definicja
znakowanie fluorescencyjne to proces wiązania barwników fluorescencyjnych do grup funkcjonalnych zawartych w biomolekułach, aby mogły być wizualizowane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego (nature.com). dostępność nowych fluorophores radykalnie zmienił możliwości dla czułego wykrywania biomolekuł i analizy ich interakcji. Ulepszone barwniki fluorescencyjne umożliwiają obecnie niemożliwe wcześniej badania struktur komórkowych i procesów komórkowych. Etykiety fluorescencyjne oferują wiele zalet, ponieważ są bardzo wrażliwe nawet przy niskich stężeniach, są stabilne przez długi czas i nie zakłócają funkcji cząsteczek docelowych. Ukierunkowane obrazowanie oznaczonych komórek umożliwia ich śledzenie in vitro i In vivo. Używanie różnych fluoroforów w tej samej próbce może również pozwolić na jednoczesną obserwację kilku cząsteczek w tym samym czasie. Najczęściej stosowanymi fluoroforami są izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), pochodne rodaminy (TRITC), kumaryna i cyjanina. Te syntetyczne barwniki organiczne są używane do oznaczania biomolekuł jako białek, peptydów, przeciwciał, kwasów nukleinowych, bakterii lub drożdży. Naturalnie występujące fluorochromy, takie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), mogą być również używane do znakowania żywych komórek genetycznie.
- fluorescencyjne etykietowanie białek
fluorescencyjne etykietowanie umożliwia badaczom zbadanie dynamiki konformacyjnej i oddziaływań molekularnych białek lub śledzenie ich ruchów w celu lepszego zrozumienia ich funkcji biologicznych (Modesti m, 2011). Aby uzyskać lepszy wgląd w Wiązanie receptor-ligand, struktury białkowe i aktywność enzymu, pojedyncze peptydy mogą być również znakowane. Przeciwciała znakowane fluorochromem są szeroko stosowane w badaniach biomedycznych do wykrywania antygenów w testach immunofluorescencyjnych i są również niezbędnymi narzędziami w immunodiagnostyce. Aby zapewnić wiarygodne wyniki, koniugacja fluoroforów nie powinna zakłócać właściwości wiążących antygen przeciwciała (Nath N et al, 2016). - fluorescencyjne oznaczanie kwasów nukleinowych
testy oparte na fluorescencji odgrywają ważną rolę w biofizycznych badaniach struktury, funkcji i dynamiki kwasów nukleinowych. Ostatnie postępy w metodach znakowania i systemach obrazowania pozwoliły na bezpośrednią obserwację in vivo DNA i RNA oraz ich interakcji z innymi składnikami komórek. Obrazowanie kwasów nukleinowych z żywych komórek otworzyło nowe drogi dla lepszego zrozumienia organizacji chromatyny i regulacji ekspresji genów. (Dirks RW et al, 2018). - fluorescencyjne znakowanie polisacharydów
złożone polisacharydy, takie jak heparyna, są składnikami strukturalnymi macierzy zewnątrzkomórkowej. Polisacharydy te są niezbędne do adhezji, migracji i wzrostu komórek (Prigent-Richard S. i wsp., 1998). Niektóre związki są również znane ze swoich właściwości przeciwzakrzepowych, przeciwzakrzepowych, przeciwzapalnych, przeciwwirusowych i przeciwangiogennych. Metody oparte na fluorescencji ułatwiają identyfikację nowych bioaktywnych polisacharydów i scharakteryzowanie ich funkcji biologicznych (Roger o et al, 2002). - fluorescencyjne znakowanie lipidów
lipidy komórkowe odgrywają kluczową rolę w komórce w magazynowaniu energii, tworzeniu błon komórkowych i wewnątrzkomórkowych procesach sygnalizacji (Maekawa M. and Fairn G, 2014). Lipofilowy barwnik Nile red jest szeroko stosowany do barwienia wewnątrzkomórkowych lipidów w celu analizy ich lokalizacji i organizacji (Greenspan P et al, 1985). Co więcej, do badania dynamiki lipidów możliwe jest również specyficzne etykietowanie w żywych komórkach (Schultz C et al, 2010).
techniki znakowania fluorescencyjnego
powszechnie stosowane metody znakowania fluorescencyjnego wykorzystują techniki znakowania chemicznego, enzymatycznego, peptydowo-białkowego i genetycznego (Sahoo H, 2012 , Toseland CP, 2013).
- chemiczne techniki znakowania: Fluorofory dokują do cząsteczek docelowych poprzez modyfikację chemiczną (kowalencyjne lub nie kowalencyjne wiązanie). Chemiczne metody etykietowania mają kilka zalet, ponieważ są solidne, łatwe do wykonania i bardzo wydajne dzięki szerokiej gamie fluoroforów. Są one bardziej odpowiednie do badań in vitro niż in vivo.
- enzymatyczne techniki etykietowania: reakcje enzymatyczne umożliwiają szybkie, wysoce wydajne i selektywne etykietowanie in vivo i in vitro i mogą być stosowane do celowania w białka lub całe komórki. Jednak ze względu na duże rozmiary etykiet mogą wystąpić zakłócenia w funkcji cząsteczek docelowych.
- znacznik peptyd / białko: niedawno opracowana i bardzo obiecująca technika pozwala na specyficzne i selektywne etykietowanie białek poprzez włączenie krótkich znaczników fluorescencyjnych, które nie zakłócają składania lub funkcji cząsteczki. Technika ta jest również łatwa do wykonania i może być stosowana do badania różnych miejsc pojedynczych białek w zależności od swoistości znacznika peptydowego.
- etykietowanie genetyczne: etykietowanie genetyczne można osiągnąć za pomocą domen białkowych, małych peptydów lub pojedynczych aminokwasów, które są oznaczone barwnikami fluorescencyjnymi i mogą specjalnie przyłączać się do miejsc wzdłuż chromosomów in vivo. Takie podejście pozwala na wykrycie nieprawidłowości chromosomalnych, takich jak delecje lub duplikacji.
- etykiety wielokolorowe: Powszechnym wymogiem dla żywych komórek obrazowania i dla aplikacji cytometrii przepływowej jest zdolność do śledzenia lub wykrywania wielu fluorescencyjnie oznaczone białka w tym samym czasie. W tym celu można stosować specjalnie zaprojektowane barwniki o bardzo dużym przesunięciu Stokesa, które umożliwiają jednoczesne monitorowanie różnych procesów biochemicznych.
testy oparte na fluorescencji
testy oparte na fluorescencji opierają się na zdolności fluoroforów do ponownego emitowania światła po ekspozycji na cząstki światła lub fotony. Różnica długości fali pomiędzy światłem wzbudzającym a światłem emisyjnym, tzw. przesunięcie Stokesa, może być wykryta w mikroskopach i systemach obrazowania. Każdy fluorofor ma specyficzną zmianę Stokesa. Różne testy pozwalają badaczom zlokalizować biomolekuły, obserwować je w czasie rzeczywistym, badać ich interakcje i badać aktywność enzymatyczną.
- mikroskopia Fluorescencyjna
mikroskopia Fluorescencyjna umożliwia identyfikację komórek i składników komórkowych oraz monitorowanie fizjologii komórek z wysoką swoistością. Mikroskopia fluorescencyjna oddziela emitowane światło od światła wzbudzającego za pomocą filtrów optycznych. Zastosowanie dwóch wskaźników pozwala również na jednoczesną obserwację różnych biomolekuł w tym samym czasie. Podczas gdy konwencjonalne systemy obrazowania pozwalają na rozdzielczość od 200 do 300 nm dzięki fizycznym limitom dyfrakcji, nowe mikroskopy fluorescencyjne o superrozdzielczości jako sted (stimulated emission depletion) pokonują te granice i zapewniają wgląd w nanoskalowy świat cząsteczek (Sanderson MJ et al, 2014). - cytometria przepływowa
cytometria przepływowa jest szeroko stosowana w badaniach podstawowych i praktyce klinicznej do pomiaru sygnału ze specyficznych fluorophores. Komórki i cząstki są analizowane i ostatecznie sortowane w „czasie rzeczywistym”, gdy przechodzą przez wiązkę światła detektorów, które określają ilościowo fluorescencję wytwarzaną przez znakowane przeciwciała lub ligandy. Markery te wiążą się z określonymi cząsteczkami na powierzchni komórki lub wewnątrz komórki, umożliwiając ich wykrywanie i kwantyfikację. Na pojedynczych komórkach można mierzyć kilka parametrów, takich jak wielkość i objętość, a różne typy komórek można wyizolować i scharakteryzować (Nolan JT i Condello D, 2013). Cytometria przepływowa znajduje szerokie zastosowanie w takich dziedzinach jak immunologia, Hematologia, Medycyna transplantacyjna, onkologia i genetyka. - Fluorescencja in situ hybridization (FISH)
Fluorescencja in situ hybridization (FISH) pozwala na lokalizację specyficznych sekwencji DNA na chromosomach. Fluorescencyjne sondy DNA lub RNA są używane do hybrydyzacji i identyfikacji komplementarnych docelowych sekwencji DNA. Ryby były tradycyjnie używane do mapowania genów na chromosomach, na przykład podczas projektu ludzkiego genomu. Obecnie hybrydyzacja fluorescencji in situ jest wykorzystywana głównie do celów diagnostycznych w wykrywaniu nieprawidłowości chromosomalnych lub w analizie komórek nowotworowych (O ’ Connor C, 2008). - spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS)
spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) pozwala na analizę czasowych zmian intensywności fluorescencji fluorochromów, które są spowodowane wpływami chemicznymi, biologicznymi lub fizycznymi. FCS został po raz pierwszy wprowadzony w celu zbadania interakcji między lekami a DNA i stanowi obecnie wrażliwe narzędzie do określania stężeń i poziomów agregacji białek, a także do obserwacji interakcji molekularnych (Tian Y et al, 2011). - mikromacierze
mikromacierze umożliwiają badanie ekspresji genów w różnych warunkach. Tysiące genów mogą być badane w tym samym czasie na chipach DNA. Są to mikroskopijne szkiełka z drobnymi plamkami zawierającymi znane sekwencje DNA, które mogą selektywnie wiązać się z cząsteczkami mRNA/cDNA znakowanymi fluorescencyjnie. Po hybrydyzacji, Chip DNA jest odczytywany, a dane są wykorzystywane do tworzenia profili ekspresji genów (Hoen PAC et al, 2003).
Fluorescencyjna Etykieta: obrazowanie żywych komórek
kinetyczna obserwacja procesów komórkowych przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej stała się podstawową techniką w biologii komórki, ponieważ obrazowanie żywych komórek może dostarczyć bardzo cennych wglądów w mechanizmy wzrostu i transportu komórkowego. Jednym z głównych wyzwań w mikroskopii poklatkowej jest minimalizacja efektów fototoksycznych wynikających z fotoblakowania. Ekspozycja na światło stopniowo niszczy cząsteczki fluorescencyjne, prowadząc do zmniejszenia sygnału fluorescencji i do tworzenia wolnych rodników, które mogą uszkodzić komórki. Dlatego kluczowe znaczenie dla metody obrazowania żywych komórek ma znalezienie równowagi między zmniejszaniem ekspozycji na światło w jak największym stopniu a uzyskiwaniem użytecznych sygnałów do obserwacji komórek. Naukowcy muszą również stworzyć środowisko fizjologiczne, które pozwala ściśle replikować dynamikę in vivo. (Ettinger i Wittmann T, 2014).
PromoCell fluorescencyjne etykietowanie
dostępność nowych fluorophores dramatycznie zmienił możliwości czułego wykrywania biomolekuł i analizy ich interakcji. Ulepszone barwniki fluorescencyjne umożliwiają obecnie niemożliwe wcześniej badania struktur komórkowych i procesów komórkowych. PromoCell oferuje szeroką gamę wysokiej jakości fluoroforów do fluorescencyjnego znakowania różnych biomolekuł: znakowanie białek, znakowanie przeciwciał, znakowanie kwasów nukleinowych (znakowanie DNA, znakowanie RNA), a także kompletne zestawy do znakowania i gotowe do użycia koniugaty fluorescencyjne.
nasze barwniki PromoFluor są opłacalną alternatywą dla dobrze znanych, wiodących fluoroforów i obejmują spektrum długości fal od niebieskiego do dalekiej Czerwieni. Wykazują wyjątkową intensywność fluorescencji i fotostabilność, silną absorpcję światła, wysoką wydajność kwantową fluorescencji i dobrą rozpuszczalność w wodzie i mogą być stosowane do mikroskopii fluorescencyjnej, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS) i mikromacierzy (białko, DNA). Niektóre z nich oferują bardzo duże przesunięcie Stokesa, co sprawia, że idealnie nadają się do wielokolorowych etykiet lub cytometrii przepływowej. Barwniki PromoFluor są dostępne np. jako estry NHS, maleimidy i modyfikowane aminowo etykiety gotowe do kowalencyjnego sprzęgania lub jako koniugaty z biotyną, falloidyną i deoksynukleotydami (dUTPs). Ponadto dostarczamy również wysokiej jakości Zestawy do etykietowania przeciwciał & z różnymi barwnikami Promofluorowymi.