RNazy są jak baddie superbohater wśród enzymów laboratoryjnych. Są wszechmocne, destrukcyjne i pozornie niezniszczalne.
To dlatego, że zostały one stworzone przez złych władców, wyłącznie w celu utrudnienia życia dzielnym naukowcom, którzy codziennie walczą o produkcję wysokiej jakości, nienaruszonych prepów RNA.
Ok, żartuję z części overlords. Ale dlaczego RNases mają te wszystkie super moce w ogóle? I co możesz zrobić, aby ich pokonać? Przekonajmy się.
super-moce RNases, wyjaśnione.
RNazy są wszechmocne
To prawda. RNazy występują we wszystkich typach komórek i organizmach od prokariotów do eukariotów. tzn. są wszędzie. Jest to jeden z głównych powodów, dla których są one takim problemem w laboratorium. Unoszą się w powietrzu, na każdej powierzchni ciała. Co oznacza, że zanieczyszczają wszystko, czego dotknęło powietrze lub jakakolwiek powierzchnia twojego ciała. Czyli w zasadzie wszystko. Ponadto RNase a w szczególności bardzo silnie adsorbuje się szkłem, co czyni go jeszcze trudniejszym do usunięcia z butelek itp.
RNazy są wysoce destrukcyjne
RNazy mają na ogół bardzo wysoką aktywność specyficzną wobec ich substratu (RNA). Oznacza to, że najmniejsza ilość RNazy może łatwo rozerwać cenne prepy RNA. Nawiasem mówiąc, jest to również jeden z powodów, dla których Rnaza (Rnaza A) była pierwszym enzymem, który wywnioskował swój mechanizm katalizy (Findlay i wsp.1962).
RNazy są pozornie niezniszczalne
wykazują regenerację przypominającą Feniks po autoklawowaniu
mądrość Konwencyjna mówi, że jeśli autoklawujesz RNazy, denaturują, ale następnie renature i ponownie zyskują częściową funkcję po ochłodzeniu. To niesamowite, legendarne męstwo jest możliwe dzięki serii wewnątrzcząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych, które utrzymują strukturę nienaruszoną, nawet po zerwaniu wiązań wodorowych, które normalnie utrzymują strukturę białka 3D. Jak wszystkie bajki, jest to do pewnego stopnia prawdziwe. Ale czytaj dalej, a dowiemy się, że ta szczególna super-moc została podkręcona przez spin doctors w RNase Baddies Inc.
nawet EDTA ich nie powstrzyma!
w przeciwieństwie do innych nukleaz, wiele Rnaz nie wymaga jonów metali do katalizy, ponieważ używają 2-pierwszorzędowej grupy hydroksylowej substratu RNA jako reaktywnego gatunku, więc po prostu dodanie TE nie hamuje ich, jak w przypadku nukleaz pożerających DNA.
Jak pokonać złego Rnazesa
nie denerwuj się, kolego. RNazy mogą być groźnymi wrogami, ale mają słabości, które możemy wykorzystać.
kopać je w h ’ S
RNazy opierają się na resztach histydyny w ich miejscu aktywnym do katalizy. Tak więc pirokarbonian dietylu (DEPC), który jest specyficznym dla histydyny czynnikiem alkilującym, może je inaktywować. Autoklawowanie usunie następnie DEPC, aby zapobiec alkalyacji innych białek w tobie lub Twoich próbkach.
autoklawowanie działa, do pewnego stopnia
znacznie legendarna niezniszczalność Rnaz w obliczu autoklawowania jest prawdziwa, ale także bardzo przesadzona, jak wspomniałem powyżej. Ładne małe badanie Ambion wykazało, że RNazy (lub przynajmniej Rnaza A) nie są całkowicie odporne na autoklawowanie. Raczej ich aktywność jest zdziesiątkowana przez autoklawowanie, ale niewielka część aktywności RNazy pozostaje po autoklawowaniu.
ale jeśli oczywiście mała ilość RNazy nadal ma dużą moc RNA. Oznacza to, że rutynowe autoklawowanie w ramach procedur dekontaminacji RNase jest z pewnością warte zachodu – po prostu nie możesz na nim polegać, aby usunąć całą aktywność.
nie wytrzymują (suchego) ciepła
podczas gdy mokre ciepło (autoklawowanie) częściowo niszczy RNazy, nie ma nadziei, że wytrzymają suche ciepło. Suche ciepło utlenia RNazy-każde inne białko, bez względu na ich wytrzymałość. Więc do czyszczenia szkła, kilka godzin w 180 degC powinno to zrobić.
środki chemiczne
do czyszczenia powierzchni, RNazy, tak wytrzymałe jak są, nie znoszą takich rzeczy jak nadtlenek wodoru, silne kwasy/zasady, Trizol itp. Są one powszechnie stosowane, aby pozbyć się nawet najtrudniejszych RNases.
Kryptonit dla Rnaz: Inhibitory
chyba najlepszą bronią, jaką mamy w zbrojowni przeciwko Rnazom, są inhibitory Rnaz. Najczęściej komercyjnymi inhibitorami RNazy są inhibitory rybonukleazy łożyskowej (ri). Jako ktoś, kto spędza rok próbując doskonalić hybrydyzacje RNA in situ bez pomocy inhibitora RNazy (z powodu fałszywej ekonomii przez mojego szefa!), Wiem jak dobry jest ten Kryptonit RNase. Jedna mikrolitra RI i nagle moje eksperymenty zaczęły działać.
mówię, że jest to najlepsza broń w naszej zbrojowni przeciwko Rnazom, ponieważ w przeciwieństwie do wszystkich innych rozwiązań wymienionych powyżej, inhibitory RNazy są specyficzne, więc możesz (ogólnie) umieścić je tam, gdzie liczy się twój przepływ pracy i uzyskać ochronę, której potrzebujesz przed złymi. Nie bądź bez tego, jeśli pracujesz z RNA.
czy to ci pomogło? Następnie podziel się z siecią.