Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation

1 kompletny format numeru przystąpienia składa się z przedrostka, w tym podkreślnika, po którym następuje 6 cyfr, a następnie numer wersji sekwencji.

2 Kompletny format przystąpienia składa się z przedrostka, po którym następuje numer przystąpienia INSDC, na którym oparty jest rekord RefSeq, a następnie numer wersji sekwencji RefSeq.

3pełny format numeru przystąpienia składa się z przedrostka, w tym podkreślnika, po którym następuje 6 lub 9 cyfr, po których następuje numer wersji sekwencji.

4Records z tym prefiksem akcesyjnym zostały kuratorowane przez pracowników NCBI lub bazę danych organizmów modelowych, lub znajdują się w Puli akcesji, z którymi kuratorzy pracują. Rekordy te są określane jako „znany” zbiór danych RefSeq.

5rekordy z tym prefiksem są generowane przez rurociąg adnotacji genomu eukariotycznego lub mały rurociąg adnotacji genomu eukariotycznego. Rekordy wygenerowane za pomocą pierwszej metody są określane jako „modelowy” zbiór danych RefSeq.

6 kompletny format numeru przystąpienia składa się z przedrostka, w tym podkreślnika, po którym następuje 9 cyfr, po których następuje numer wersji. Numer wersji to zawsze”.1 ’ ponieważ zapisy te nie podlegają aktualizacji. Dodatkowe informacje można znaleźć w dokumentacji online: www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/about/nonredundantproteins/.

dramatyczny spadek liczby zapisów białek plazmidowych, a tym samym liczby całkowitych akcesji, odzwierciedla zakończenie projektu readnotacji genomu bakterii RefSeq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/o/prokariotach/ reannotacji/) i przyjęcie nowego modelu danych dla prokariotów, w tym ich plazmidów. W tym nowym modelu danych pojedyncze niez redundantne przyłączenie białka RefSeq może być adnotowane na więcej niż jednym rekordzie sekwencji genomowej, gdy translacja tych regionów kodujących białko genomowe daje identyczne białko (patrz http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/about/nonredundantproteins/). Redundancja we wszystkich białkach bakteryjnych również znacznie spadła; jednak nie jest to widoczne tutaj z powodu ciągłego znacznego wzrostu liczby genomów bakteryjnych zawartych w zbiorze danych. Zmiany te spowodowały również ogólny spadek liczby zapisów białka archaealnego.

kręgowce

wybrana grupa kręgowców, w tym Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Gallus gallus, Bos taurus i Danio rerio, jest głównym celem naszych manualnych wysiłków kuratorskich opartych na transkrypcjach i literaturze. Kuratorzy zazwyczaj pracują na podstawie list genów z konfliktami danych zidentyfikowanymi za pomocą testów zapewniania jakości (QA), z których niektóre zostały wcześniej opisane (12). Podczas analizy każdego genu przestrzegają szczegółowych wytycznych, aby zapewnić spójność międzyosobniczą w dobranym zbiorze danych. Analiza ta obejmuje dogłębną ocenę sekwencji i przegląd literatury w celu stworzenia transkryptów referencyjnych, białek, pseudogenów i rekordów RefSeqGene. Kuratorzy RefSeq generują warianty transkrypcji, rozwiązują błędy sekwencji, usuwają niedokładne informacje, aktualizują rekordy, aby poprawnie reprezentować biologię locus, i dodają cenne informacje funkcjonalne do niektórych rekordów RefSeq, takich jak ulepszone nazwy białek, podsumowanie funkcji produktu genowego, cechy funkcjonalne genu i/lub odpowiednie publikacje. Ręczne przygotowywanie i przegląd literatury przez grupę RefSeq może skutkować przedstawieniem unikalnych wariantów i izoform, których nie można przewidzieć, gdy opierają się wyłącznie na analizie obliczeniowej. Na przykład, przegląd literatury ludzkiego genu supresorowego guza PTEN (phosphatase and tensenin homolog, GeneID: 5728) ujawnił istnienie dłuższej izoformy białka wynikającej z zastosowania alternatywnego kodonu inicjacji CUG znajdującego się w centrum sekwencji palindromicznej przed kanonicznym kodonem początku translacji mRNA (13). Silne dane doświadczalne wskazują, że ta specyficzna dla mitochondriów izoforma inicjuje się z leucyną, a nie metioniną (14). Model danych RefSeq dla eukariotów zapewnia jeden transkrypt wyraźnie powiązany z jednym białkiem. W związku z tym dostarczono dwa identyczne zapisy transkrypcji w celu odzwierciedlenia translacji z alternatywnych kodonów inicjacji; NP_000305.3 reprezentuje białko 403 aminokwasowe, które wykorzystuje kanoniczny kodon metioniny start, podczas gdy NP_001291646.2 reprezentuje zlokalizowane w mitochondriach białko 576 aminokwasowe, które inicjuje leucyną. Tak więc proces kuracji służy podwójnemu celowi zapewnienia dokładnych sekwencji referencyjnych, które ułatwiają precyzyjną i powtarzalną adnotację genomu oraz dostarczanie zapisów zawierających istotne informacje biologiczne. W tej sekcji omówimy najnowsze aktualizacje, ulepszenia, które wprowadziliśmy do naszego ręcznego procesu kuratorskiego oraz przykłady skoncentrowanych projektów kuratorskich.

RefSeqGene project

subprojekt RefSeqGene definiuje ludzkie sekwencje genomowe jako standardy odniesienia dla dobrze scharakteryzowanych genów, szczególnie do użytku przez społeczność genetyków klinicznych. Sekwencje te służą jako stabilna podstawa do zgłaszania wariantów patogennych, do ustanawiania konwencji numeracji eksonów i intronów oraz do definiowania współrzędnych innych wariantów. Każdy rekord RefSeqGene koncentruje się na specyficznym dla genu regionie genomowym i zazwyczaj jest adnotowany podzbiorem transkryptów RefSeq i białek wybranych przez ekspertów w dziedzinie. Te wybory określają funkcje exona. Uwzględniono dopasowania starszych wersji transkryptu/białka kanonicznego RefSeq, jak również innych znanych RefSeq. Zapisy te zazwyczaj obejmują 5 kilobaz (kb) sekwencji przed genem ogniskowym i 2 kb sekwencji przed genem ogniskowym, aby wspierać reprezentację potencjalnych miejsc regulacyjnych lub delecji wykraczających poza cechę genu. Zapis RefSeqGene może zawierać informacje o adnotacji dla innych genów, które znajdują się w jego granicach. Rekordy RefSeqGene są początkowo sprawdzane przez bazy danych specyficzne dla locus i pracowników NCBI. RefSeqGene jest członkiem LRG collaboration (7), który zapewnia dodatkowy przegląd danych sekwencji przed dodaniem akcesji LRG. W ostatnich pracach zwiększono liczbę rekordów RefSeqGene do reprezentowania wszystkich genów, dla których co najmniej dwa testy kliniczne zostały przedłożone do NIH Genetic Testing Registry (GTR). W tej chwili istnieje 5596 rekordów RefSeqGene, z których 633 ma przystąpienie do LRG. Rekordy RefSeqGene można uzyskać, przeszukując bazę danych nukleotydów za pomocą 'refseqgene’, poprzez ich dostęp do LRG, przeglądając stronę internetową RefSeqGene (www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/rsg/) lub przez FTP (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/H_sapiens/RefSeqGene/).

włączenie RNA-Seq i innych typów danych w kuracji opartej na transkrypcji

głównym celem projektu kuracji RefSeq jest reprezentowanie wysokiej jakości i pełnej długości transkrypcji i sekwencji referencyjnych białek. Jako takie, nasze kryteria kuracji opierają się przede wszystkim na konwencjonalnych transkrypcjach (mRNA i ESTs) oraz dopasowaniach białek i opublikowanych dowodach. Jednak, vertebrate transcriptome projekty stały się coraz bardziej złożone z większość nowych danych transkrypcji obecnie generowane przez short read sekwencjonowania technologii. Badania obejmujące cały genom, analizujące globalne wzorce znaków epigenetycznych związanych z promotorem, również dostarczają dowodów na aktywne promotory i / lub aktywną transkrypcję. Grupa RefSeq dostosowała praktyki kuratorskie, aby włączyć te nowe typy danych, aby poprawić naszą ręczną adnotację, szczególnie w przypadkach, gdy gen lub wariant nie ma obfitego konwencjonalnego wsparcia transkrypcji. Te badania RNA-Seq i epigenomiczne wygenerowały ogromne zbiory danych, które stanowią wyzwanie dla grup adnotacji genów, na przykład poprzez potencjalne fałszywie dodatnie wyniki i brak wsparcia dla kombinacji eksonów dalekiego zasięgu (15). Kuratorzy RefSeq ograniczają wykrywanie fałszywych alarmów poprzez selektywne włączanie do naszego potoku adnotacji genomu i ręcznego procesu adnotacji wyłącznie wysokiej jakości zbiorów danych. Kuratorzy RefSeq wizualizują wyrównania transkrypcji, dane zmian i filtrowane dane RNA-Seq na niestandardowych wyświetlaczach w ramach wewnętrznego narzędzia do wyrównywania włączonego do platformy NCBI Genome Workbench (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/gbench/). Kuracja ludzkich genów wykorzystuje analizowane odczyty RNA-Seq z projektów Illumina BodyMap 2 (BioProject: PRJEB2445) i Human Protein Atlas (BioProject: PRJEB4337) (16). Dodatkowo kuratorzy używają znaków modyfikacji histonów związanych z promotorem, takich jak H3K4me3 z NIH Roadmap Epigenomic Mapping Consortium (REMC; (17) oraz projekt ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) (18) mający na celu sprawdzenie obecności aktywnego promotora. Kuratorzy RefSeq oceniają również dane polyA-seq, aby potwierdzić 3 ’ kompletność transkryptów pozbawionych ogona polyA (19). Dodatkowe typy danych, w tym PhyloCSF (20), CpGIslands, RepeatMasker (21) I Cap analysis of gene expression (Cage) data (22), są czasami używane jako dodatkowe wsparcie.

Długie niekodujące RNA (lncrna)

Grupa RefSeq nadal znacząco rozszerza się na reprezentację niekodujących strukturalnych i mikro-RNA, transkrybowanych pseudogenów i w dużej mierze nietypowych lncrna. Ta klasa genów jest ogólnie definiowana jako transkrypty >o długości 200 nt, które nie mają silnego potencjału kodowania białek (23). rekordy RefSeq lncRNA są generowane przez kurację i przez rurociąg adnotacji genomu eukariotycznego dla genów lncRNA. NCBI utrzymuje obecnie ponad 540 000 eukariotycznych rekordów Lncrna RefSeq, z których ponad 6700 zostało kuratorowanych, a tylko kilkaset zostało scharakteryzowanych funkcjonalnie. Wiele z nich jest związanych z chorobami człowieka, takimi jak BACE1-AS, które mogą odgrywać rolę w patofizjologii choroby Alzheimera, oraz HOTAIR, który jest związany z wieloma nowotworami (24,25). Zdecydowana większość lncrna ma nieznane funkcje, a brak długich otwartych ramek odczytu stanowi wyzwanie pod względem potwierdzenia kompletności transkrypcji. Ponadto zgłoszenia lncRNA do INSDC są w dużej mierze oparte na TSA z krótkich odczytywanych zbiorów danych, które mogą obejmować kombinacje artefaktualnych eksonów. Kuratorzy RefSeq przyjmują konserwatywne podejście do reprezentowania genów lncRNA, tylko ręcznie tworząc RefSeqs (z prefiksem Nr_) dla wysokiej jakości transkryptów, dla których mamy pewną pewność co do struktury egzonu. Idealnie, wsparcie transkryptu powinno być łączone z co najmniej trzema eksonami, ale transkrypty dwu-eksonowe i intronless mogą być reprezentowane, jeśli są obsługiwane przez epigenomikę związaną z promotorem, dowody Poli(A), Dodatkowe cDNA i/lub dane RNA-Seq. Rejestry RefSeq lncrna dla niekodujących genów można pobrać z bazy nukleotydów NCBI za pomocą szukanego ciągu „biomol ncrna lncrna” i wybierając filtr RefSeq z lewej kolumny.

adnotacja funkcjonalna

unikalny wkład kuratorów zapisów transkrypcji Eukaryotic RefSeq polega na tym, że integrują informacje funkcjonalne z sekwencją odniesienia. RefSeq curation staff dodaje streszczenia genów, nomenklaturę, tekst wariantu transkrypcji, atrybuty genów i sekwencji oraz cechy funkcjonalne, które są dostępne w rekordzie RefSeq i / lub za pośrednictwem zasobu genów (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene). W ubiegłym roku pracownicy RefSeq przeprowadzili kilka dogłębnych projektów adnotacji, z których niektóre są krótko opisane w poniższych akapitach, aby dodać dane funkcjonalne do określonych zestawów genów, w których narzędzia obliczeniowe nie są w stanie dokładnie reprezentować wiedzy biologicznej. Projekty te obejmują adnotację peptydów przeciwbakteryjnych, endogennych retrowirusów, histonów zależnych od replikacji, regulatorowych uorfów i antyzymów.

peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMPs)

AMPs były ostatnim celem kuracji (http://ncbiinsights.ncbi.nlm.nih.gov/ 2015/05/21/) (26). AMPs są naturalnie występującymi peptydami, które znajdują się w różnych gatunkach i były zaangażowane w wiele ról odpornościowych, w tym bakteriobójcze, przeciwwirusowe, przeciwgrzybicze, a nawet przeciwnowotworowe. Lista ponad 130 ludzkich genów kodujących jeden lub więcej eksperymentalnie sprawdzonych AMPs została zebrana z kilku publicznie dostępnych zbiorów danych AMP, a także wydobyta z publikacji. Większość z tych Amp nie została wcześniej zidentyfikowana w bazie danych RefSeq, a żadna z baz danych AMP nie łączyła peptydów z ich genem kodującym. Kuratorzy RefSeq ręcznie adnotowali rekordy RefSeq dla każdego ludzkiego genu kodującego AMP, aby upewnić się, że funkcjonalny peptyd został adnotowany, aby dołączyć publikację opisującą aktywność przeciwdrobnoustrojową peptydu, dodać krótkie podsumowanie opisujące aktywność przeciwdrobnoustrojową kodowanego AMP i zapisać nowy atrybut RefSeq „białko ma aktywność przeciwdrobnoustrojową”, który jest zawarty w ustrukturyzowanym komentarzu atrybutu RefSeq (np. NM_001124.2 dla ADM; GeneID: 133). Aby uzyskać dostęp do wszystkich wyselekcjonowanych zapisów ludzkiego transkryptu lub AMP białka, przeszukaj bazę danych nukleotydów lub białek, używając słowa „białko ma aktywność przeciwdrobnoustrojową”. Obecnie w wyszukiwaniu znajduje się 191 rekordów RefSeq, w tym warianty splicingu i izoformy białek.

endogenne retrowirusy (ERVs)

endogenne retrowirusy (ERVs) są loci genomowych, które pochodzą z ancestral insercji egzogennego retrowirusa do genomu gospodarza. ERV loci są na ogół poza zasięgiem RefSeq; jednakże, opisujemy pełnowymiarowe loci kodujące białka ERV, które mapują do pojedynczej lokalizacji genomowej, jeśli ewoluowały do pełnienia funkcji gospodarza, są związane ze znaną chorobą i / lub jeśli zostały przypisane do Nomenklatury przez oficjalny Komitet ds. nomenklatury. Około 8% ludzkiego genomu jest pochodzenia retrowirusowego (27); jednak ze względu na ich starożytne pochodzenie większość ludzkich loci ERV ma nagromadzone mutacje nonsensowne i nie może już kodować białka. Dobrze znanym wyjątkiem są białka syncytyny, które biorą udział w rozwoju łożyska (28). Ludzkie białka syncytin-1 i syncytin-2 są kodowane przez geny ERVW-1 (NM_001130925.1, NM_014590.3) i ERVFRD-1 (NM_207582.2). Do tej pory stworzyliśmy 67 RefSeqs dla ERV loci, które zawierają zapisy reprezentujące geny ERV z różnorodnego zestawu ssaków. Nowa kategoria atrybutów RefSeq zatytułowana „endogenny retrowirus” została stworzona dla tych rekordów i pojawia się w ustrukturyzowanym komentarzu do rekordu RefSeq. Zapisy te można pobrać z bazy danych nukleotydów, wyszukując „endogennego retrowirusa”.

histony zależne od replikacji

szybka synteza mRNA histonów jest wymagana podczas podziału komórki w celu wytworzenia dużych ilości białek histonowych. Kluczowe znaczenie dla tego procesu mają zależne od replikacji geny histonowe, które są regulowane w fazie G1/s cyklu komórkowego (29). Podjęto specjalny projekt RefSeq w celu kuratorowania pełnego zestawu genów kodujących białko histonowe zależne od replikacji u ludzi i myszy. Geny te mają w sekwencji genomowej kanoniczną sekwencję 3′ histonu (HDE), a w wyniku tego Dojrzałe mRNA charakteryzują się brakiem ogonów Poli(a) i zamiast tego kończą się krótko po strukturze pętli macierzystej RNA (30). Element HDE znajduje się w transkrypcji prekursorowej, ale nie jest uwzględniany w transkrypcji przetworzonej reprezentowanej przez RefSeq. Położenie zachowanej 16 nukleotydowej sekwencji struktury stem-loop jest wskazane w rekordzie RefSeq jako adnotacja Cechowa zatytułowana „stem-loop”. Przykład można zobaczyć na pozycji RefSeq Nm_003539. 3 dla HIST1H4D (GeneID: 8360). Do tej pory opracowano 127 rekordów histonu zależnego od replikacji u ludzi i myszy oraz dodano atrybut RefSeq, który można wykorzystać do pobrania tych rekordów z bazy danych nukleotydów za pomocą szukanego ciągu „Histon zależny od replikacji”.

Regulatory upstream open reading frame (uorfs)

tłumaczenie upstream open reading frame (uorf) może negatywnie wpływać na tłumaczenie pierwotnej otwartej ramki do czytania kodującej białko (pORF) (31). Efekt ten nie zawsze całkowicie wycisza translację pORF i może być zależny od typu komórki, stanu rozwojowego lub stanu komórkowego. W związku z tym, chociaż uorf można przewidzieć na podstawie sześciostopniowego tłumaczenia transkryptu, efekt regulacyjny tego elementu musi być określony poprzez walidację eksperymentalną. Kuratorzy RefSeq przejrzeli literaturę w celu znalezienia transkryptów z eksperymentalnymi dowodami regulatorowych uorf i zaktualizowali odpowiednie rekordy transkrypcji RefSeq, aby dodać misc_feature oznaczające lokalizację tych uorf. Przykładem jest wpis RefSeq Nm_000392.4 dla ABCC2 (GeneID: 1244). Nowa kategoria atrybutów RefSeq zatytułowana „regulatory uORF” została utworzona i pojawia się w ustrukturyzowanym komentarzu do tych rekordów RefSeq. Zarówno przypisana funkcja, jak i atrybut cytują publikację wspierającą PubMed ID. Do tej pory 260 rekordów zostało opatrzonych tym atrybutem i zapisy te można pobrać z bazy danych nukleotydów, wyszukując „regulatory uORF”

geny Antyzyme

jednym z celów projektu RefSeq jest reprezentowanie genów o wyjątkowej biologii, które nie przestrzegają standardowych zasad dekodowania syntezy białek. Taki przykład stanowi Gen antyzymowy dekarboksylazy ornitynowej, w którym występuje zaprogramowany Mechanizm Zmiany RAM +1 rybosomalnej i nie można go przewidzieć za pomocą konwencjonalnych narzędzi obliczeniowych. Zestaw transkrypcji antyzymów kręgowców i zapisów białek był ostatnio przedmiotem ręcznego wysiłku adnotacji w celu stworzenia standardów poprawiających adnotację tych produktów genowych przez rurociąg adnotacji genomu eukariotycznego (32). Rekordy RefSeq były ręcznie adnotowane za pomocą funkcji split CDS w celu odzwierciedlenia poślizgu rybosomalnego i zawierały atrybut „poślizgu rybosomalnego” z opublikowanymi dowodami, różne różne adnotacje dotyczące funkcji (takie jak lokalizacja miejsca przesunięcia ramki) oraz krótkie podsumowanie opisujące funkcję i nowe właściwości genu (np. NM_139081.2). Zapisy te można pobrać z bazy nukleotydów lub białek za pomocą zapytania: vertebrates refseq ribosomal slippage antizyme. To wyszukiwanie znajduje obecnie 242 rekordów RefSeq (NM lub NP), które obejmują warianty transkrypcji i izoformy białek.

Bezkręgowce

gatunki bezkręgowców stanowią zdecydowaną większość istniejących metazoanów (33); jednak tylko stosunkowo niewielka liczba jest reprezentowana przez zsekwencjonowane genomy. To pomimo faktu, że wiele gatunków ma krytyczne znaczenie biomedyczne, takie jak Anopheles gambiae, wektor malarii i Biomphalaria glabrata, wektor schistosomiasis (34,35). Inne bezkręgowce, w tym Apis mellifera, Bombyx mori i Crassostrea gigas, mają znaczną wartość handlową (36-38). Grupa RefSeq dołożyła starań, aby zwiększyć liczbę i zakres genomów bezkręgowców reprezentowanych w zbiorze danych, dostarczając adnotację za pośrednictwem potoku adnotacji genomu eukariotycznego lub propagując adnotację z zgłoszeń INSDC na kopię tych genomów RefSeq. W przypadku obu procesów Jesteśmy zależni od publicznej dostępności wysokiej jakości genomów w bazach danych INSDC i Assembly database NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/). do tej pory NCBI opisało 46 genomów bezkręgowców, w tym reprezentatywne gatunki owadów, pajęczaków, mięczaków i akordatów bazalnych. Przewidujemy znaczny wzrost liczby genomów owadów i innych bezkręgowców w wyniku inicjatyw genomowych, takich jak i5k (39), 1kite (1k Insect Transcriptome Evolution, http://www.1kite.org/) I Global Invertebrate Genome Alliance (http://giga.nova.edu/) (40).

rośliny

RefSeq nadal rozszerza różnorodność gatunków roślin reprezentowanych w zbiorze danych. Do tej pory 61 gatunków roślin zostało włączonych do zbioru danych genomów RefSeq (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov / genomes / refseq / plant/), z których 33 gatunki zostały opatrzone adnotacją za pośrednictwem rurociągu adnotacji genomu eukariotycznego; reszta to kopie adnotowanych genomów RefSeq przekazane INSDC. W przyszłości więcej genomów roślin wybranych do włączenia RefSeq będzie przetwarzanych przez rurociąg adnotacji eukaryote, zamiast propagowania adnotacji z zgłoszenia INSDC. Jest to zmiana polityki dla genomów roślin RefSeq i spowoduje większą ogólną spójność danych adnotacji roślin w zbiorze danych RefSeq. Większość transkryptów RefSeq i białek dostępnych dla gatunków roślin to rekordy „modelowe” (xm_, xp_ i xr_ accessions; Tabela 1), z mniejszym podzbiorem „znanych” rekordów (NM_, NR_, NP_), które są utrzymywane niezależnie od procesu adnotacji przez połączenie automatycznego przetwarzania i ręcznego przeglądu. Obecnie dla Zea mays i Solanum lycopersicum dostarczane są ręczne przetwarzanie transkrypcji roślin i danych dotyczących białka. Obecne skupienie kuratorskie pociąga za sobą obszerny przegląd sekwencji i jest ukierunkowane na rozwiązywanie problemów związanych z jakością w bieżącym zestawie transkrypcji. Rozwiązywanie błędów koncentruje się na identyfikacji i usuwaniu chimerycznych transkryptów, nadmiarowych transkryptów i genów oraz poprawie jakości reprezentowanej sekwencji poprzez ocenę indeli i niedopasowań między transkrypcją RefSeq, sekwencją genomową i danymi ortologicznymi. W przypadku roślin staramy się zapewnić wyselekcjonowany transkrypt i zestaw danych białkowych, który jest zgodny z odmianą wybraną do sekwencjonowania i montażu genomu. Protokół kuracji stosowany dla danych dotyczących kręgowców jest również stosowany dla roślin. Tak więc zapisy transkrypcji RefSeq mogą być aktualizowane tak, aby opierały się na innej sekwencji źródłowej INSDC lub mogą być montowane z więcej niż jednego rekordu sekwencji INSDC w celu dostarczenia transkrypcji z preferowanej odmiany. Jeżeli dane z transkrypcji INSDC nie są dostępne dla odmiany genomowej, to transkrypcja RefSeq może być wygenerowana ze złożonej sekwencji genomowej w oparciu o kombinację transkrypcji lub dopasowań białek, RNA-Seq i / lub opublikowanych danych. Drugim obszarem zainteresowania jest zwiększenie liczby obsługiwanych transkryptów kodujących białka i białek, ponieważ zapewnia to odpowiednio dobrany odczynnik, który może być używany podczas opisywania innych genomów roślinnych. Wreszcie, tworzymy więcej RefSeqs reprezentujących warianty splicingu, gdy istnieją wystarczające dowody potwierdzające. Wysiłki te znacznie poprawią jakość zbioru danych RefSeq zakładu I przyczynią się do poprawy przyszłych adnotacji genomu. Aktualny zestaw genomów roślin adnotowanych przez rurociąg można uzyskać na stronie NCBI eukaryotic genome annotation pipeline http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_euk/all/ z linkami do szczegółowego raportu adnotacji i innych zasobów, takich jak species BLAST i FTP.

glony, grzyby, nicienie i pierwotniaki

mały rurociąg genomu EUKARIOTYCZNEGO NCBI jest nowym zautomatyzowanym rurociągiem zaprojektowanym do generowania rekordów RefSeq w wyniku bezpośredniego propagowania adnotowanych rekordów INSDC. Wygenerowane w ten sposób rekordy RefSeq są kopiami danych GenBank z pewnymi zmianami formatu, aby spełnić wymagania RefSeq. Najbardziej zauważalną różnicą między oryginalnym rekordem INSDC a rekordem RefSeq jest dodanie produktu transkrypcji RefSeq. Chociaż nie zaprojektowano go do generowania adnotacji genomu de novo, mały rurociąg genomu eukariotycznego czerpie z kilku modułów rurociągu adnotacji genomu EUKARIOTYCZNEGO NCBI i ich kodu (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169439/).

nazwa „Małe eukarioty” odnosi się do podstawowego zastosowania rurociągu do generowania genomów RefSeq dla stosunkowo mniejszych genomów eukariotycznych (w porównaniu do genomów roślin i kręgowców), takich jak glony, pierwotniaki, grzyby, nicienie i niektóre stawonogi. Jednak niektóre duże genomy roślinne są również przetwarzane za pomocą tego rurociągu. Rurociąg ten przetwarza wysokiej jakości zespoły składające się z chromosomów i / lub rusztowań oraz ich części składowych. Pierwszeństwo mają zespoły z wysokim contig i rusztowaniem N50, wysokiej jakości Sekwencja i dość dobra adnotacja złożona przez INSDC. Ten rurociąg, który zastępuje historyczny przebieg procesu, który wymagał większego wsparcia ręcznego, dopiero niedawno osiągnął fazę produkcji publicznej i już teraz daje zwiększoną liczbę „małych” genomów eukariotycznych reprezentowanych w RefSeq. Trwają prace nad optymalizacją przepustowości potoku oraz dodaniem większej automatyzacji i dalszą minimalizacją zadań związanych z przetwarzaniem kuratorów. Długoterminowe plany obejmują wdrożenie systemu zarządzania nazwami białek w celu dostarczania, poprawiania lub ulepszania nazw zgłoszonych przez INSDC w czasie. Wiele genomów, które są w zasięgu małego rurociągu eukariotów, nie może być obecnie przetwarzanych przez (duży) rurociąg adnotacji genomu eukariotycznego z powodu różnorodności taksonomicznej i ograniczonej dostępności danych transkrypcyjnych potrzebnych do szkolenia rurociągu adnotacji de novo.

grzyb celowane loci

morfologia grzyba jest bardzo zróżnicowana, począwszy od złożonych struktur wielokomórkowych do bardzo prostych pojedynczych komórek. Różne struktury morfologiczne i typy zarodników mogą być wytwarzane przez jeden gatunek. Z drugiej strony wiele gatunków wytwarza podobne morfologie (morfy), ale w rzeczywistości są genetycznie bardzo odległe. Do niedawna pojedynczy gatunek mógł być prawomocnie opisany z więcej niż jedną nazwą dwumianową na podstawie morfologii płciowej lub bezpłciowej. W wielu przypadkach opisano i zarejestrowano tylko jeden Morf dla danego gatunku, chociaż gatunki blisko z nim spokrewnione mogą mieć opisane i zarejestrowane kilka Morf. W związku z tym porównywanie sekwencji zostało zastosowane w społeczności grzybów w celu rozróżnienia między gatunkami, śledzenia gatunków w trakcie złożonych cykli życiowych i identyfikacji gatunków tajemniczych. W ramach dynamicznego procesu ponownej oceny taksonomicznej wiele korekt gatunków grzybów nie zawsze jest aktualnych w danych sekwencyjnych Genbanku.

aby być bardziej wiarygodnym źródłem do identyfikacji opartej na DNA, sekwencje referencyjne pochodzące z okazów typu (które działają jako odniesienia dla gatunków) muszą być oznakowane prawidłową i najbardziej aktualną nazwą gatunku. Bazy loci ukierunkowane na grzyby RefSeq zapewniają ten cenny zasób. Na przykład PRJNA177353 jest Bioprojektem, który w szczególności koncentruje się na wewnętrznych transkrybowanych regionach dystansowych (ITS) w jądrowym cistronie rybosomalnym, który był używany przez wiele lat jako marker filogenetyczny i ostatnio zatwierdzony jako formalna Sekwencja kodów kreskowych grzybów (41). Baza danych its RefSeq powstała w wyniku współpracy z Index Fungorum, MycoBank i UNITE, a także dużą grupą specjalistów taksonomicznych. Sekwencje zostały wybrane, głównie z okazów typowych o prawidłowych opisach, a następnie z sekwencjami powiązano aktualne prawidłowe nazwy gatunków w celu reprezentowania większości akceptowanych rzędów grzybów (8). Wyniki tego wysiłku kuratorskiego były wykorzystywane i cytowane w różnych publikacjach (42-46) i wspomagały dodatkowe wysiłki w walidacji podzbiorów sekwencji referencyjnych, np. gatunków o znaczeniu medycznym (47).

celem, przy ciągłej kuracji, jest dodanie sekwencji z nowo opisanych rzędów i rozszerzenie reprezentacji na większość akceptowanych rodzin z naciskiem na grzyby o znaczeniu medycznym. Proces obejmuje również wprowadzanie korekt, zastępowanie sekwencji ze zweryfikowanego materiału sekwencją z materiału typu, gdy staje się on dostępny i edytowanie linii definicji lub usuwanie rekordów RefSeq w miarę zmian klasyfikacji taksonomicznej. Zapewnia to, że wyniki wyszukiwania BLAST poprawnie wyświetlają bieżącą nazwę. RefSeq jego rekordy zostały rozszerzone do reprezentowania 3,060 sekwencji reprezentujących 270 rodzin z 39 klas. Podczas początkowej współpracy jego RefSeq wysiłku, mniejszy zestaw akcesji sekwencji z 28S jądrowej dużej podjednostki rybosomalnego genu (LSU) zostały również zebrane, ale nie zweryfikowane. Przebieg pracy podobny do procesu kuratorowania rekordów its był śledzony, a podczas dalszego kuratorowania te rekordy LSU zostały zweryfikowane pod kątem jakości sekwencji, prawidłowej identyfikacji i dokładnych danych źródłowych. Blisko 500 rekordów (z 800 potencjalnych rekordów) reprezentujących >zweryfikowano i niedawno wydano 100 rodzin z 21 klas. Zestaw danych 28S można pobrać z Bioprojekt PRJNA51803 (48).

prokarioty

kolekcja prokariotycznych genomów NCBI RefSeq reprezentuje zmontowane genomy prokariotyczne o różnych poziomach jakości i gęstości pobierania próbek. W przypadku prokariotów, opierając się na wcześniejszych opiniach społeczności, naszą obecną polityką jest zapewnienie adnotacji genomu dla wszystkich genomów prokariotycznych, które spełniają nasze kryteria jakości. W ostatnich latach mieliśmy do czynienia z dwoma głównymi wyzwaniami: (i) nadążanie za szybką eskalacją przedłożonych genomów prokariotycznych; oraz (ii) zajęcie się rosnącą niespójnością w adnotacji genomu ze względu na wykorzystanie zarówno rurociągu opartego na propagacji INSDC, jak i różnych wersji rurociągu adnotacji genomu NCBI de novo, opracowanego w czasie.

wraz ze wzrostem zainteresowania ludzkimi patogenami i rozwojem technologii sekwencjonowania DNA, liczba zsekwencjonowanych genomów prokariotycznych gwałtownie wzrosła w ostatniej dekadzie. Niektóre bakteryjne szczepy są często nie do odróżnienia przy użyciu obecnych metod genotypowania, ale drobne różnice genetyczne mogą być wykrywane na podstawie sekwencjonowania całego genomu, który jest przydatny do charakteryzowania szlaków transmisji, identyfikowania oporności na antybiotyki i badania ognisk. Aby zbadać patogeny przenoszone przez żywność lub ogniska infekcji, w ostatnich latach zsekwencjonowano i opatrzono dużą liczbę prawie identycznych genomów bakterii, w wyniku czego powstało wiele identycznych białek, z których każde ma odrębną liczbę akcesji. W 2013 roku NCBI wprowadziło nowy model danych dotyczących białka i prefiks akcesyjny (WP_) dla kolekcji RefSeq. Ta zmiana zmniejszyła redundancję w prokariotycznych białkach RefSeq i ułatwiła identyfikację białek, które były identycznie znalezione na więcej niż jednym genomie. Pozwoliło to również na ulepszoną strategię zarządzania prokariotycznymi nazwami białek. Te nie redundantne zapisy reprezentują unikalne sekwencje białek prokariotycznych, które są niezależne od konkretnego genomu bakterii i mogą być opisywane na wielu szczepach lub gatunkach (www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/about/nonredundantproteins/).

historycznie, RefSeq bacterial genomes annotation was propagated from INSDC submissions, when available, or generated using different versions of NCBI ’ s Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (which is also offer as a service for GenBank submissions). Spowodowało to skumulowane niespójności zarówno w adnotacji strukturalnej, jak i funkcjonalnej w prokariotycznym zbiorze danych RefSeq. W ciągu ostatnich dwóch lat NCBI ulepszyło kilka aspektów potoku adnotacji prokariotycznej genomu, aby zwiększyć pojemność i dalej standaryzować Zasady adnotacji. Nasz rurociąg łączy algorytm wywoływania genów, GeneMarkS+ (49,50), z podejściem do wykrywania genów opartym na wyrównaniu i jest w stanie adnotować zarówno kompletne, jak i szkicowe genomy WGS. Obecnie rurociąg przewiduje geny kodujące białka, strukturalne RNA (5S, 16S i 23s), tRNA i małe niekodujące RNA.

w 2015 roku opublikowaliśmy kompleksową aktualizację adnotacji dla prokariotycznych genomów RefSeq w celu zharmonizowania adnotacji genomu i zakończenia przejścia na nowy model danych o białkach. Opracowano nową bazę nazw prokariotycznych białek, specyfikacje nazw i strategię opartą na dowodach, które są obecnie w trakcie wdrażania. Do tej pory ponad 3 miliony rekordów białek zaktualizowało nazwy w początkowej demonstracji podejścia. Nowy prokariotyczny model danych oferuje znaczną przewagę w zarządzaniu nazwami, ponieważ nazwa białka jest przenoszona z rekordem sekwencji białka; aktualizacja nazwy na tym rekordzie białka powoduje automatyczne rozmnażanie aktualizacji do wszystkich genomów, które są opatrzone tym numerem akcesyjnym.

genomy prokariotyczne RefSeq są zorganizowane w kilka nowych kategorii, takich jak genomy referencyjne i genomy reprezentatywne w oparciu o Wybrane atrybuty oraz miary jakości montażu i adnotacji (www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/about/prokaryotes/) (51). Genomy referencyjne są ręcznie wybieranymi kompletnymi genomami „gold standard” o wysokiej jakości adnotacji i najwyższym poziomie eksperymentalnego wsparcia dla adnotacji strukturalnej i funkcjonalnej. Obecnie mały zbiór danych 122 genomów referencyjnych jest ręcznie adnotowany przez grupy współpracujące i personel NCBI. Genomy referencyjne są dostępne pod adresem: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/reference/. Genomy reprezentatywne są obliczane obliczeniowo i wybierane do reprezentowania różnych gatunków. Genomy reprezentatywne są dostępne pod adresem: www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/representative/.

RefSeq dane genomu prokariotycznego mogą być dostępne w bazach danych BLAST, zasobach internetowych (Assembly, BioProject, Genome, Nucleotide and Protein), za pośrednictwem narzędzi programistycznych NCBI, lub mogą być pobrane z genomów lub witryn FTP refseq. Niestandardowa strona „mikrobów” BLAST, dostępna ze strony głównej BLAST, zawiera opcje wyszukiwania dla wszystkich genomów prokariotycznych RefSeq, podgrupy genomów referencyjnych i reprezentatywnych lub ograniczenia wyszukiwania do konkretnych taksonów. Podgrupa prokariotycznych genomów jest opatrzona identyfikatorem genu NCBI i może być pobrana w zasobie genowym NCBI lub ze strony FTP genu. W przypadku archai, jest to przewidziane dla najbardziej kompletnych genomów. W przypadku bakterii jest to przewidziane dla genomów referencyjnych i genomów reprezentatywnych dla gatunków, które mają co najmniej 10 genomów.

prokariotyczne loci

u prokariotów Sekwencja rybosomalnego RNA 16S stała się standardowym markerem molekularnym dla opisu nowego gatunku. Chociaż te sekwencje znacznikowe stały się szeroko stosowane, jakość danych sekwencji i powiązanych metadanych przesyłanych do baz danych INSDC znacznie się różni. Uznając znaczenie dostępu do wysokiej jakości danych dla tych znaczników, NCBI rozszerzyło projekt targeted loci, aby zapewnić aktualne źródło danych. Docelowy projekt loci utrzymuje obecnie prawie 18 000 rybosomalnych sekwencji referencyjnych RNA 16S, z których ponad 95% pochodzi od szczepów typu. Szczepy typu są uważane za wzór gatunku i istotne jest, aby dane dotyczące szczepów typu były opatrzone poprawnymi metadanymi i były wolne od zanieczyszczeń.

praca ta obejmowała wyczerpujący przegląd i aktualizację bazowej bazy danych taksonomii, która została użyta w połączeniu z filtrem typu Entrez NCBI do pobierania sekwencji kandydatów. Dane sekwencyjne i związane z nimi taksonomie/metadane zostały zweryfikowane i poprawione w celu uwzględnienia najbardziej aktualnych informacji. Jeśli sekwencja nie powiodła się lub nie mogła zostać dokładnie zwalidowana, została wykluczona. Te sekwencje referencyjne mogą być teraz używane jako „złote standardy” do analizy istniejących i nowych sekwencji rRNA.

zestawy danych bakteryjnych i Archaealnych 16S rRNA są dostępne z BioProject (odpowiednio PRJNA33175 i PRJNA33317). Dostępna jest również niestandardowa baza danych BLAST („16S ribosomal RNA sequences (Bacteria and Archaea)”).

wirusy

model danych RefSeq dla wirusów różni się od modelu innych organizmów. Ogólnie rzecz biorąc, dla każdego gatunku wirusa tworzony jest tylko jeden kompletny Genom RefSeq. Czasami w obrębie danego gatunku wirusa tworzy się wiele rekordów RefSeq w celu odzwierciedlenia dobrze zdefiniowanych genotypów lub ważnych szczepów laboratoryjnych i / lub dzikich. Dodatkowe genomy dla danego gatunku są walidowane pod kątem taksonomii i kompletności, a następnie indeksowane jako sekwencja „sąsiadów” (52). Zarówno genomy RefSeq, jak i sąsiadujące są dostępne za pośrednictwem wyspecjalizowanego Źródła genomu wirusowego (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/) oraz ze stron Entrez Nucleotide and Genome wykorzystujących linki do „genomu RefSeq dla gatunków” i „innych sekwencji genomu INSDC” (52).

Taksonomia jest głównym problemem genomiki wirusowej, ponieważ istnieje 3186 gatunków wirusów oficjalnie uznanych przez Międzynarodowy Komitet taksonomii wirusów (ICTV) (53) i 4834 pełnych genomów zarówno oficjalnych, jak i tymczasowych gatunków wirusów dostępnych w bazach danych INSDC. Narzędzie NCBI Pairwise Sequence Comparison (PASC) zostało opracowane, aby pomóc w klasyfikacji genomów wirusowych w oparciu o globalne i/lub lokalne dopasowania między genomami (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/pasc/). Zakres tego narzędzia został rozszerzony o szereg rodzin wirusów i innych grup taksonomicznych, a także został wykorzystany do wsparcia rozgraniczenia nowych kryteriów taksonomicznych (54-57).

innym pojawiającym się problemem w genomice wirusowej jest niespójna i/lub niedokładna adnotacja wśród powiązanych sekwencji genomu wirusa. Kwestia ta często odzwierciedla różne procesy adnotacji i trwające prace eksperymentalne i może prowadzić do dezorientacji wśród konsumentów danych i utrudniać analizę porównawczą między genomami. Ten problem jest rozwiązywany w zasobie NCBI Virus Variation (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/variation/), gdzie stosowane są potoki obliczeniowe, aby zapewnić aktualną, znormalizowaną adnotację dla kilku wirusów (58). Obecnie rurociągi te obliczają znormalizowane granice genów i białek dla wszystkich sekwencji wirusa grypy, wirusa dengi i wirusa Zachodniego Nilu oraz standaryzowane nazwy genów i białek i terminy metadanych dla tych i dwóch innych wirusów, koronawirusa układu oddechowego Bliskiego Wschodu i Ebolawirusa. Te ustandaryzowane dane są następnie wykorzystywane w wyspecjalizowanym, zorientowanym na metadane interfejsie wyszukiwania, który ułatwia pobieranie sekwencji w oparciu o określone kryteria biologiczne.

utrzymanie aktualnych, powszechnie akceptowanych standardów adnotacji wymaga ciągłej współpracy z większym środowiskiem naukowym. Grupa robocza NCBI Viral Genome Annotation Working Group została powołana w celu wykorzystania konsorcjów publicznych baz danych, centrów sekwencjonowania i grup badawczych w celu opracowania standaryzowanej adnotacji sekwencyjnej, a także wyizolowania schematów nazewnictwa dla różnych grup wirusów (59-63). Takie podejście nie tylko ustanawia standardy adnotacji wirusowej, ale także reprezentuje te standardy w bieżącym rekordzie RefSeq, zapewniając dostępność dla wszystkich użytkowników baz danych i zgłaszających. Podobna współpraca jest również konieczna, aby wspierać zasoby interpretacyjne o wartości dodanej, takie jak baza danych dotyczących interakcji z ludźmi HIV-1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/retrowirusy/hiv-1/interakcje/) (64). Współpracownicy z Southern Research Institute zapewniają udokumentowane HIV-1, ludzkie interakcje molekularne kuratorem z literatury i NCBI utrzymuje przyjazny dla użytkownika zasób, gdzie użytkownicy mogą kwerendy dla określonych rodzajów interakcji i znaleźć więcej informacji na temat genów zaangażowanych.

przyszłe kierunki

projekt RefSeq jest wyjątkowy w oferowaniu zbioru danych sekwencji referencyjnych transkryptów, białek i genomów, który obejmuje wszystkie królestwa życia i został aktywnie utrzymywany i aktualizowany w czasie, aby włączyć ulepszone strategie obliczeniowe, nowe typy danych i nową wiedzę. Wykazaliśmy zdolność i zdolność reagowania na niedawny szybki wzrost liczby sekwencjonowanych genomów przesyłanych do baz danych INSDC. Zdefiniowaliśmy zróżnicowany zestaw polityk i strategii kuratorowania i adnotacji gatunków eukariotycznych, prokariotycznych i wirusowych, aby zaspokoić różne potrzeby społeczności specyficznych dla organizmów. Zestaw danych RefSeq jest szeroko stosowany jako standard odniesienia dla wielu różnych analiz, w tym zastosowań klinicznych u ludzi i patogenów, genomiki porównawczej, testów ekspresji, interpretacji zmienności sekwencji oraz konstrukcji tablic i sond. W NCBI zbiór danych RefSeq jest zintegrowany z wieloma zasobami, w tym Assembly, BLAST, Epigenomics, Gene (gdzie adnotacja RefSeq jest podstawową podstawą większości wpisów genów), Genome, dbSNP, dbVar, variation Viewer i więcej.

będziemy nadal koncentrować się na ręcznym doborze, aby poprawić informacje strukturalne i funkcjonalne dla ludzkich i innych genomów kręgowców. Nasze konserwatywne podejście do ręcznego doboru zapewnia stałą wysoką jakość i niezawodność ludzkich, mysich i innych „znanych” rekordów RefSeq, które służą potrzebom tych, którzy potrzebują dobrze obsługiwanej definicji alternatywnych eksonów (mniej fałszywych alarmów). Dodanie danych RNA-Seq do naszego potoku adnotacji znacznie zwiększyło naszą adnotację alternatywnych wariantów splicingu jako modelu RefSeqs, aby zaspokoić potrzeby tych, którzy chcą bardziej kompleksowej, ale nadal dobrze wspieranej definicji exome (mniej fałszywych negatywów). Podczas gdy zarówno znane, jak i modelowe RefSeqs zgłaszają dowody wsparcia w rekordzie sekwencji, używają do tego różnych podejść. Przyszłe wysiłki będą ukierunkowane na harmonizację raportowania dowodów zarówno dla „znanych”, jak i „modelowych” RefSeqs, aby użytkownicy mogli łatwiej zidentyfikować te informacje. W niedalekiej przyszłości dodamy również nowy typ danych do kolekcji RefSeq dla ludzi i myszy, aby reprezentować doświadczalnie zgłaszane elementy regulacyjne i funkcjonalne ze znanymi (lub rozsądnie wnioskowanymi) konsekwencjami funkcjonalnymi.

w przypadku genomów prokariotycznych kontynuujemy prace nad udoskonaleniem aspektów adnotacji strukturalnej generowanej przez rurociąg adnotacji genomu prokariotycznego. Nasza praca nad nowym podejściem do zarządzania informacjami funkcjonalnymi jest nadal udoskonalana i zostanie opisana w innym miejscu. Przewidujemy ponowną adnotację całego zestawu danych genomów Prokaryotycznych RefSeq, gdy pojawią się nowe wersje naszego potoku adnotacji prokaryotycznej (w celu poprawy adnotacji strukturalnej). Decyzja o adnotacji wszystkich prokariotów RefSeq przy użyciu jednej metody, wraz z samą objętością tego zbioru danych, wymaga innego podejścia, które wykorzystuje wiele źródeł dowodów w celu dostarczenia informacji funkcjonalnych. Nazwy białek będą aktualizowane na bieżąco według rodzin białek lub kategorii typów dowodów. Nasze cele na nadchodzący rok obejmują większą integrację Rfam (65) w naszym potoku adnotacji, rozszerzoną współpracę, ulepszone nazwy białek i raportowanie dowodów potwierdzających zapis sekwencji białek.

chcielibyśmy podziękować społeczności naukowej za konstruktywne informacje zwrotne, sugestie, raporty o błędach i współpracę w ciągu ostatnich 15 lat, które przyczyniły się do jakości i dokładności reprezentowanej sekwencji, adnotacji strukturalnej i adnotacji funkcjonalnej.

finansowanie

Finansowanie opłaty otwartego dostępu: wewnętrzny program badawczy Narodowego Instytutu Zdrowia, National Library of Medicine.

Oświadczenie o konflikcie interesów. Brak deklaracji.

i in.

i in.