dyskusja
nasze wyniki pokazują, że dzięki starannemu planowaniu, szkoleniu i Standaryzacji odczynników i protokołów, międzynarodowa sieć laboratoryjna ma zdolność do wytwarzania spójnych i porównywalnych wyników testu HAI. Pięć publicznych laboratoriów zdrowia i akademickich uczestniczących w tym badaniu było częścią PCIRN, który został opracowany w celu zwiększenia krajowej zdolności Kanady do wspierania badań nad szczepionkami i innymi grypami w przypadku pandemii. W sytuacji pandemii, przy dużych objętościach, wysokim ciśnieniu i geograficznie rozproszonych testach grypy, standaryzacja testu HAI będzie miała ogromne znaczenie dla zapewnienia porównywalności wyników między laboratoriami. Laboratoria PCIRN wykazały wysoki standard odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej, z 99,8% dokładnością duplikatów (99.2% do 100% na laboratorium), 97,8% mian w 2-krotnym zakresie w ciągu powtarzanych dni badania (93,3% do 100% na laboratorium) i 91,1% surowic testowych wykazujących odtwarzalność mian w każdym powtórzeniu protokołu sześciokrotnego testu (60% do 100% na laboratorium). Odtwarzalność międzylaboratoryjna była również wysoka, z medianą mian we wszystkich replikatach z czterech laboratoriów niereferencyjnych w granicach 2-krotnie od laboratorium referencyjnego dla 100% badanych surowic. W przeliczeniu na laboratorium miano wynosiło 94,3% i 98.9% próbek oznaczonych ilościowo w pojedynczym rozcieńczeniu laboratorium referencyjnego i miana konsensusu, odpowiednio (zakresy, 85% do 100% I 95% do 100%). Te wartości procentowe spełniają typowe progi akceptowalności dla zmienności testu HAI (tj. co najmniej 80% próbek mieszczących się w granicach 1 rozcieńczenia wartości nominalnych i/lub GMT wszystkich testów ). Swoistość testu HAI (100%) i czułość (87,5% do 100%) w laboratoriach PCIRN były podobnie dobrze zgodne z kryteriami akceptacji poprzednich badań (tj., 100% próbek ujemnych powinno określić ilościowo jako poniżej poziomu ilościowego, a co najmniej 80% próbek dodatnich powinno określić jako dodatnie).
w przypadku wewnątrzlaboratoryjnego składnika zmienności testu HAI powtarzalność w laboratoriach PCIRN wydaje się podobna do tej wykazanej w innych badaniach (5, 22). Jednym z zastrzeżeń tych poprzednich badań było to, że nie więcej niż trzy powtórzenia były badane, pomimo powszechnych praktyk walidacji testu immunologicznego polegających na badaniu sześciu lub więcej powtórzeń testów (24-27). W związku z tym nie jest jasne, czy ich dane są bezpośrednio porównywalne z wynikami ustalonymi w ramach sześciu testów w tym badaniu. Niemniej jednak, nasze wyniki od 0% do 6,7% (mediana, 0%) testów z wynikami różniącymi się ponad 2-krotnie od wyników innych powtórzeń testów wydają się porównywalne z 4,8% do 7,1% odnotowanymi wcześniej w jednym laboratorium (22) i 0% do 15% (mediana, 2%) w dziewięciu laboratoriach (5).
nasze ustalenia dotyczące odtwarzalności wysokiego miana HAI między geograficznie rozproszonymi laboratoriami PCIRN kontrastują z wcześniejszymi raportami wykazującymi znaczną zmienność między międzynarodowymi laboratoriami wykonującymi ten test (5, 6, 9-12). Na przykład dane z dużego wspólnego badania (11 laboratoriów) wykazały, że na próbkę GCVs wynosi od 84% do 803% (mediana GCV na wirusa wynosi 138%, 155% i 261% ). Inne badania donosiły o GCVs dla próbek H1N1 i H5N1, które obejmowały od 95% do 345% (11) i od 22% do 582% (6), A GMT różniły się między laboratoriami maksymalnie 80-krotnie (11) lub 128-krotnie (9). Podczas gdy poprzednie raporty często zawierały większą liczbę uczestniczących laboratoriów niż obecne badanie, nawet jeśli tylko sześć laboratoriów dostarczyło dane, mediana międzylaboratoryjnego GCV wynosiła 83% dla pięciu próbek H1N1, przy czym 80% z nich przekraczało czterokrotną różnicę między laboratoriami (11). Natomiast w obecnym badaniu mediana GCVs na wirusa wynosiła tylko 39% i 17%, przy czym 95% próbek mieściło się w czterokrotnej różnicy między laboratoriami. Jedna próbka przekroczyła 4-krotną różnicę; miano nie było wymierne dla tej próbki w jednym laboratorium, w związku z czym przypisywano najniższą wartość, a nie mierzono. Gdyby pominięto tę próbkę w analizach, maksymalny GCV wynosiłby 75,5%, co stanowiłoby wartość niższą od minimalnego GCV w innych badaniach. Chociaż próbka ta wykazała większą zmienność niż inne, ten niski zakres pomiarowy wydawał się generalnie mniej dokładny niż wyższe zakresy. Na przykład, GCV wahało się od 43,4% do 156,4% przy mianie od 10 do 80 w porównaniu do 11,1% do 53,1% przy wyższych mianach (Fig. 3). Wcześniej opisano również większą zmienność przy próbkach o niższym mianie (23) i prawdopodobnie przyczyniła się do niespójnej klasyfikacji seroprotekcji w obecnym badaniu dla trzech próbek H1N1 o mianach najbliższych progowi 40 (miana konsensusu 22, 24 i 43). Pomimo tego, dokładność diagnostyczna seroprotekcji w laboratoriach PCIRN pozostała wysoka (93,6%, gdy do określenia seroprotekcji użyto mian konsensusu i 89,5% w porównaniu z wartościami laboratoryjnymi odniesienia).
wysoka zgodność międzylaboratoryjnych mian HAI w laboratoriach PCIRN może dotyczyć starannej harmonizacji procedur oznaczania HAI i odczynników w całym PCIRN. Uczestnicy poprzednich badań, które wykazały wysoką zmienność międzylaboratoryjną, Zwykle stosowali metody oznaczania HAI, które różniły się między laboratoriami. Zmienne badania, które mogą przyczyniać się do zmienności wyników, obejmowały ilość dodanego wirusa, system hodowli wirusa (np.(5, 11, 12). Zaskakująco jednak, gdy Wood et al. dostarczyli uczestnikom komercyjnych i publicznych laboratoriów zajmujących się testowaniem szczepionek przeciw grypie sezonowej w Europie szczegółową standardową procedurę operacyjną oraz wspólne odczynniki/materiały, poinformowali oni, że zmienność międzylaboratoryjna nie uległa znaczącej poprawie (10). Autorzy spekulowali, że trwałe „lokalne zmiany techniczne”, a także różni dostawcy RBC, mogą mieć wpływ na odtwarzalność między laboratoriami, ale zauważyli, że dalsza standaryzacja była poza granicami możliwości ich badania. Późniejsze publikacje interpretowały te ustalenia jako wskazujące, że standaryzacja testu HAI między laboratoriami nie jest na ogół wykonalnym podejściem do harmonizacji wyników HAI w różnych laboratoriach (8, 12), a co najmniej jedna grupa próbowała opracować zmodyfikowany i bardziej solidny test HAI w celu wygenerowania bardziej wiarygodnych i powtarzalnych danych (22).
w obecnym badaniu laboratoria PCIRN ściśle przestrzegały standardowego, publicznie dostępnego protokołu badania HAI Światowej Organizacji Zdrowia, w którym punkty podlegające zmianom technicznym lub interpretacyjnym zostały zharmonizowane między laboratoriami przed rozpoczęciem badania. Kluczowe odczynniki (np. RDE, RBC, zapasy wirusów) otrzymano w jak największym stopniu od tych samych dostawców. Ponadto ograniczenie badań do jednego technologa w każdym miejscu badań pozwoliło na zwiększenie standaryzacji. W tym badaniu nie badano możliwego wpływu stosowania wielu pracowników w każdym laboratorium. Podczas gdy wykorzystanie wielu operatorów mogłoby potencjalnie zwiększyć zmienność, jedyne badanie, w którym zbadano tę możliwość dla testów HAI, nie wykazało żadnej znaczącej różnicy między wynikami dwóch operatorów w tym samym laboratorium (22).
potencjalne różnice między laboratoriami w szczepach wirusa hodowanych do wykorzystania w teście zostały zminimalizowane między laboratoriami PCIRN poprzez wykorzystanie zapasów nasion wirusa z jednego źródła, które były hodowane w tej samej linii komórkowej w podobnych warunkach we wszystkich laboratoriach. Spekulujemy, że odtwarzalność międzylaboratoryjna może być podatna na jeszcze dalsze ulepszenia były wirusowe zasoby robocze, które mają być produkowane centralnie i dystrybuowane do uczestniczących laboratoriów. Znaczenie zmian szczepów wirusa dla miana punktu końcowego HAI jest dobrze zilustrowane przez 2-do-3-krotnie niższe miana wykazane w jednym badaniu, w którym w teście HAI zastosowano szczep a/cal pH1N1 w porównaniu z reasortantem X179A, który nadal posiadał równoważne hemaglutyniny i neuraminidazy (11). Niestety, zapasy nie zostały zsekwencjonowane w ramach tego badania, a więc nie możemy zweryfikować, czy wszystkie laboratoria używały wirusów o identycznych sekwencjach hemaglutyniny. Nawet jeśli drobne zmiany sekwencji zostały wprowadzone przez lokalne rozmnażanie zapasów wirusów, zmienność między laboratoriami w tym badaniu była niewielka, więc trudno sobie wyobrazić, w jaki sposób użycie zapasów o identycznych sekwencjach HA może dodatkowo zmniejszyć zmienność. Chociaż różnice nie przekraczały 2-krotnie w tym małym zestawie próbek, niewielkie zmiany w sekwencji HA wprowadzone przez miejscowe rozmnażanie zasobów wirusa mogą być jednym z możliwych wyjaśnień tendencji do niedoszacowania mian H1N1 i zawyżania mian H3N2.
w różnych badaniach odnotowano zmniejszoną zmienność międzylaboratoryjną mian HAI poprzez kalibrowanie wyników w stosunku do międzynarodowych standardów (6, 11-13); jednak takie standardy nie istnieją dla obecnych szczepów wirusa grypy sezonowej B i grypy a H3N2, a stały dryft antygenowy szczepów sezonowych, które napędzają coroczne przeformułowanie szczepionek, może wymagać ciągłego rozwoju i walidacji nowych standardów. W badaniu tym porównywalność międzylaboratoryjna wydaje się lepsza od porównywalności uzyskanej dzięki zastosowaniu nawet najbardziej skutecznych wzorców kalibracji. Na przykład, po kalibracji z IS 09/194, Wood et al. (11) poinformował, że maksymalne różnice między GMT w różnych laboratoriach zmniejszyły się z 80-do 64-krotnie (tj. wartość nadal znacznie wyższa niż maksymalna 11-krotnie w obecnym badaniu) i że zakresy GCV między laboratoriami zmniejszyły się z 95% do 345% (mediana, 105%) do 34% do 231% (mediana, 109%)—tj. znacznie powyżej zakresu 0% do 156% (mediana, 27%) obserwowanego w tym badaniu. Podobnie, zastosowanie zamiennika wynosi 10/202 zmniejszyło GCV między laboratoriami z zakresu od 108% do 157% do zakresu od 24% do 144% w pięciu próbkach, A maksymalne różnice między laboratoriami z 43-krotnie do 21-krotnie (13) i, stosując standard 07/150, Stephenson et al. (6) zmniejszono medianę GCV 15 próbek NIBRG-14 H5N1 clade 1 ze 125% (zakres, 31% do 582%) do 61% (34% do 535%).
chociaż nie można ustalić dokładnej przyczyny wysokiego poziomu porozumienia między laboratoriami PCIRN w porównaniu z poprzednimi badaniami, nasz sukces był ułatwiony przez zachętę, jaką mieliśmy jako sieć krajowa do pracy na rzecz wspólnego celu, jakim jest ustanowienie powtarzalnych procesów. Szczegółowa i rygorystyczna harmonizacja procesów i odczynników między miejscami jest być może jedynym” nowym ” aspektem, który wprowadziliśmy do tego badania, w porównaniu z długoletnią literaturą wykazującą słabą odtwarzalność HAI między laboratoriami. Jednak nasze dane sugerują, że przy starannej standaryzacji, międzylaboratoryjne zmiany mian HAI mogą zostać zredukowane do poziomów podobnych do obserwowanych w pojedynczych laboratoriach. Potencjalnymi kolejnymi krokami w minimalizacji zmian miana HAI w laboratoriach na całym świecie byłyby mobilizacja sieci/konsorcjów, wdrożenie wytycznych i/lub wymogów regulacyjnych dotyczących stosowania standardowych procedur i odczynników, standaryzowane szkolenia w celu zapewnienia powtarzalności oraz zapewnienie wsparcia i/lub zachęt dla laboratoriów do przyjęcia koncepcji „standaryzacji”.