producenta. Granulki RNA zawieszono w 18 µL Ddh2o + 0,05% Tween (dH2O + t) i mieszance rozdrobnienia 2 µL (100 mMZnCL2, 10 mM Tris–HCl (pH 7,5)), a następnie inkubowano w temperaturze 70 °C przez 15 minut. Fragmentację przerwano przez dodanie 2,5 µL 100 mM EDTA. Wzbogacanie BrdU. Wzbogacanie BrdU przeprowadzono stosując przeciwciało BrdU (IIB5)i koraliki AC (Santa Cruz, sc-32323 AC, lot #a0215 i #c1716). Perełki przemyto raz buforem wiążącym GRO (0,25× roztwór soli fizjologiczno-sodowo-fosforanowy-bufor EDTA (SSPE), 0,05% (obj./obj.) Tween, 37,5 mM NaCl, 1 mM EDTA) + 300 mM NaCl, a następnie trzy płukania w buforze wiążącym GRO i zawieszono jako zawiesinę 25% (obj./obj.) z Superazą 0,1 U/µL. Do fragmentacji RNA dodano 50 µL zimnego buforu wiążącego GRO i 40 µL zrównoważonych kulek przeciwciała BrdU i próbki powoli obracano w temperaturze 4 ° C przez 80 minut. Koraliki następnie obracano w dół w temperaturze 1000 × g przez 15 s, usuwano supernatant, a koraliki przenoszono do kolumny Millipore Ultrafree MC (UFC30HVNB; Millipore) w 2 × 200 µL buforu wiążącego GRO. Reakcję IP przemyto dwukrotnie buforem wiążącym GRO o pojemności 400 µL, a następnie eluowano RNA przez inkubację w 200 µL TRIZOLU LS (Termofisher) pod delikatnym mieszaniem przez 3 minuty. Elucję powtórzono po raz drugi, dodano 120 µL dH2O + t w celu zwiększenia supernatantu i ekstrahowano zgodnie z opisem producenta. End repair and decapping: w celu End-repair and decapping, granulki RNA rozpuszczono w 8 µL TET (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) przez intensywne wir, podgrzewano do 70 °C przez 2 minuty i umieszczano na lodzie. Po szybkim zakręceniu dodano 22 µL Repair master mix (3 µL buforu 10× PNK, 15,5 µL dH2O + t, 0,5 µL Superazy w inhibitorze RNazy (10 U), 2 µL PNK (20U), 1 µL RppH (5U)), zmieszano i inkubowano w 37 °C przez 1 godzinę. 37 °C (wysokie stężenie ATP gasi aktywność rpph). Po zakończeniu naprawy dodano 2,5 µL 50 mM EDTA, reakcje zmieszano, a następnie ogrzano do 70 °C przez 2 minuty przed umieszczeniem na lodzie. Drugie wzbogacenie BrdU zostało przeprowadzone w sposób opisany powyżej. Granulki RNA rozpuszczono w 2,75 µL Tet + 0,25 µL Illumina TruSeq 3 ’ Adapter (10 µM), ogrzano do 70 °C przez 2 minuty i umieszczano na lodzie. 7 mieszaniny 3 ’ Master (4,75 µL 50% PEG8000, 1 µL buforu ligazy RNA 10× T4, 0,25 µL Superazy, 1 µL obciętej ligazy RNA T4 2 (200U; NEB)) dodano, dobrze wymieszano i reakcje inkubowano w 20 °C przez 1 godzinę. reakcje rozcieńczono przez dodanie 10 µL TET + 2 µL 50 mM EDTA, ogrzano do 70 ° C przez 2 minuty, umieszczono na lodzie i trzecią rundę przeprowadzono brutta. Granulki RNA przeniesiono do pasków PCR podczas przemywania i suszenia 75% etanolem. Próbki rozpuszczono w 4 µL Tet (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) + 1 µL 10 µM startera odwrotnej transkrypcji (RT). W celu wyżarzania Rtprimeru mieszaninę inkubowano w temperaturze 75 °C przez 5 minut, 37 °C przez 15 minut i 25 °C przez 10 minut. Do ligacji adaptera 5′ Illumina TruSeq, 10 µL mieszanki 5 'Master (1,5 µL dH2O + 0,2% Tween 20, 0,25 µL denaturatowanego adaptera 5′ Truseq (10 µM), 1,5 µL buforu ligazy RNA 10× T4, 0,25 µL Superazy, 0,2 µL 10 mM ATP, 5,8 µL 50% PEG8000, 0,5 µL ligazy RNA T4 1 (5U; NEB)) dodano i reakcje inkubowano w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę. Odwrotną transkrypcję przeprowadzono przy użyciu Protoscript II (NEB) (4 µL buforu 5× Neb FirstStrand (NEB; E7421AA), 0,25 µL Superazy, 0,75 µL Protoscript II (150u; NEB)) w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę. po dodaniu 30 µL PCR master mix (25 µL 2× LongAmp Taq 2× Master Mix (NEB), 0,2 µL 100 µM podkładu do przodu, 2,8 µL 5 m betainy i 2 µl 10 µm indywidualnego podkładu do kodów kreskowych), mieszaniny Amplifikowano (95 °C przez 3 min, (95 °C przez 60 S, 62 °C przez 30 S, 72 °C przez 15 S) X13, 72 °C przez 3 min). Reakcje PCR oczyszczono stosując 1,5 objętości SpeedBeads (GE Healthcare) w 2,5 M NaCl/20% PEG8000. Biblioteki zostały dobrane na żel PAGE/TBE do 160-225 par zasad. Plastry żelu rozdrobniono przez przędzenie przez perforowaną rurkę PCR o pojemności 0,5 mL umieszczoną na górze rurki o pojemności 1,5 mL. Dodano 150 µL żelu EB (0,1% LDS, 1 m LiCl, 10 mM Tris–HCl (pH 7,8)) i zawiesinę inkubowano pod wpływem mieszania przez noc. W celu oczyszczenia eluowanego DNA dodano 700 µL buforu wiążącego z Zymogen Chip DNA do probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej rozdrobniony plasterek żelu i żel EB, zmieszano przez pipetowanie i zawiesinę przeniesiono do kolumny ZymoMiniElute. Próbki najpierw obracano w temperaturze 1000 × g przez 3 minuty, a następnie 10 000×g przez 30 s. Usunięto przepływ, a próbki przemyto 200 µl zmywacza Zymo (EtOH). Pozostałości żelu usunięto przez flicking i kolumny przemyto przez dodanie innego 200 µL zmywacza Zymo (z EtOH). Usunięto przepływ, kolumny osuszono przez odwirowanie w temperaturze 14 000 × g przez 1 min i wymyto DNA przez dodanie 20 µL wstępnie rozgrzanego sekwencjonowania Tet (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20). Uporządkowano biblioteki.

komórki Western blotting

lizowano buforem do lizy Igepalu (50 mM tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0.5% Igepal) i stężenia białek oznaczano za pomocą odczynnika do oznaczania białek BioRad, stosując standardowo BSA. Białka rozdzielano na żel gradientowy Bis–Tris o stężeniu 4-12% (Invitrogen) i przenoszono na błonę nitrocelulozową (Amersham). Błony były blokowane w TBS z 0,1% Tween-20 i 5% BSA. Błona była zamazana wskazanym pierwotnym przez noc w temperaturze 4 °C. przeciwciała wtórne sprzężone z peroksydazą chrzanu wykryto za pomocą ECL plus western blotting detection system (Amersham).

zwierzęta i hodowle komórkowe

tgem zebrano 3 dni po wstrzyknięciu od samców 8-tygodniowych myszy C57BL/6J lub BALB / CJ i pokryto 20 × 106 komórek na 15 cm szalkę Petriego w DMEM plus 10% FBS i 1× penicylinę–streptomycynę. Jeden dzień po poszyciu komórki uzupełniono świeżymi mediami i potraktowano PBS (Veh) lub 100 ng/mL KLA przez 1 godzinę, a następnie bezpośrednio wykorzystano do dalszych analiz. iBMDM powstają w wyniku zakażenia BMDM retrowirusem zawierającym myc i Braf V600E66. Uwiecznione komórki są następnie wyrastane przez kilka tygodni. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi określonymi przez University of California, San Diego Institutional Annual Care and Use Committee (Iucac).

lentivirus production

pLentiguide został zmodyfikowany tak, aby zawierał rusztowanie U6-bsmbi-spgRNA i promotor CMV napędzający tagBFP2. 2 prowadnice CRISPR wstawiono dla każdego celu poprzez amplifikację PCR z promotorem H1 (bsmbi site/guide1/scaffold/H1 promotor/Guide 2/bsmb1 site) W sumie 2 prowadnice na wirusa (napędzane przez U6 i H1) (tabela uzupełniająca 4). Wirus powstał przy użyciu systemu pVSVg / ppAX2. Dwa dni po transfekcji pożywkę zebrano i odwirowano w temperaturze 4 °C przez 2 godziny w temperaturze 20 000 × g. osad komórkowy odtworzono przez noc w temperaturze 4 °C w OPTI-MEM i przechowywano w temperaturze -80 °C.

wytwarzanie CRISPR ko iBMDMs

ko iBMDMs wytworzono przy użyciu zakażenia lentiwirusowego. iBMDM-CAS9-IRES-EGFP zakażono MOI 100, mierzonym na komórkach 293t, soczewicą (OZ biosciences) (5 µL każdego odczynnika) w OPTI-MEM. Następnie wirowano w temperaturze 1300 g przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usunięto pożywkę i uzupełniono komórki w pożywkach szpiku kostnego (30% komórek L, 20% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny w DMEM) przez 2 dni. Następnie komórki sortowano pod kątem zakażenia poprzez ekspresję transgenu w sekwencji wirusowej (tagBFP2).

podsumowanie sprawozdania

Więcej informacji na temat projektu eksperymentalnego można znaleźć w podsumowaniu sprawozdania z badań przyrodniczych, powiązanym z tym artykułem.

dostępność kodu