9Le rôle des protéines dans le noyau catalytique splicéosomique
La comparaison de la taille des ARNSN avec les introns du groupe II beaucoup plus grands soulève la possibilité que plusieurs domaines introniques du groupe II aient été remplacés par des protéines dans les splicéosomes au cours de l’évolution, donnant naissance aux machines d’épissage eucaryotes modernes de ribonucléoprotéines (RNP). Bien qu’il n’existe pas encore de correspondance individuelle, il est facilement possible d’identifier des protéines splicéosomales qui remplissent une fonction médiée par des éléments d’ARN dans les introns du groupe II. Par exemple, un certain nombre de protéines associées à U2 jouent un rôle dans l’initiation et la stabilisation de l’interaction snRNA–site de branche U2 (Fig. 6.3).5,85 Dans les introns du groupe II, l’équivalent U2 (partie du domaine VI) est lié de manière covalente au site de branchement via une boucle en épingle à cheveux hyperstable dans un agencement qui assure la formation et la stabilité de leur interaction (Fig. 6.2). De ce point de vue évolutif, il n’est pas surprenant qu’une grande partie des protéines splicéosomales s’associent directement à un snRNA, l’aidant souvent dans sa fonction.5,85 Cependant, de nombreuses protéines splicéosomiques sont impliquées dans l’exécution de fonctions de régulation non requises dans le contexte d’un intron auto-épissant et sont susceptibles d’être des ajouts plus récents au complément protéique splicéosomique.
Comme mentionné ci-dessus, on pense que le dernier ancêtre commun des eucaryotes avait un splicéosome très évolué et entièrement fonctionnel qui ressemblait à ceux que l’on trouve chez les eucaryotes modernes.1,2 Bien que ce spliceosome contienne probablement beaucoup moins de composants par rapport au plus petit des spliceosomes modernes, les données indiquent que la plupart des composants clés étaient présents dans les premières versions des spliceosomes.1-4 En effet, un sous-ensemble du protéome splicéosomique qui comprend des protéines associées au noyau catalytique montre un niveau de conservation significatif parmi différentes espèces eucaryotes, un certain nombre de protéines splicéosomiques étant parmi les protéines cellulaires les plus conservées.85,86
Comme mentionné ci-dessus, de nombreuses ribozymes bien caractérisées sont associées à des protéines in vivo qui améliorent leur activité catalytique par plusieurs mécanismes connus.83 Ceux-ci comprennent la stabilisation de la structure fonctionnelle des ARN, l’aide à la liaison et au positionnement des substrats et l’aide à la liaison d’ions métalliques fonctionnellement importants. Cependant, la participation directe à la catalyse n’a jusqu’à présent été observée pour aucune des protéines associées aux ribozymes étudiées.83,87 Si l’on suppose que le splicéosome est une enzyme ARN, les SNRNA splicéosomiques sont des ribozymes inhabituelles à bien des égards. Peut-être le plus important, ils sont inhabituellement petits pour un ribozyme catalysant le clivage de la liaison phosphodiester via l’activation d’un nucléophile non adjacent. D’autres ribozymes naturelles catalysant de telles réactions, à savoir les introns des groupes I et II et la RNase P, sont au moins deux fois plus longues que la longueur combinée des SNRNA U6 et U2 humains. Ces ribozymes sont également beaucoup plus grandes que les ribozymes nucléolytiques qui activent un nucléophile 2′-hydroxyle adjacent pour le clivage de la liaison phosphodiester.24,88,89 On pense que la plus grande taille permet à ces ribozymes de se replier en structures complexes stabilisées par de multiples interactions tertiaires, ce qui leur permet de créer des sites actifs sophistiqués capables de positionner avec précision le site de clivage, les ions métalliques du site actif et le nucléophile distant pour une attaque nucléophile en ligne. Il est concevable que les SNRNA U6 et U2, en raison de leur courte longueur, forment au mieux un ribozyme d’épissage inefficace qui nécessite d’autres facteurs d’épissure pour un positionnement stable des éléments du site actif et des groupes réactifs.
On pense que Prp8, qui est la protéine spliceosomale la plus conservée, joue un tel rôle dans le site actif spliceosomal. Prp8 est sans doute la plus intéressante des protéines spliceosomales, car elle est exceptionnellement conservée avec une identité de 61% entre la levure et l’homme.86 Cependant, il a peu de motifs fonctionnels clairement distinguables dans sa longueur d’environ 2300 acides aminés, et les domaines fonctionnels qui ont été discernés jusqu’à présent sont dégénérés et remplissent probablement des fonctions sans rapport avec le rôle cellulaire du motif fondateur original.86 D’autre part, Prp8 joue clairement un rôle très critique dans le site actif spliceosomal. Il a été réticulé aux sites d’épissure 5′ et 3′ et au site de branche des ARN prémessageurs, en plus des SNRNA U5 et U6, ce qui indique qu’il est présent dans le noyau catalytique d’épissure et entre directement en contact avec les acteurs critiques de la réaction d’épissage.86,90 De plus, il a été montré que Prp8 interagit avec plusieurs protéines éplicéosomiques clés, dont Snu114 et Brr2 (voir ci-dessous).86,91,92
Les mutations de Prp8 sont associées à un large spectre de défauts d’épissure, y compris des altérations de la capacité des splicéosomes à rejeter les sites d’épissure sous-optimaux et la suppression des défauts causés par des mutations dans d’autres facteurs d’épissure tels que les SNRNA Prp28, Brr2, U4 et U6.86,93,94 Un sous-ensemble de mutants Prp8 module sélectivement l’efficacité de la première ou de la deuxième étape d’épissage, en particulier dans des substrats sous-optimaux.58,86,95- 97 Ces observations sont mieux expliquées par une hypothèse indiquant que Prp8 est impliqué dans la stabilisation de conformations alternatives de sites actifs mutuellement exclusives qui sont soit prêtes pour la catalyse de la première ou de la deuxième étape d’épissage, et que certains mutants Prp8 pourraient conduire à une hyperstabilisation sélective de l’un de ces états.58,96,98 Bien que des preuves significatives suggèrent que Prp8 est probablement impliqué dans le positionnement des substrats et la stabilisation du site actif, aucune preuve directe n’existe actuellement qui suggère ou réfute son implication supplémentaire dans la coordination des ions métalliques ou sa participation directe à la catalyse splicéosomale.
Cette incertitude provient du fait que l’on sait très peu de choses sur la façon dont Prp8 remplit sa fonction. Un essai de criblage innovant médié par les transposons a indiqué que de grandes régions de Prp8 sont très sensibles à l’insertion de transposons et fonctionnent probablement comme une seule unité structurelle, bien qu’il soit possible d’insérer des transposons ou même de diviser Prp8 en deux fragments à un certain nombre d’autres positions sans perte de viabilité.90,92 Mis à part un signal de localisation nucléaire dégénéré près de sa terminaison N et un motif RRM (motif de reconnaissance d’ARN) dégénéré au milieu de la protéine, seuls deux autres domaines fonctionnels ont été identifiés dans cette protéine longue d’environ 2300 acides aminés.86
Une variante dégénérée du domaine MPN/Jab1 associée aux enzymes deubiquitinantes se trouve près de l’extrémité C de Prp8. L’analyse de la structure à haute résolution d’un fragment de Prp8 contenant ce domaine a montré que le site de liaison aux ions métalliques du centre de l’isopeptidase est altéré, et donc qu’il ne fonctionne probablement pas comme une enzyme deubiquitinante.99 100 In vitro, un fragment de Prp8 contenant ce domaine pourrait se lier directement à l’ubiquitine avec une affinité comparable à d’autres protéines de liaison à l’ubiquitine connues.101 Plusieurs mutations connues de la Prp8 qui ont perturbé l’épissage ont également perturbé la liaison in vitro de l’ubiquitine, soulevant ainsi la possibilité d’un rôle fonctionnel de l’ubiquitination dans la régulation de l’épissage. Fait important, les analyses protéomiques ont indiqué que plusieurs facteurs splicéosomiques, y compris Sad1, Snu114, Rse1 et Prp8 lui-même, sont ubiquitinés in vivo, et en outre la protéine de base splicéosomique Prp19 présente une activité E3 ubiquitine ligase in vitro.101-105 De plus, l’ubiquitine joue un rôle dans la formation et le maintien de la tri-snRNP, éventuellement en modulant la régulation médiée par Prp8 de la fonction de Brr2.102 Alternativement, il est également possible que le domaine MPN / Jab1 fonctionne comme une plate-forme d’interaction protéine–protéine. Un certain nombre de mutations de Prp8 qui relèvent de ce domaine entraînent la cécité héréditaire rétinite pigmentaire,86 et ces mutations ont affaibli l’interaction de Prp8 avec Brr2 et Snu114.99
On a déterminé la structure à haute résolution d’un autre fragment de Prp8 qui englobe une région hautement conservée (identité d’acides aminés à 69% entre la levure et l’humain) située à proximité de son domaine C-terminal. L’analyse de la structure a révélé la présence d’un doigt en épingle à cheveux β ressemblant à ceux trouvés dans les protéines ribosomiques et d’un domaine dégénéré de type RNase H.106-108 Alors que la géométrie globale du motif de type RNase H au niveau de la structure secondaire et tertiaire a été bien conservée, la séquence primaire a montré un niveau de conservation beaucoup plus faible et un seul des trois résidus catalytiques est présent au site actif. Le résidu conservé, un aspartate, est impliqué dans la coordination de deux ions métalliques catalytiques dans le site actif des domaines canoniques de la RNase H. Dans une étude, la mutation de ce résidu dans Prp8 chez la levure n’a entraîné aucun défaut de croissance détectable, ce qui pourrait indiquer une redondance ou l’absence d’une fonction critique.108 Dans une autre étude, son effet n’a pas pu être examiné car la mutation a induit un mauvais repliement du fragment protéique.107 Aucune liaison aux ions métalliques n’a été observée par la région correspondant au site actif du domaine RNase H lorsque les cristaux ont été cultivés jusqu’à 200 mm MgCl2, ce qui indique que le site actif dégénéré n’a pas de capacité de liaison aux ions métalliques. De plus, le fragment de Prp8 contenant ce domaine a montré une très faible capacité de liaison à l’ARN, avec un Kd de 20 µM à plus de 200 µM selon les espèces d’ARN testées.106-108 Bien que le fragment ait montré une très faible affinité pour les ARN de liaison, il a montré une préférence pour les ARN duplex de liaison contenant des jonctions à quatre voies.108 Dans les splicéosomes humains activés, les ARNSN U2 et U6 devraient former une telle structure.53,69 Ce qui a rendu ce domaine de type RNase H particulièrement intéressant, c’est que les acides aminés correspondant à son site actif sont positionnés à côté de résidus dans Prp8 qui ont été précédemment montrés pour se réticuler vers le site d’épissure 5′ dans les épissures précatalytiques.109 Cependant, l’efficacité de la formation de cette réticulation a été réduite à mesure que les splicéosomes précatalytiques progressaient pour devenir des complexes splicéosomaux catalytiquement actifs.109 La diminution observée de l’efficacité de réticulation pourrait être interprétée comme indiquant que cette interaction est perturbée dans les splicéosomes activés. Alternativement, l’interaction peut persister, mais la formation de la réticulation elle-même est abolie en raison d’un changement mineur de l’environnement des résidus réticulés. Si ce domaine dégénéré de type RNase H est bien positionné à proximité du site d’épissure 5′ dans des splicéosomes catalytiquement actifs, il est possible qu’il participe à la stabilisation de la conformation active des SNRNA, au positionnement des substrats dans le site actif, et/ou à la coordination des ions métalliques catalytiques. Bien que le domaine en lui-même ne puisse pas lier l’ARN ou les ions métalliques, il est possible qu’en présence d’autres éléments du site actif, il fasse partie du substrat ou des poches de liaison aux ions métalliques. Malgré ces possibilités intrigantes, le rôle de Prp8 dans la catalyse spliceosomal reste incertain.