Kierownik Projektu: dr Zuben E. Sauna
Biuro / Oddział / Laboratorium: OTAT / DPPT / HB
ogólny zarys
głównym problemem leków opartych na białkach jest ich immunogenność, czyli skłonność do wywoływania niechcianej odpowiedzi immunologicznej przeciwko sobie. Jedną z form odpowiedzi immunologicznej jest aktywacja komórek B, które wytwarzają przeciwciała, które wiążą się z białkami i zmniejszają lub eliminują ich działanie terapeutyczne. Takie przeciwciała mogą również powodować powikłania, które mogą zagrażać życiu. Dlatego krytycznym elementem określania bezpieczeństwa klinicznego i skuteczności produktów terapeutycznych opartych na białkach jest pomiar ich tendencji do wywoływania powstawania przeciwciał.
odpowiedź immunologiczna na terapie oparte na białkach obejmuje również komórki T, które pomagają aktywować komórki B, dzięki czemu wytwarzają przeciwciała, w tym te, które blokują terapie białkowe. Dzieje się tak, jeśli naturalne białko wytwarzane przez organizm jest w jakiś sposób wadliwe. W takim przypadku komórki T reagują na normalne, sztuczne białko terapeutyczne, jakby było obce, ponieważ różni się od wadliwego, naturalnego białka. Niedopasowanie odpowiedzi komórek T, takie jak to, czasami występuje w przypadku białka FVIII, białka, które ma kluczowe znaczenie dla zdolności organizmu do tworzenia skrzepów krwi w celu zatrzymania krwawienia. Ludzie, którzy nie mają wystarczających ilości FVIII lub których FVIII jest w jakiś sposób wadliwy, cierpią na hemofilię A, chorobę, w której krzepnięcie krwi jest wadliwe i prowadzi do nadmiernego krwawienia. Problem wadliwego czynnika VIII jest uwarunkowany genetycznie. Chociaż nie ma lekarstwa na hemofilię A, wlew białka terapeutycznego FVIII był jednym z najbardziej udanych przykładów leczenia przewlekłej choroby. Niestety, rozwój przeciwciał anty-lekowych przeciwko INFUZYJNEMU FVIII jest istotną przeszkodą w tej strategii. Leczenie pacjentów, u których rozwija się odpowiedź immunologiczna, jest bardziej złożone, mniej skuteczne i niezwykle kosztowne. Obecnie wydaje się, że poszczególne zmiany w tendencji do rozwoju przeciwciał anty-lekowych mogą być również oparte na różnicach genetycznych. Znajduje to odzwierciedlenie w obserwacji klinicznej, że u osób z hemofilią A czarnego Pochodzenia afrykańskiego prawdopodobieństwo wytworzenia przeciwciał przeciwko białkom czynnika VIII podawanym w terapii zastępczej jest dwa razy większe niż u pacjentów europejskiego pochodzenia Kaukaskiego.
jedną ze strategii zapobiegania niezgodnościom między naturalnym FVIII a zastępczym FVIII jest zaprojektowanie genetycznie zmodyfikowanych białek FVIII, aby nie wywoływały reakcji immunologicznych. Ale jest tak wiele różnic między układem odpornościowym ludzi, że nie jest prawdopodobne, że naukowcy będą w stanie zaprojektować białko FVIII, które jest bezpieczne dla wszystkich z nich. Dlatego proponujemy przyjęcie spersonalizowanego podejścia do przewidywania i unikania odpowiedzi immunologicznej na białka FVIII. Naszym długoterminowym celem jest opracowanie opartego na genach podejścia do identyfikacji osób, których układ odpornościowy może reagować na określone wersje genetycznie modyfikowanych białek terapeutycznych, aby pacjenci mogli być leczeni wersjami tych białek, które są mniej prawdopodobne, aby powodować odpowiedzi immunologiczne.
zajmujemy się również problemem różnic w trójwymiarowych strukturach leków białkowych i naturalnych białek, które pobudzają komórki B do wytwarzania przeciwciał przeciwko białkom terapeutycznym. Obecna metoda przewidywania, czy niektóre części takich białek spowoduje powstawanie przeciwciał jest trudna i kosztowna. Dlatego używamy maleńkich cząsteczek podobnych do DNA zwanych aptamerami do badania białek i określenia ich dokładnych kształtów. Aptamery są zbudowane z łańcuchów cząsteczek zwanych kwasami nukleinowymi, które składają się w określone kształty, które zależą od tego, które kwasy nukleinowe są obecne i kolejność, w jakiej występują w aptamerze. Dlatego identyfikując, który aptamer wiąże się ściśle z określoną częścią cząsteczki, możemy przewidzieć kształt tej części cząsteczki, podobnie jak przewidywanie kształtu zamka, znając kształt klucza, który się w nim mieści.
obecnie używamy tej techniki do określenia kształtów zarówno czynnika VIII, jak i części toksyny wąglika zwanej antygenem ochronnym . Jeśli aptamer straci zdolność wiązania się z FVIII, na przykład, wskazywałoby to, że część tego białka krzepnięcia krwi zmieniła kształt, zwiększając prawdopodobieństwo, że wywoła reakcję immunologiczną, która zmniejsza jego aktywność terapeutyczną. Używamy tego podejścia do określenia, czy białka terapeutyczne mają kształty, które wywołają produkcję przeciwciał. Współpracujemy z Centrum oceny leków i Badań nad dostosowaniem tej technologii do analizy nowych produktów białkowych opracowanych jako kopie istniejących, zatwierdzonych leków białkowych (biopodobnych), aby zapewnić ich bezpieczeństwo i skuteczność.
Przegląd Naukowy
1) Przewidywanie interakcji epitopów komórek T ze specyficznymi antygenami MHC klasy II.
czynnik VIII (FVIII) jest istotnym składnikiem kaskady krzepnięcia, a u osób z niedoborem czynników krzepnięcia występują zaburzenia krwawienia przez całe życie. Rozwój immunogenności przeciwko wersjom terapeutycznym (podawanym we wlewie) czynnika VIII jest istotną przeszkodą w skutecznym leczeniu chorych na hemofilię.
około 50% przypadków hemofilii A jest spowodowanych inwersją eksonów 1-22 genu F, co powoduje produkcję polipeptydu reprezentującego te eksony, ale nie 23-26. Jednak istnieje zagnieżdżony gen w promotorze F8, który tłumaczy eksony 23-26. Niemniej jednak inwersja 1-22 oznacza, że nakładające się peptydy wytworzone z tego białka nie zawierają połączenia między 1-22 i 23-26. Podczas gdy peptydy z podawanego leku-białka FVIII, które pokrywają to połączenie, byłyby obce dla układu odpornościowego pacjenta, na ogół nie są immunogenne. Immunogenność ze względu na różnice między endogennym i infuzyjnym FVIII jest prawdopodobnie spowodowana różnymi faktami, zwłaszcza polimorfizmami pojedynczego nukleotydu (SNPs), ale także mutacjami i delecjami missense oraz mutacjami nonsensownymi, a także inwersjami,
dlatego idealnym (ale mało prawdopodobnym) rozwiązaniem problemu immunogenności FVIII infuzyjnego byłoby zaprojektowanie zamienników FVIII, które pasują do haplotypu każdego pacjenta i typu HLA, aby uniknąć wywołania odpowiedzi immunologicznej. Podczas projektowania takich leków biologicznych, aby dopasować każdego pacjenta nie jest praktyczne, może to być możliwe w przypadkach, gdy istnieją wyraźne i znaczące różnice między konkretnymi populacjami (np. między tymi z Europejskiego Kaukaskiego i czarnego Pochodzenia afrykańskiego). W takich przypadkach pożądane byłoby dostosowanie wzorów endogennego czynnika VIII do każdej grupy, aby zapewnić, że jedna populacja nie otrzyma nieproporcjonalnego udziału w korzyściach płynących z jednej wersji FVIII, podczas gdy druga populacja ponosi nieproporcjonalny udział w ryzyku związanym z tym samym FVIII podawanym we wlewie.
obecna technologia umożliwia identyfikację tła haplotypu dla FVIII, jak również opracowanie co najmniej ograniczonej liczby spersonalizowanych produktów leczniczych czynnika VIII. Dlatego naszym krótkoterminowym celem jest określenie 1) ilościowej dystrybucji różnych haplotypów (SNP) u osób pochodzenia Europejsko-Kaukaskiego i czarno-afrykańskiego; 2) dystrybucji antygenów MHC klasy II w tych populacjach; 3) składu FVIII stosowanego jako leki; oraz 4) chorobotwórczej mutacji, delecji lub inwersji genu F8 (FVIII) u poszczególnych pacjentów. Wykorzystamy te dane do przewidywania immunogenności poszczególnych produktów FVIII w różnych populacjach i / lub poszczególnych pacjentów.
2) rozwój aptamerów jako narzędzia do badania epitopów konformacyjnych białkowo-lekowych .
Aptamery, kwasy nukleinowe zdolne do tworzenia złożonych konformacji, są potencjalnymi narzędziami do mapowania konformacji białek, identyfikacji i przewidywania miejsc immunogennych oraz do obchodzenia immunogenności. Nasze laboratorium opracowuje jednoniciowe aptamery DNA do rekombinowanego ludzkiego czynnika VIII.
zaprojektowaliśmy naiwną bibliotekę DNA do generowania aptamerów przy użyciu zdefiniowanych regionów 5€™ i 3€™ do PCR flankującego randomizowany region 60-bazowy. Biblioteka dna nave została poddana denaturacji, a segmenty ssDNA mogły składać się w unikalne trójwymiarowe kształty. (60 losowych baz teoretycznie daje 460 unikalnych konformerów.) Inkubowaliśmy pulę złożonych ssDNA z FVIII i poprzez iteracyjne cykle SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) byliśmy w stanie wybrać aptamery wiążące białka.
Nasze laboratorium wybrało próbki poszczególnych aptamerów w cyklach 3, 5 i 8 oraz sklonowało i zsekwencjonowało je. Używamy tych klonów do scharakteryzowania aptamerów poprzez analizę przewidywanej struktury 3D, właściwości wiązania i wpływu na aktywność FVIII. Ponadto robimy in silico porównania tych klonów, aby śledzić ewolucję aptamerów.
3) zastosowanie różnych technik analitycznych do oceny właściwości białek, które mogą korelować z immunogennością.
we współpracy z Dr. Mansoor Khan i Rakhi Shah (Division of Product Quality, CDER) będziemy analizować interakcje substancji pomocniczych przy użyciu metod termicznych (różnicowa kalorymetria skaningowa, mikrokalorymetria, analiza termograwimetryczna), technik spektroskopowych (transformacja Fouriera w podczerwieni, w pobliżu podczerwieni, Raman), krystalografii (dyfrakcja rentgenowska) i jądrowego rezonansu magnetycznego.
4) charakterystyka przeciwciał wrażliwych na konformację.
alternatywną metodą badania epitopów konformacyjnych ważnych terapeutycznie białek jest opracowanie i scharakteryzowanie przeciwciał, które są wrażliwe na zmiany konformacyjne. We współpracy z dr Chava Kimchi-Sarfaty (CBER) scharakteryzowaliśmy kilka przeciwciał, które są wrażliwe na konformację metaloproteazy cynku ADAMTS13, wielodomenowego białka, które rozszczepia czynnik von Willebranda i jest zamieszane w zakrzepową plamicę małopłytkową. Nasze wyniki sugerują, że przeciwciała te mogą być użytecznymi odczynnikami do rozróżniania funkcjonalnych i niefunkcjonalnych ADAMTS13 oraz do analizy przemian konformacyjnych podczas cyklu katalitycznego.
publikacje
Int J Mol Sci 2020 May 20;21(10):E3598
rola mikroRNA w hemofilii i zakrzepicy u ludzi.
Jankowska KI, Sauna ZE, Atreya CD
transfuzja 2020 Feb;60(2):401-13
kliniczna manifestacja hemofilii A przy braku mutacji w genie F8 kodującym FVIII: rola mikroRNA.
Jankowska KI, McGill J, Pezeshkpoor B, Oldenburg J, Atreya CD, Sauna ZE
j Thromb Hemost 2020 Jan;18(1):201-16
ilościowe zmiany peptydomiczne HLA-class-II/czynnika VIII (FVIII) w komórkach dendrytycznych korelują z potencjałem immunogennym terapeutycznych białek FVIII w hemofilii A.
Diego VP, Luu BW, Hofmann m, Dinh LV, Almeida m, Powell js, Rajalingam R, Peralta JM, Kumar S, Curran je, Sauna ZE, Kellerman r, Park y, Key NS, Escobar ma, Huynh H, Verhagen am, Williams-blangero s, Lehmann PV, maraskovsky e, BLANGERO J, Howard te
front Immunol 2019 Dec 20;10:2894
SampPick: selection of a cohorta of subjects matching a population HLA distribution.
McGill JR, Yogurtcu ON, Verthelyi D, Yang H, Sauna ZE
Sci Rep 2019 Oct 29;9(1):15449
wpływ optymalizacji kodonów na translację i strukturę czynnika krzepnięcia IX: implikacje dla terapii białkowych i genowych.
Alexaki a, Hettiarachchi GK, Athey JC, Katneni UK, Simhadri V, Hamasaki-Katagiri N, Nanavaty P, Lin B, Takeda K, Freedberg D, Monroe D, McGill JR, Peters R, Kames JM, Holcomb DD, Hunt RC, Sauna ZE, Gelinas a, Janjic N, DiCuccio M, Bar H, Komar AA, Kimchi-Sarfaty c
Blood Adv 2019 Sep 10;3(17):2668-78
łagodzenie immunogenności zależnej od komórek T za pomocą analogu czynnika VIIa.
Jankowski w, McGill J, Lagasse HAD, Surov S, Bembridge G, Bunce C, Cloake E, Fogg MH, Jankowska KI, Khan a, Marcotrigiano J, Ovanesov MV, Sauna ZE
AAPS J 2019 Aug 2;21 (5): 96
TCPro: narzędzie oceny ryzyka in silico do immunogenności białek bioterapeutycznych.
Yogurtcu ON, Sauna ZE, McGill JR, TEGENGE MA, Yang H
Am J Physiol Gastroest Liver Physiol 2019 Jun 1;316(6):G720-34
Translational and transcriptional responses in human primary hepatocytes under hypoxia.
Hettiarachchi GK, Katneni UK, Hunt RC, Kames JM, Athey JC, Bar H, Sauna ZE, McGill JR, Ibla JC, Kimchi-Sarfaty c
Blood Adv 2019 May 14;3(9):1429-40
peptydy zidentyfikowane na komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów: marker klinicznej immunogenności produktów FVIII.
Jankowski w, Park Y, McGill J, Maraskovsky e, Hofmann m, Diego VP, Luu BW, Howard TE, Kellerman R, Key NS, Sauna ZE
AAPS J 2019 May 6;21(4):62
leki Fusion FC mają właściwości wiązania i sygnalizacji fcgammar/C1q, które mogą wpływać na ich immunogenność.
Lagasse HAD, Hengel H, Golding B, Sauna ZE
Trendy Biotechnol 2018 Oct;36(10):1068-84
Ocena i łagodzenie immunogenności białek terapeutycznych.
Sauna ZE, Lagasse D, Pedras-Vasconcelos J, Golding B, Rosenberg AS
Hum Immunol 2018 Oct;79(Suppl.):103-4
Analiza peptydów HLAcII prezentowanych przez komórki dendrytyczne (DCS) od zdrowych dawców i pacjentów z hemofilią A (HA) z inhibitorami czynnika VIII (FVIII) lub bez nich po podaniu ex vivo różnych terapeutycznych białek FVIII (tFVIIIs).
Howard TE, Diego VP, Hofmann m, Almeida m, Luu BW, Dinh LV, Rajalingam R, Escobar m, Curran J, Williams-Blangero S, Powell J, Blangero J, Maraskovsky E, Key NS, Sauna ze
Mol ther metody Clin Dev 2018 Jun 15;10:105-12
częstość występowania wcześniej istniejących przeciwciał przeciwko nukleazie związanej z CRISPR Cas9 w populacji USA.
Simhadri VL, McGill J, McMahon S, Wang J, Jiang H, Sauna ZE
j Pharm Pharmacol 2018 May;70(5):584-94
ocena immunogenności podczas rozwoju leków białkowych.
Rosenberg AS, Sauna ZE
Transfus krwi 2017 Oct;15(6):568-76
podsumowanie Pierwszej Międzynarodowej Konferencji na temat inhibitorów w hemofilii A.
Lacroix-Desmazes S, Scott DW, Goudemand J, Van Den Berg m, Makris M, Van Velzen AS, Santagostino e, Lillicrap D, Rosendaal FR, Hilger a, Sauna ZE, Oldenburg J, Mantovani L, Mancuso ME, Kessler C, Hay CR, Knoebl P, Di Minno G, Hoots K, Bok a, Brooker m, Buoso e, Mannucci PM, Peyvandi f
j med Genet 2017 May;54(5):338-45
pojedyncza mutacja synonimiczna czynnika IX zmienia właściwości białkowe i leży u podstaw hemofilii B.
Simhadri VL, Hamasaki-Katagiri N, Lin BC, Hunt R, Jha s, Tseng SC, Wu a, Bentley AA, Zichel R, Lu Q, Zhu L, Freedberg DI, Monroe DM, Sauna ZE, Peters R, Komar AA, Kimchi-Sarfaty C
J Thromb Hemost 2017 Apr;15(4):721-34
modulowanie immunogenności czynnika IX przez fuzję do domeny FC immunoglobulin: a badanie przy użyciu modelu myszy hemofilii B.
Levin D, Lagasse HA, Burch e, Strome S, Tan S, Jiang H, Sauna ZE, Golding b
F1000res 2017 Feb 7;6:113
ostatnie postępy w rozwoju leków (białka terapeutycznego).
Lagasse HA, Alexaki a, Simhadri VL, Katagiri NH, Jankowski w, Sauna ZE, Kimchi-Sarfaty c
Sci Transl Med 2017 Jan 11;9(372):Aag1286
Post hoc ocena immunogenności bioinżynieryjnego czynnika VIIa demonstruje zastosowanie narzędzi przedklinicznych.
Lamberth K, Reedtz-Runge SL, Simon J, Klementyeva K, Pandey GS, Padkjær SB, Pascal V, León ir, Gudme CN, Buus S, Sauna ZE
Biomed Res Int 2015;2015:456348
dystrofia mięśniowa: mechanizmy chorobowe i terapie.
Pandey SN, Kesari a, Yokota T, Pandey GS
Per Med 2015;12(4):403-15
spersonalizowane podejścia do leczenia hemofilii A I B.
Simhadri VL, Banerjee AS, Simon J, Kimchi-Sarfaty C, Sauna ZE
PLoS One 2015 Jul 15;10(7):E0132433
Małe profilowanie ekspresji ncRNA krwi z hemofilii pacjentów identyfikuje mir-1246 jako potencjalny regulator genu Ffctor 8.
Sarachana T, Dahiya N, Simhadri VL, Pandey GS, Saini S, Guelcher C, Guerrera MF, Kimchi-Sarfaty C, Sauna ZE, Atreya CD
Nucleic Acids Res 2015 Jul 13;43(12):5699-707
wielkoskalowa analiza krajobrazu mutacyjnego w HT-SELEX poprawia odkrycie aptamera.
Hoinka J, Berezhnoy a, Dao P, Sauna ZE, Gilboa e, Przytycka TM
krew 2015 Jan 8;125(2):223-8
locus intron-22-inverted F8 umożliwia wewnątrzkomórkową syntezę czynnika VIII, wyjaśniając jego niskie ryzyko inhibitora i sugerując rolę w farmakogenomice.
Sauna ZE, Lozier Jn, Kasper CK, Yanover C, Nichols T, Howard TE
Trendy Biotechnol 2015 Jan;33(1):27-34
fuzja Fc jako technologia platformowa: potencjał modulowania immunogenności.
Levin D, Golding B, Strome SE, Sauna ZE