Rola bakterii Wolbachia w niekompatybilnościach rozrodczych i strefach hybrydowych chrząszczy Diabrotica i świerszczy Gryllus

wyniki i dyskusja

Diabrotica to nowy światowy rodzaj chrząszczy chryzomeliowych, który jest głównie Neotropikalny w swojej dystrybucji i którego pochodzenie prawdopodobnie pochodzi z regionu Środkowej lub tropikalnej Ameryki Południowej (28). Obecnie jego zasięg obejmuje większość Stanów Zjednoczonych na wschód od Gór Skalistych i północ od 35 równoleżnika, Stany Meksyk na północny zachód od Durango (z wyłączeniem Baja, CA), południowe obszary Ontario w Kanadzie i niedawne wprowadzenie do Europy Wschodniej (29). Zasięg występowania D. V. zeae obejmuje obszar od Gwatemali przez środkowy Meksyk do panhandle Teksasu i części południowej Oklahomy (28). Rozszerzona produkcja kukurydzy mogła również ułatwić przemieszczanie się D. V. zeae na północ od Meksyku, co spowodowało wtórny kontakt z D. V. virgifera w północnym Teksasie, gdzie podgatunek hybrydyzuje (13).

dorośli z D. V.zeae pobrani ze Stephenville i Uvalde w południowym Teksasie nie byli zakażeni Wolbachią, podczas gdy dorośli z D. V. virgifera z 15 miejsc w Stanach Zjednoczonych i kanadyjskiej dystrybucji D. V. virgifera wykazali dodatni wynik na obecność Wolbachia, z wyjątkiem dwóch miejsc w Duncan i Willcox, AZ. 21 dorosłych osobników z trzech miejsc w północnej strefie hybrydowej Teksasu również uzyskało wynik pozytywny, w tym 5 osobników o wzorcach indeksowych w zakresie zmienności D. V. zeae (J. Krysan personal communication). Sekwencje genu Ftsz Wolbachii od pojedynczych osobników z Urbana, IL, Moriarty, NM i Blacksburga, VA były identyczne. Dodatkowo, trawienie DraI fragmentu ftsZ otrzymanego z (i) starterami general B-specific, (ii) ftszf1 i (iii) ftszr1 wykazało, że populacje D. V.virgifera ze wszystkich pobranych próbek posiadają ten sam szczep Wolbachia. Analiza filogenetyczna z wykorzystaniem genu 16S rRNA umieściła ten szczep w pozycji bazalnej z nierozwiązanym pokrewieństwem z innymi szczepami Wolbachia (wyniki nie pokazane). Gen ftsZ (23, 30) zidentyfikował również Wolbachia z D. V.virgifera jako szczep bazalny i różniący się od większości innych szczepów z grupy a (Fig. 1). Biorąc pod uwagę spójność infekcji i rodzaju szczepu w całej dystrybucji D. V.virgifera, jak również szybkie rozprzestrzenianie się tego gatunku w Ameryce Północnej, sugerujemy, że infekcja wystąpiła w południowo-zachodnich Stanach Zjednoczonych lub północno-zachodnim Meksyku przed ekspansją D. V. virgifera na wschód w Stanach Zjednoczonych i Kanadzie. Niezakażony D. v. populacje virgifera w południowej Arizonie mogą być pozostałościami pierwotnej niezakażonej populacji lub mogą reprezentować izolowane populacje, które utraciły infekcję.

D. V.virgifera i D. V. zeae są morfologicznie bardzo podobne (13), z wyjątkiem czarnej plamki elytralnej, która jest charakterystyczna U D. V. virgifera i ogranicza się do kości ramiennej lub jest nieobecna u D. V. zeae. Podgatunki nie są izolowane ekologicznie, ponieważ oba występują na kukurydzy; ani nie są tymczasowo izolowane, ponieważ mają ten sam mechanizm diapauzalny. Badania behawioralne nie wykazują żadnych wstępnych barier w rozmnażaniu, ponieważ oba podgatunki reagują na feromony tej samej płci i nie dokonano żadnej dyskryminacji podczas eksperymentów z wyborem godowym (13). Po krzyżowaniu dwa podgatunki były płodne w jednym kierunku, tj. samce D. V. zeae ze środkowego Meksyku pokrywały się z samicami D. V. virgifera z Dakoty Południowej, podczas gdy krzyż odwrotny dawał bardzo nieliczne lub żadne żywotne potomstwo (14). Aby sprawdzić, czy niezgodność jednokierunkowa jest spowodowana zakażeniem Wolbacha zidentyfikowanym w D. v. virgifera, zrobiliśmy krzyżówki z zakażoną i leczoną tetracykliną D. V. virgifera. Wyniki wskazują, że szczep Wolbachia, który infekuje D. v. virgifera, jest zdolny do indukowania ciężkiej niezgodności cytoplazmatycznej, przy czym tylko 0,4% z 5627 jaj wylęgających się, gdy zakażone samce D. v. virgifera zostały skrzyżowane z niezakażonymi samicami D. V. virgifera leczonymi tetracykliną (Tabela 1, krzyżówka d).

stworzyliśmy również kolonię laboratoryjną D. V. zeae z okazami ze Stephenville, TX i potwierdziły, że samice D. V.zeae skrzyżowane z samcami D. V. virgifera produkują bardzo niewiele lub nie mają potomstwa, podczas gdy krzyżowanie wzajemne prowadzi do normalnego wylęgu jaj (Tabela 1, krzyżowanie F I h) (14). Gdy powtórzyliśmy krzyżówki z użyciem samców D. V.virgifera leczonych tetracykliną, niezgodność już nie istniała, a wskaźniki wylęgu jaj nie różniły się znacząco od wskaźników kontrolnych (Tabela 1, krzyżówka g), potwierdzając, że jednokierunkowa niezgodność krycia między tymi dwoma podgatunkami jest spowodowana obecnością Wolbachia U D. V. virgifera.

podobne niezgodności rozrodcze odnotowano również między niektórymi członkami rodzaju Gryllus w Ameryce Północnej. Rodzaj Gryllus jest rozpowszechniony na całym świecie z wyjątkiem wschodniej Azji i Pacyfiku (31). W oparciu o liczbę gatunków możliwe jest, że rodzaj pochodzi z nowego świata lub Afryki, gdzie odnotowano kilka rodzajów podobnych do Gryllus (32). W Ameryce Północnej rodzaj Gryllus ma kilka blisko spokrewnionych gatunków, z których niektóre są trudne do odróżnienia na podstawie samych cech morfologicznych. Na początku wieku grupa ta była uważana za pojedynczy gatunek o wysokim stopniu zmienności (33). Późniejsze prace wykorzystywały głównie pieśni wywołujące dyskryminację niektórych gatunków (34).

kilka gatunków z rodzaju Gryllus zostało wykazanych jako jednokierunkowo lub dwukierunkowo niezgodne. Jednokierunkowa niezgodność między samcami G. pennsylvanicus a samicami G. firmus we wschodnich Stanach Zjednoczonych (19) odzwierciedla niezgodność D. V.virgifera i D. V. zeae. Odkryliśmy, że, z wyjątkiem G. firmus, okazy wszystkich gatunków Gryllus, które badaliśmy, są zwykle zarażone Wolbachią, czasami więcej niż jednym szczepem (Fig. 2 i 3). Niezgodności zgłaszane między różnymi gatunkami z tego rodzaju mogą być wyjaśnione przez zakażenie tą bakterią. Nasze badania wykazały następujące wzorce infekcji. Populacje G. integer pobrane z Humboldt County, NV i Wayne County, UT, są zakażone tym samym szczepem bakterii Wolbachia, które nazywamy ” typem integer.”Populacja pobrana z Davis, CA, również została zakażona typem integer, z wyjątkiem jednego osobnika, który posiadał ten sam szczep Wolbachia, co u G. rubens, który określamy jako” typ Rubensa.”Populacja pobrana z Las Cruces, NM, miała dwie osoby, które zostały zakażone szczepem Wolbachia typu Rubensa i trzy osoby, które były podwójnie zakażone szczepami typu Rubensa i integer. Populacje G. integer w Austin i Dallas, TX, również posiadały ten sam szczep bakteryjny, który na podstawie genu 16S rRNA i genu ftsZ wydaje się identyczny z tym znalezionym u G. Rubensa Z Lake Placid i Gainesville, FL. Ten szczep typu rubens występuje również u okazów G. ovisopis pobranych z Gainesville. Mogliśmy zdobyć tylko okazy G. asymilacja z kultur laboratoryjnych T. Walkera i T. Zery; ta ostatnia kultura pochodzi z Kolonii T. Walkera. Osobniki z obu kultur zostały zarażone tym samym szczepem, którego Sekwencja genu ftsZ była identyczna ze szczepem Wolbachia typu Rubensa. Sekwencja fragmentu genu 16S rRNA wskazuje, że szczep tego gatunku ma transwersję w pozycji 380 E. coli z guaniny do tyminy, która w E. coli odpowiada pierwszej pozycji w pętli tetra gcaa. U szczepu” assimilis-type ” pętla składa się z TAAA. Transwersja ta nie występuje w żadnej innej znanej do tej pory sekwencji Wolbacha 16S rRNA.

populacja G. pennsylvanicus wykazuje bardziej złożony schemat zakażenia. Przez większość dystrybucji, którą pobraliśmy, G. pennsylvanicus jest polimorficzny dla rodzaju infekcji. Populacja pobrana w Lethbridge, Alberta, Kanada, wykazała obecność szczepu Wolbachia różniącego się od szczepu G. rubens, G. assimilis, G. integer i G. ovisopis. Nazywamy ten szczep szczepem „pennsylvanicus-type”. Spośród 39 zarażonych okazów pobranych ze środkowego Illinois, 38 nosiło szczep pennsylvanicus, podczas gdy jeden egzemplarz nosił szczep rubens. Miejscowość 150 km na południe, Farina, il, wykazała mieszankę osób, które zostały zainfekowane albo szczepem pennsylvanicus typu lub rubens typu lub z obu. Z dwóch próbek pobranych z Ann Arbor, MI, jeden nosił Szczep typu rubens, a drugi był podwójnie zakażony szczepami typu pennsylvanicus i rubens. Dla populacji pobranej w London, Ontario, Kanada, 215 km na północny wschód od Ann Arbor, z 19 zarażonych osób, 10 nosiło Typ pennsylvanicus, jeden nosił Typ Rubensa, a osiem było podwójnie zakażonych szczepami pennsylvanicus i Rubensa (Fig. 3A). Ten polimorficzny wzór utrzymuje się w okazach G. pennsylvanicus zebranych z Vermont i Pensylwanii. W Wirginii i Karolinie Północnej wykryliśmy tylko osoby zakażone szczepami pennsylvanicus lub rubens. Ludność G. pennsylvanicus w Ameryce Północnej jest mieszaniną osób zakażonych typem Rubensa lub pennsylvanicus, jak również osób podwójnie zakażonych zarówno szczepami, jak i osób, które nie są zakażone (Fig. 3). Nasze dotychczasowe wyniki wskazują, że w populacjach G. pennsylvanicus we wschodniej Ameryce Północnej zakażenie typu Rubensa występuje częściej na północy niż na południu (rys. 3A). Ponadto stwierdzono, że w większości miejscowości, w których występują oba szczepy, obecne są również osobniki podwójnie zakażone (Fig. 2 i 3a).

w wyniku „popędu” związanego z rozprzestrzenianiem się infekcji Wolbachia (35), proponujemy, aby struktura genetyczna populacji G. pennsylvanicus, z wyjątkiem Lethbridge w Kanadzie, została dotknięta obecnością szczepów Wolbachia typu rubens i pennsylvanicus. Dlatego też będziemy odnosić się do próbek G. pennsylvanicus zebranych w tych regionach jako Gryllus near (nr.) pennsylvanicus, aby odzwierciedlić wieloznaczność ich statusu taksonomicznego narzuconego przez typy infekcji występujące w tych populacjach.

próbkowaliśmy G. firmus z Gainesville i Archbold Biological Station w Lake Placid, FL, i z Fort Fischer, NC. 32 Z 35 próbek pobranych z tych miejsc nie zostało zakażonych. Trzy zainfekowane osoby pochodziły z Gainesville, FL. Stwierdzono, że dwa nosiły Typ Rubensa, a trzeci szczep Wolbachia typu pennsylvanicus (Fig. 2 i 3a). To odkrycie sugeruje, że zakażenie tych dwóch szczepów bakterii przenosi się do populacji G. firmus, zwłaszcza w świetle faktu, że G. pennsylvanicus nie jest znany z Gainesville, FL.

analiza zależności pomiędzy różnymi szczepami, które zbadaliśmy u gatunku Gryllus przy użyciu genu Ftsz wskazuje, że szczepy typu integer i rubens tworzą grupę monofiletyczną i nie są blisko spokrewnione ze szczepem typu pennsylvanicus, który jest bazalny dla wszystkich innych znanych do tej pory szczepów Wolbachia z grupy B. Szczep Wolbachia zgłaszane przez Werren et al. (23) u G. pennsylvanicus należy do typu Rubensa (rys. 2).

proponujemy, aby infekcje u wyżej wymienionych członków rodzaju Gryllus wyjaśniały obserwowane niezgodności godowe uzyskane przez Smitha i Cade 'a (17), Cade’ a i Tyshenko (18) i Harrisona (19) i wskazywały na możliwą rolę Wolbacha w specjacji niektórych członków tego rodzaju. Niezgodność dwukierunkowa zaobserwowana między G. rubens i G. integer jest prawdopodobnie wynikiem zakażenia dwoma różnymi szczepami Wolbachia występującymi u tych dwóch gatunków. Kompatybilność G. Rubensa z Florydy z G. liczbę całkowitą z Teksasu (17, 18) można wyjaśnić, ponieważ populacje te przenoszą bakterie typu Rubensa. Nasze dane potwierdzają wniosek Smitha i Cade ’ a (17), że G. rubens i G. integer z Teksasu mogą być tymi samymi gatunkami, pomimo różnic w ich utworach o stopniu zwykle używanym do różnicowania gatunków.

biorąc pod uwagę, że G. pennsylvanicus jest zakażony Wolbachią, a G. firmus zwykle nie, krzyże pokazujące, że samce G. pennsylvanicus są niezgodne z samicami G. firmus (19), można interpretować jako wynikającą z niezgodności cytoplazmatycznej spowodowanej przez Wolbachię. Nasza interpretacja jest dodatkowo potwierdzona przez mitochondrialny wzór obserwowany w tych dwóch populacjach, a mianowicie, że G. firmus i G. pennsylvanicus mają różne typy mitochondrialne, dzięki którym te dwie populacje zostały zidentyfikowane; jednakże, chociaż G. pennsylvanicus mtDNA łatwo introgresuje się w populacji G. firmus, odwrotność nie występuje (36). Wzór ten byłby obserwowany, gdyby G. pennsylvanicus był zakażony Wolbachią, ponieważ większość osobników w strefie hybrydowej byłaby wynikiem potomstwa zakażonych samic, które w tym przypadku nosiłyby G. Typ mitochondrialny pennsylvanicus wraz z dziedziczoną przez matkę infekcją Wolbachia.

jednokierunkowa niezgodność między samcami G. ovisopis, które przenoszą bakterie typu rubens, a samicami G. firmus (T. Walker, personal communication) również może być interpretowana w świetle tej infekcji. Brak potomstwa z krzyżówek między samcami G. pennsylvanicus i G. ovisopis z samicami G. firmus wskazuje, że te dwa szczepy mogą powodować niezgodności. Wiemy, że G. ovisopis i G. rubens nosi ten sam szczep Wolbachia, więc prawdopodobną przyczyną dwukierunkowej niezgodności obserwowanej między G. rubens i G. pennsylvanicus są różne szczepy Wolbachia, które mogą przechowywać.

używając genu ftsZ, zaobserwowaliśmy 39 różnic bp pomiędzy szczepami typu pennsylvanicus i rubens, 41 różnic między szczepami typu pennsylvanicus i integer oraz 22 różnice między szczepami typu rubens i integer. Dla porównania, w tym samym segmencie genu istnieje tylko jedna zmiana zasad pomiędzy dwukierunkowo niekompatybilnymi szczepami Wolbachia występującymi u Drosophila simulans Hawaii i D. simulans Riverside (23). Opierając się na tych dowodach, jak również na niezgodnościach zaobserwowanych w kryciu pomiędzy odpowiednimi gatunkami Gryllus, przewidujemy, że szczepy typu rubens -, integer-i pennsylvanicus są niezgodne dwukierunkowo.

Strefa hybrydy pomiędzy G. pennsylvanicus i G. firmus wyznaczona przez Harrisona i Arnolda (20) jest bardziej złożona niż interakcja gatunkowa. Niektóre z miejsc, które próbkowaliśmy wzdłuż Blue Ridge i Appalachów, wykazują niejednolity rozkład typów infekcji w populacjach G. pennsylvanicus (Fig. 3A). Tak więc w tym regionie mogą wystąpić możliwe interakcje między populacjami niezakażonych szczepów Wolbachia typu rubens – lub pennsylvanicus G. firmus, G. nr. pennsylvanicus zakażonych Wolbachia typu rubens-lub pennsylvanicus oraz G. nr pennsylvanicus zakażonych szczepami Wolbachia typu rubens – i pennsylvanicus. Infekcja Wolbachia u wspomnianego gatunku Gryllus, a w szczególności liczne rodzaje infekcji występujące u G. nr. populacja pennsylvanicus wskazuje, że ograniczenie przepływu genów może wystąpić w populacji z powodu różnic w typie zakażenia. Sukces reprodukcyjny osobników w tych populacjach będzie zależał od ich profilu infekcji, a także od profilu osobników, z którymi się łączą. Koncepcja tego, co stanowi gatunek z rodzaju Gryllus, musi zostać ponownie oceniona w świetle infekcji Wolbachia, które są przez nie przenoszone.

infekcje z Wolbachią mogą przebić się przez populację w wyniku przewagi, jaką mają zakażone samice nad niezakażonymi samicami (35). Biorąc pod uwagę, że G. wykazano, że pennsylvanicus i G. firmus hybrydyzują w laboratorium (19) i że istnieją dowody na hybrydyzację w terenie (21), obecny rozkład G. firmus może być interpretowany jako reliktowy, z szerszego obszaru, przez który przemieszczała się populacja zakażona. Alternatywnym wyjaśnieniem może być wiele miejsc infekcji tym samym szczepem Wolbachia, ale nie mamy informacji o tym, w jaki sposób bakterie Wolbachia są przenoszone poziomo między gatunkami lub z jaką częstotliwością są nabywane. Dlatego wybieramy najbardziej pobieżne wyjaśnienie, że infekcja powstała w jednym miejscu, a następnie rozprzestrzeniła się. Rzeczywiście, nasze dane sugerują, że infekcje Wolbachia mają składową geograficzną i że rodzaj Rubensa pochodzi z południa, gdzie dominuje (rys. 3A). Jednak w populacji G. nr. pennsylvanicus we wschodniej Ameryce Północnej zakażenie typu Rubensa jest powszechne w populacjach pobranych z północy. Miejscowości te są najdalej oddalonymi punktami od populacji Gryllusa zakażonego szczepem typu rubens i daleko od jakiegokolwiek zgłoszonego G. populacje Rubensa (rys. 3 a i b). Sugerujemy, że infekcja typu Rubensa przeniosła się przez populację Gryllus, która istniała we wschodniej Ameryce Północnej przed przemieszczeniem się szczepu pennsylvanicus na wschód.

w populacjach Gryllus podwójnie zakażone osoby mogą być wynikiem presji selekcyjnej w populacji, w której istnieją dwa szczepy bakterii, które są niezgodne dwukierunkowo (Fig. 2 i 3a). W takich okolicznościach osoby podwójnie zakażone byłyby wybierane, ponieważ, jeśli obie infekcje mogą przetrwać w jednym krykiecie, samice byłyby kompatybilne z samcami noszącymi albo szczep bakteryjny. Trzecia infekcyjna Zamiana osobników podwójnie zakażonych może nastąpić w populacji, ponieważ podwójnie zakażone samice mają przewagę nad pojedynczo zakażonymi samicami, które mogły rozmnażać się z powodzeniem tylko z samcami zakażonymi tym samym szczepem Wolbachia. Odnotowano liczne zakażenia różnych taksonów owadów (37-39), a podwójnie zakażone samce okazały się częściowo lub całkowicie niezgodne z pojedynczo zakażonymi samicami innych owadów (37-41). Przewidujemy, że podwójne infekcje mogą wystąpić w miejscach, gdzie pojedyncze infekcje z dwoma dwukierunkowo niekompatybilnymi szczepami Wolbacha występują w tym samym lub bardzo blisko spokrewnionym taksonie.

w badaniach przesiewowych umiarkowanych taksonów owadów wykorzystujących PCR ze specyficznymi starterami 16S rRNA stwierdziliśmy, że 16% z 615 taksonów owadów z różnych rodzin i rzędów było zakażonych Wolbachią (RG i HMR, niepublikowane dane), a podobne wskaźniki infekcji uzyskano u owadów tropikalnych (42). Biorąc pod uwagę tę częstotliwość infekcji, przewidujemy, że inne strefy hybrydowe owadów zostaną określone przynajmniej częściowo przez infekcję Wolbacha i niezgodność cytoplazmatyczną. Niektóre rodzaje owadów mogą być bardziej podatne na zakażenie Wolbachią w wyniku ich naturalnej historii. Specjacja w obrębie tych grup musi być zbadana pod kątem roli jaką odgrywa Wolbachia.