Échelles de contractilité de l’actomyosine avec élongation des myoblastes et améliore la différenciation grâce à l’exportation nucléaire de YAP

Les myoblastes adoptent une forme allongée pour différencier et réguler leur réseau d’actine jusqu’à la zone d’étalement

Pour évaluer la relation entre la forme cellulaire, le réseau d’actine et les adhérences focales, nous avons cultivé des myoblastes C2C12 sur une couche homogène de fibronectine (FN) . Après 24 heures de culture, les myoblastes ont été fixés et colorés pour l’actine afin de déterminer leurs paramètres morphologiques (Fig. 1 BIS). Les substrats revêtus de FN ont permis d’établir des interactions cellule-substrat spécifiques en recrutant des intégrines transmembranaires spécifiques. En effet, plusieurs sous-unités d’intégrines α qui se combinent avec la sous-unité β1 sont exprimées au cours de la myogenèse squelettique, étant importantes dans la migration cellulaire myogénique, la fusion des myoblastes, la maturation des fibres musculaires ou le maintien de l’intégrité musculaire32,33. Des expériences supplémentaires effectuées sur des substrats revêtus de laminine (LAM) ont indiqué que les deux paramètres morphologiques (indice de forme cellulaire, périmètre cellulaire et surface cellulaire, Fig. 1A) et les interactions cellule-substrat (nombre et zone d’adhérences focales, Fig. 1B) étaient statistiquement similaires sur FN et LAM, validant le revêtement FN pour étudier in vitro les morphologies des myoblastes C2C12 au cours du processus de fusion/différenciation.

Nous avons quantifié l’indice de forme cellulaire (CSI) qui caractérise la morphologie des myoblastes en donnant des informations sur l’élongation cellulaire. Les cellules arrondies ont un CSI proche de 1, tandis que les cellules allongées ont un CSI proche de 0. Nous avons trouvé des CSI allant de 0,1 à 0,8 avec une valeur moyenne de 0.37 ± 0,15 (n = 101), ce qui suggère une grande variabilité des morphologies cellulaires (Fig. 1B). Les myoblastes présentaient un périmètre moyen de 259 ± 82 µm (Fig. 1C, n = 101) et une large gamme de zones d’épandage (de ~1000 à ~ 4000 µm2), avec une valeur moyenne de 2057 ± 618 µm2 (Fig. 1D, n = 101). Ces résultats obtenus sur des myoblastes en C2C12 ont été renforcés par la réalisation de mesures morphologiques supplémentaires (CSI, périmètre cellulaire et zone cellulaire) sur des myoblastes humains primaires (16ubique, Fig. 2A) qui proviennent du biceps d’un patient non affecté par le FSHD (i.e. qui ont été confirmés comme n’ayant pas de suppression 4qA). Comme le montre la Fig. 2B-D, nos résultats démontrent que le CSI des myoblastes 16ubiques variait de 0,14 à 0,86 avec une valeur moyenne de 0,44 ± 0,17 (n = 90), suggérant une grande variabilité de morphologies cellulaires pour les myoblastes humains, comme observé pour les cellules C2C12. Pris ensemble, nos résultats démontrent que la variabilité des morphologies cellulaires ne dépend pas du type cellulaire ou de tout artefact de la culture cellulaire.

Nous avons ensuite étudié la distribution des filaments d’actine dans une population de myoblastes en C2C12 pour comprendre si les zones d’étalement de la variabilité peuvent moduler le cytosquelette d’actine. Nos résultats ont montré que l’intensité de fluorescence totale du réseau F-actine était linéairement liée à la zone cellulaire (Fig. 1E, n = 31, R2 = 0,748), ce qui suggère que plus la propagation du myoblaste est importante, plus il se forme de filaments d’actine. Comme le montre la Fig. 3, nous avons ensuite caractérisé la distribution des adhérences contenues dans la vinculine pour déterminer comment les variations de forme cellulaire affectent les interactions cellule-substrat dans les myoblastes C2C12. Nous avons constaté que la surface totale d’adhérences cellule-substrat par cellule augmentait avec la surface cellulaire (Fig. 1F, n = 31, R2 = 0,783) et avec l’intensité de fluorescence de la F-actine (Fig. 1G). Nos résultats indiquent que les myoblastes C2C12 prennent une variété de formes cellulaires et de zones d’étalement, mais adaptent à leur tour la quantité de filaments d’actine et les adhérences de vinculine à leur étalement. Pour mieux comprendre le rôle de la forme cellulaire dans la différenciation des myoblastes, nous considérons ensuite l’évolution du rapport d’aspect cellulaire au cours des étapes de prolifération (P0 à 6 heures et P2 à 48 heures) et de différenciation (D2 à 96 heures) (Fig. 1H). Comme le montre la Fig. 1I, J, nos résultats montrent que les myoblastes ont augmenté leur rapport d’aspect de 0,40 ± 0,16 (P0) à 0,36 ± 0,09 (P2) et 0,24 ± 0,07 (D2), suggérant que les myoblastes s’allongent de manière significative et adoptent un rapport d’aspect de 1: 4 pour se différencier. De plus, nos résultats indiquent que les fibres de contrainte d’actine sont fortement orientées à D2 (Fig. 4A, B), correspondent également à des élongations nucléaires importantes (Fig. 4C). Pris ensemble, nos résultats montrent que le réseau F-actine est modulé par des modifications de la morphologie des myoblastes et indiquent que la différenciation des myoblastes nécessite une élongation cellulaire jusqu’à un rapport d’aspect de 1:4.

L’organisation spatiale du réseau d’actine et du noyau est dirigée par la morphologie des myoblastes

Nous avons contrôlé la variabilité intrinsèque des morphologies des myoblastes en utilisant des micropattants adhésifs pour normaliser leurs zones d’étalement et contrôler leurs formes. En utilisant une technique d’impression par microcontact20, nous avons créé des micropatternes adhésifs de fibronectine (FN) avec une surface constante de 1600 µm2 et des géométries différentes. Nous avons utilisé arrondi (CSI = 1), carré (CSI = 0,79), triangulaire (CSI = 0,60) et différents rapports d’aspect de rectangulaire (CSI = 0,50 et 0,34 pour 1: 4 et 1:7 rapports d’aspect, respectivement) des micropatternes FN aux myoblastes individuels de culture (Fig. 2 BIS). Ces différentes géométries de micropatternes ont permis de standardiser in vitro la forme des myoblastes sur une large gamme et de contrôler leur surface d’étalement.

Pour déterminer quantitativement le rôle de la géométrie cellulaire sur l’organisation spatiale du cytosquelette d’actine, nous avons déterminé l’orientation des filaments d’actine pour chaque forme de cellule 34,35. Les filaments d’actine colorés à la phalloïdine étaient codés par couleur en fonction de leur orientation avec un gradient de couleur allant du bleu clair lorsque les filaments d’actine étaient organisés parallèlement (0°) à l’axe horizontal et rouge (+90°) ou orange (-90°) pour ceux organisés perpendiculairement à l’axe horizontal (Fig. 2B). Nous avons observé que les filaments d’actine dans les cellules arrondies étaient répartis de manière aléatoire, avec des orientations allant de -90° à +90°. Les cellules carrées présentaient des filaments d’actine organisés en trois domaines angulaires principaux: 0° à 25°, 50° à 90° et -50° à -90°, alors que les cellules triangulaires présentaient des filaments d’actine principalement organisés selon les trois côtés du motif à 0°, 60° et -60°. Fait intéressant, nous avons constaté que les filaments d’actine étaient fortement orientés parallèlement à l’axe long des cellules (0°) pour des cellules rectangulaires de rapport d’aspect 1:4 (CSI = 0,50) et 1:7 (CSI = 0,34). La quantification des adhérences contenant de la vinculine n’a révélé aucune différence statistique des zones d’adhésion entre les morphologies cellulaires (Fig. 5A–C), alors que l’orientation des adhérences focales était modulée par la forme de la cellule (Fig. supplémentaire. 5D, E), comme observé pour les filaments d’actine. Nos résultats montrent que les myoblastes rectangulaires 1:4 et 1:7 permettent une organisation plus forte du cytosquelette d’actine (Fig. 2C) et des adhérences focales, suggérant que l’élongation des myoblastes conduit à la formation de dipôles contractiles.

En considérant le rôle du noyau cellulaire dans la différenciation des myoblastes dans les myotubes, nous avons ensuite étudié si des changements dans la forme cellulaire et l’architecture du cytosquelette pouvaient moduler la forme et l’orientation du nucléus36. Nous avons constaté que le rapport d’aspect nucléaire augmentait de manière significative avec l’abaissement du CSI (Fig. 2D). En effet, les cellules arrondies (CSI = 1) sur les micropatternes circulaires présentaient un noyau arrondi caractérisé par un rapport d’aspect moyen de 1,11 ± 0,06, tandis que les cellules rectangulaires avec un rapport d’aspect de 1:4 (CSI = 0,50) et de 1:7 (CSI = 0,34) présentaient des déformations nucléaires importantes avec des rapports d’aspect de 1,39 ± 0,21 et 2,19 ± 0,23, respectivement. Nous avons également remarqué que l’orientation du noyau était modulée par la morphologie cellulaire (Fig. 2E). Nous avons constaté que l’orientation du noyau dans les cellules arrondies, carrées et triangulaires s’étendait sur une large gamme d’angles (de ~ 15 ° à ~ 60 °), avec une orientation moyenne de ~ 40 ° (circulaire, n = 11), ~ 33° (carré, n = 14) et ~ 43° (triangle, n = 10) par rapport à l’axe horizontal. Pour les cellules rectangulaires, nos résultats ont indiqué que le noyau était orienté parallèlement à l’axe de la cellule avec un angle moyen de ~ 14° (1: 4, n = 15) et ~ 2° (1: 7, n = 10).

L’élongation cellulaire améliore la contractilité des myoblastes

La question suivante que nous avons abordée était de savoir comment les changements de forme cellulaire affectent la contractilité des myoblastes. Pour répondre à cette question, nous avons utilisé la microscopie de force de traction (TFM) pour déterminer les contraintes de traction exercées par les myoblastes à micropatters. Comme le montre la Fig. 3A nous avons observé que les contraintes maximales s’exerçaient aux extrémités des myoblastes micropatternés, quelle que soit la forme cellulaire. Comme observé précédemment sur d’autres types de cellules 37, la contrainte contractile s’est accumulée préférentiellement dans les coins (carrés et triangles) ou aux deux extrémités (rectangles 1:4 et 1:7) des myoblastes micropatternés. Nous avons quantifié la contrainte totale exercée par les myoblastes micropatternés individuels pour déterminer si la morphologie cellulaire module la contractilité cellulaire. Comme le montre la Fig. 3B, les cellules arrondies (CSI = 1) ont exercé une contrainte totale de 170,7 ± 46,4 N / m2, tandis que les cellules rectangulaires (CSI = 0,34, rapport d’aspect 1: 7) ont exercé une contrainte totale plus importante (295,9 ± 156.8 N / m2), ce qui suggère que les formes de cellules allongées entraînent une augmentation des contraintes de traction. De plus, nous avons constaté que les cellules de forme rectangulaire (CSI = 0,34, rapport d’aspect 1: 7) présentaient la plus grande valeur de contrainte maximale (684,3 ± 257,8 Pa, Fig. 3C), tandis que les myoblastes arrondis ont montré la valeur de stress maximale la plus faible (351,5 ± 123,6 Pa). Considérant que les contraintes contractiles s’exerçaient à la périphérie de la cellule et que l’abaissement du CSI entraîne des contraintes de traction accrues, nous avons tracé la valeur de contrainte maximale en fonction de la distance entre le centre de masse et l’extrémité de la cellule (Fig. 3D), ce qui représente 22,6 µm (CSI = 1), 28,28 µm (CSI = 0,79), 33,98 µm (CSI = 0,60), 41,23 µm (CSI = 0,50) et 53,45 µm (CSI = 0,34). Comme le montre la Fig. 3D, nous avons constaté que la contrainte contractile maximale augmentait linéairement avec la distance entre le centroïde et l’extrémité de la cellule (R2 = 0,958, n = 65), suggérant que les morphologies allongées des myoblastes exercent plus de forces de tractions.

Afin de déterminer la contribution du réseau d’actomyosines à l’établissement des forces contractiles dans les myoblastes, les cellules C2C12 ont été traitées avec le médicament séquestrant la Latrunculine B (LatB) et avec l’inhibiteur de la myosine II, la Blebbistatine (Bleb). Les myoblastes immunodéprimés avec la phalloïdine ont indiqué que les cellules traitées par LatB et Bleb présentaient un réseau diffus d’actine (Fig. 3E), démontrant que les deux médicaments ont affecté de manière significative l’organisation de la F-actine. Nous avons utilisé la TFM sur des myoblastes micropatternés traités avec les deux médicaments pour déterminer le rôle du réseau d’actomyosines dans l’établissement de forces contractiles dans des myoblastes de géométries différentes. Nos résultats indiquent que le traitement par LatB a induit une perte significative de contractilité, qui a augmenté avec l’allongement cellulaire. En effet, les cellules arrondies présentaient une perte de contrainte contractile de ~ 62%, alors que les cellules rectangulaires 1:4 et 1:7 traitées au LatB étaient caractérisées par une perte de contrainte contractile de ~88% et ~ 86%, respectivement (Fig. 3F). De plus, nous avons constaté que le stress contractile de 1:4 cellules rectangulaires traitées par Bleb ont été caractérisées par une perte d’environ 80% de la force contractile, démontrant que les moteurs moléculaires de la myosine II sont des acteurs clés des forces contractiles des myoblastes.

Pris ensemble, ces résultats indiquent que la contractilité du réseau d’actomyosine est améliorée dans les myoblastes allongés grâce à l’établissement d’un réseau dense de fibres d’actomyosine parallèles.

La contractilité des paires de cellules a augmenté après leur fusion et leur élévation sur des micropatternes allongés

Pour comprendre comment la morphologie des myoblastes peut affecter les propriétés contractiles des myotubes, nous considérons un modèle minimal de deux myoblastes. Nous avons d’abord déterminé les forces de traction exercées par les doublets cellulaires à P1 (24 h en milieu de prolifération) plaqués sur des micropattants de formes variables (Fig. 6 BIS). Il n’y avait pas de différences statistiques de stress contractile entre la large gamme de CSI (Fig. 6B), malgré une orientation bien définie du réseau d’actine (Fig. 6C) et les noyaux (Fig. 6D, E) sur micropatternes rectangulaires 1:4 et 1:7. Sur la base de cette observation, nous avons ensuite quantifié la contrainte contractile exercée par les doublets cellulaires cultivés sur des micropatternes circulaires (CSI = 1) et rectangulaires (CSI = 0,50, rapport d’aspect 1:7) FN pendant cinq jours supplémentaires (D5, Fig. 1H) en milieu de différenciation. Nous avons utilisé le CMXRos rouge MitoTracker (ThermoFisher Scientific), une coloration mitochondriale vivante, pour nous assurer que les doublets de myoblastes étaient fusionnés (Fig. 4 BIS) 38. Comme le montre la Fig. 4B, C, nous avons constaté que la contrainte contractile totale était légèrement augmentée dans les doublets de cellules fusionnées cultivés sur des micropatternes circulaires (267 ± 64 Pa) comparativement aux doublets de cellules non fusionnées circulaires (157 ± 37 Pa), alors que les doublets allongés fusionnés étaient plus de deux fois plus contractiles (543 ± 193 Pa) que les doublets allongés non fusionnés (211 ± 73 Pa). Ces résultats indiquent que la contractilité cellulaire a augmenté après la fusion cellulaire et a été significativement améliorée pour les morphologies allongées.

La contractilité de l’actomyosine favorise la différenciation des myotubes

Nous avons ensuite demandé si la contractilité de l’actomyosine des myoblastes pouvait influencer la différenciation des myotubes. Les myoblastes en C2C12 ont été cultivés sur des substrats revêtus de FN dans des milieux de prolifération pendant 2 jours (P2, Fig. 1H) pour atteindre la confluence cellulaire. Ensuite, du LatB ou du Bleb ont été ajoutés pendant 30 minutes et le milieu de prolifération a été remplacé par un milieu de culture de différenciation. Après 4 jours en milieu de différenciation (D4, Fig. 1H), les cellules C2C12 ont été fixées et colorées pour l’ADN et la TroponinT, un marqueur de différenciation (Fig. 5). Nous avons évalué l’effet des traitements par LatB et Bleb en colorant l’alpha-actinine sur les myotubes témoins (CTRL) et les myotubes traités par Latrunculine B (+ LatB) et la blebbistatine (+ Bleb). Comme observé sur la Fig. 7, les myotubes de contrôle présentent des motifs de bande Z striés typiques, tandis que les traitements LatB et Bleb perturbent les motifs de striation dans les myotubes. Les myotubes témoins (CTRL) ont été caractérisés par un rapport d’aspect moyen de 7,99 ± 3,38 (Fig. 5A) et une zone positive de la troponine T de 51,7 ± 5,6% (Fig. 5B). Nos résultats indiquent que les traitements LatB et Bleb ont diminué la fraction de la zone de la troponine T à 44,9 ± 5,2% et 44,4 ± 5,1%, respectivement. De plus, nous avons constaté que l’indice de fusion était statistiquement plus faible pour les cellules LatB (27 ± 3%) et traitées par Blebb (29 ± 3%) que pour les cellules témoins (38 ± 5%), renforçant le rôle de la contractilité de l’actomyosine dans la différenciation des myoblastes (Fig. 5C). Pris ensemble, ces résultats indiquent que la contractilité de l’actomyosine des myoblastes favorise la différenciation des myotubes.

L’élongation des myoblastes déclenche l’exportation nucléaire de YAP, qui est essentielle à la différenciation des myoblastes en myotubes

Pour mieux comprendre les mécanismes intracellulaires qui contrôlent la différenciation des myotubes, nous considérons le rôle du YAP en déterminant sa localisation dans le cytoplasme ou le noyau des myoblastes, où il se lie à et active les facteurs de transcription TEAD39. Pour cela, nous avons quantifié le rapport YAP cytoplasmique/nucléaire dans les myoblastes micropatternés (Fig. 6A et Fig. supplémentaires. 8). Élongation cellulaire sur 1:Les micropatternes rectangulaires 4 et 1:7 ont augmenté le rapport YAP cytosolique/ nucléaire (Fig. 6B), suggérant que l’élongation cellulaire déclenche l’exportation nucléaire de YAP par les forces de compression nucléaires exercées par le réseau actomyosine40. Pour vérifier si la localisation de YAP dans le cytoplasme ou le noyau est liée à des étapes spécifiques du processus de différenciation, nous avons coloré YAP dans des cellules C2C12 après 24 h (P1) et 48 h (P2) de l’étape de prolifération et à 96 h (J2) et 264 h (J9) de l’étape de différenciation (Fig. 6C et Fig. supplémentaires. 9). Fait intéressant, nos résultats indiquent que le rapport YAP cytoplasmique / nucléaire est passé de 0,37 ± 0,07 à P1 à 0,68 ± 0,06 à P2 et 0,67 ± 0,06 à J2, puis a diminué à 0,42 ± 0,10 à J9 (Fig. 6D). Il est intéressant de noter que le rapport YAP cytoplasmique/ nucléaire à J9 n’est statistiquement pas différent des valeurs de P1, ce qui suggère que le rapport YAP cytoplasmique / nucléaire dans les myotubes différenciés est similaire à celui des myoblastes. Pour vérifier ces résultats, nous avons récolté des myoblastes au stade de prolifération P1 (24 h) et au stade de différenciation D2 (96 h) et nous avons isolé leurs matières cytoplasmiques et nucléaires. Nous avons réalisé un dosage des protéines de l’acide bicinchoninique (BCA) et les protéines contenues dans les extractions cytoplasmiques et nucléaires ont été analysées par électrophorèse (Fig. 6E). Nos résultats de Western blot ont indiqué que le rapport YAP cytoplasmique/nucléaire est passé de 0,62 ± 0,08 à P1 à 0,87 ± 0,24 à J2 (Fig. 6F). Cette quantification biochimique du YAP a démontré une exportation nucléaire significative du YAP dans la différenciation des cellules C2C12 et renforce nos résultats.

Sur la base de ces résultats, nous avons évalué le rôle du YAP en utilisant la leptomycine B pour bloquer l’exportation active du noyau en se liant directement à l’exportation141. En effet, Alberto Elosegui-Artola et ses collègues ont récemment montré que la leptomycine B (LMB) peut être utilisée efficacement pour étudier comment les forces contractiles exercées par le cytosquelette entraînent la translocation nucléaire du YAP39. En traitant les myoblastes C2C12 à P2 (48 h) avec LMB, nous avons constaté que le rapport cytoplasmique / YAP nucléaire était significativement plus faible dans les cellules traitées par LMB à J2 (96 h, Fig. 6G), suggérant que le YAP est principalement concentré dans le noyau lorsque l’exportation nucléaire est inhibée. De plus, nos résultats ont indiqué que l’indice de fusion à J4 des cellules traitées par LMB (Fig. 6H) était très faible (3,8 ± 1.5%) par rapport aux cellules témoins (42,4 ± 9,1%), démontrant que l’exportation nucléaire active est nécessaire pour la différenciation du C2C12.