Bactéries réductrices de sulfate dans les fèces humaines et leur association avec les maladies inflammatoires de l’intestin

Résumé

Nous avons recherché des bactéries réductrices de sulfate dans les fèces de 41 individus sains et de 110 patients d’une Unité d’Hépato-Gastro-Entérologie utilisant un milieu liquide spécifique (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, France). Les 110 patients ont été séparés chez 22 patients présentant des maladies inflammatoires de l’intestin et 88 patients hospitalisés pour d’autres maladies du tube digestif inférieures (n = 30) ou supérieures (n = 58). Des bactéries réductrices de sulfate ont été isolées chez 10 personnes en bonne santé (24%), 15 patients présentant des maladies inflammatoires de l’intestin (68%) et 33 patients présentant d’autres symptômes (37%). Une PCR multiplex a été conçue pour l’identification de Desulfovibrio piger (anciennement Desulfomonas pigra), Desulfovibrio fairfieldensis et Desulfovibrio desulfuricans, et appliquée aux isolats ci-dessus. Les souches de bactéries réductrices de sulfate étaient composées de D. piger (39 isolats), D. fairfieldensis (19 isolats) et D. desulfuricans (un isolat). La prévalence de D. piger était significativement plus élevée chez les patients atteints de maladies inflammatoires de l’intestin (55%) que chez les personnes en bonne santé (12%) ou chez les patients présentant d’autres symptômes (25 %) (P< 0,05).

1 Introduction

La maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (UC) sont des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) d’étiologie inconnue, mais elles sont susceptibles de dépendre de facteurs environnementaux, génétiques et immunitaires. Une origine infectieuse a été proposée, et de nombreux microorganismes ont été impliqués en l’absence d’arguments convaincants. Cependant, dans les deux syndromes, l’inflammation intestinale répond à l’antibiothérapie. Dans les modèles animaux de colite chronique, la flore luminale est un cofacteur essentiel à la survenue de la maladie. Cela peut expliquer le regain d’intérêt pour le rôle de la flore intestinale comme cause de ces troubles.

Les bactéries réductrices de sulfate (SRB) sont des microorganismes anaérobies qui effectuent une réduction de sulfate dissimilatoire pour obtenir de l’énergie, ce qui entraîne la libération d’une grande quantité de sulfure. Ils sont généralement isolés de sources environnementales, mais sont également présents dans le tube digestif des animaux et des humains. As Desulfomonas pigra a été reclassé en peigne de piger Desulfovibrio. nov. , les isolats humains de SRB se composent presque exclusivement d’espèces de Desulfovibrio. Des découvertes récentes suggèrent que le SRB pourrait jouer un rôle dans les maladies humaines. Ils ont été associés à la gravité clinique de la parodontite humaine et isolés d’abcès profonds (abdominaux ou cérébraux), de sang ou d’urine. Dans ces contextes, la plupart des souches ont été identifiées comme Desulfovibrio fairfieldensis, une nouvelle espèce récemment proposée, par séquençage du gène de l’ARN ribosomique 16S (ADNr 16S). Desulfovibrio desulfuricans, l’espèce type du genre Desulfovibrio, a également été isolée à partir de spécimens humains. L’implication du SRB dans les MICI a été suggérée car leur produit final métabolique, le sulfure d’hydrogène, est un composé cytotoxique. Ce composé peut agir par une inhibition de l’oxydation du butyrate, la principale source d’énergie des colonocytes. L’altération des fonctions de l’épithélium intestinal entraînerait la mort cellulaire et une inflammation chronique. Cependant, les espèces de SRB associées aux MII n’ont pas encore été identifiées. Leur identification permettrait de rechercher des facteurs de virulence ainsi que leur sensibilité aux agents antimicrobiens.

Dans les laboratoires médicaux, les SRB sont rarement isolés des échantillons humains en raison d’une croissance lente. Les colonies apparaissent après plus de 3 jours d’incubation et ne sont pas remarquées, étant envahies par la flore qui les accompagne, à moins qu’elles ne soient les espèces dominantes ou uniques présentes. Ainsi, leur recherche dans les matières fécales est difficile à moins d’utiliser un milieu spécifique. De tels milieux contiennent généralement un composé organique (donneur d’électrons et source de carbone), du sulfate (accepteur d’électrons), du fer et un agent réducteur. La croissance de SRB dans des milieux de culture spécifiques est facilement détectée par un noircissement du milieu dû à la production de sulfure d’hydrogène (H2S) entraînant la formation d’un précipité de sulfure ferreux. Une fois isolé à partir d’échantillons cliniques, l’identification au niveau de l’espèce peut être difficile. Par exemple, il n’est pas possible de différencier D. fairfieldensis et D. desulfuricans par des tests phénotypiques. Ainsi, l’amplification génique est un outil précieux pour réaliser une telle identification.

L’objectif principal de cette étude était de déterminer quelles espèces de Desulfovibrio pouvaient être associées à des MII, le cas échéant. A cet effet, un milieu liquide spécifique (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, France) a été utilisé pour la croissance du SRB à partir des matières fécales d’individus sains et de patients hospitalisés dans l’Unité d’Hépato-Gastro-Entérologie du Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy, France. Une PCR multiplex a été conçue pour l’identification des isolats au niveau de l’espèce.

2 Matériaux et méthodes

2.1 Patients

Excréments de 41 personnes en bonne santé (17 hommes et 24 femmes; âge moyen 38 ans, intervalle 1-101 ans) et 110 patients (67 hommes et 43 femmes; âge moyen 57 ans, intervalle 14-100 ans) de l’Unité d’Hépato-Gastro-entérologie du Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy, France, ont été collectés. Les personnes en bonne santé ont consulté consécutivement pour un bilan de santé. Aucun micro-organisme pathogène n’a été trouvé dans leurs excréments. Les personnes et les patients en bonne santé n’ont reçu aucune administration d’antibiotique au cours du mois précédant l’obtention de l’échantillon. Les patients ont été séparés en trois groupes: les MICI (n = 22) comprenaient 17 CD et cinq UC; d’autres maladies de l’intestin inférieur (n = 30) comprenaient 23 patients présentant des symptômes légers ou modérés tels que des douleurs abdominales, des troubles du transit intestinal et une rectorrhagie, et sept patients atteints d’un cancer du côlon; les maladies du tube digestif supérieur (n = 58) comprenaient des calculs biliaires, une cirrhose, un carcinome hépato-cellulaire, des tumeurs gastriques et pancréatiques. Les MICI ont été diagnostiquées sur la base de résultats cliniques, endoscopiques et histologiques. La plupart des patients atteints de MICI présentaient une maladie active (tableau 1).

2.2 Détection et dénombrement du SRB

Un gramme de matières fécales a été mélangé à 4 ml de tampon salin tamponné au phosphate et centrifugé (3000 tr/min, 5 min). Un millilitre de surnageant a été inoculé immédiatement en milieu liquide (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, France) selon les instructions du fabricant. En bref, les kits de test Labège® sont constitués de flacons contenant 9 ml d’un milieu spécifique (composés organiques : lactate et acétate, agent réducteur : citrate de titane) conditionnés anaérobiquement pour la détection du SRB. Il est inoculé avec une seringue à travers un capuchon en caoutchouc. Ce milieu limpide et incolore a été conçu à l’origine pour la détection de SRB à partir d’échantillons environnementaux. Il a été comparé au milieu solide E couramment utilisé de Postgate (composé organique : lactate, agents réducteurs : acide ascorbique et acide thioglycolique), inoculé en parallèle sous atmosphère anaérobie. Les SRB ont été dénombrés à l’aide de tubes longs et étroits remplis de ce dernier milieu et inoculés avec des dilutions décimales des matières fécales. Tous les milieux inoculés ont été incubés à 37°C pendant 2 mois. La présence de SRB a été constatée par la formation d’un précipité noir (sulfure ferreux) en milieu liquide et par l’apparition de colonies noires en milieu solide.

2.3 Conception des amorces de PCR

Les séquences d’ADNr 16S des souches de Desulfomonas et de Desulfovibrio disponibles dans la base de données GenBank ont été comparées à l’aide du logiciel Sequence Navigator, version 1.0.1 (Applied Biosystems Inc., Foster City, Californie, États-Unis). Il a permis de concevoir six amorces pour l’identification par PCR du SRB précédemment isolé chez l’homme, apparenté respectivement à D. piger (anciennement Desulfomonas pigra) ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774 et D. fairfieldensis ATCC 700045. D. desulfuricans Essex 6 et D. desulfuricans MB ont été différenciés car les séquences d’ADNr 16S de ces souches présentent une différence de 3%. Les amorces étaient 27K-F (5′-CTG CCT TTG ATA CTG CTT AG-3′), 27K-R (5′-GGG CAC CCT CTC GTT TCG GAG A-3′), Essex-F (5′-CTA CGT TGT GCT AAT CAG CAG CGT AC-3′), Fair-F (5′-TGA ATG AAC ÉTIQUETTE TTT GGG AAA GAC-3′), Pig-F (5′- CTA GGG TGT TCT AAT CAT CAT CCT AC-3′), et P687-R (5′ – TAC ATC GGA TTT CAC TCC ACC-3′) (Tableau 2). La spécificité de ces amorces a été vérifiée sur toutes les séquences bactériennes disponibles dans la base de données GenBank à l’aide du programme Blast, version 2.0 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA).

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. desulfuricans Essex 6, deux souches apparentées à D. desulfuricans MB et huit souches identifiées comme D. fairfieldensis) ont été utilisées comme témoins positifs. La sensibilité de la PCR a été évaluée avec des dilutions de suspensions de souches bactériennes quantifiées. La spécificité de la PCR a été vérifiée avec des témoins négatifs comprenant des souches types (Bilophila wadsworthia ATCC 49260T, Desulfovibrio gigas DSM 1382T, Desulfovibrio vulgaris DSM 644T) et des souches cliniques intestinales communes appartenant aux espèces suivantes: Bacteroides fragile, Bacteroides merdae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniforme, Bacteroides vulgatus, Campylobacter jejuni, Citrobacter freundii, Bactéries inoffensives, Enterobacter empire romain, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium small, Eubacterium sticky, Fusobacterium nucleatum, Copenhague du canal, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Peptostreptococcus big, Proteus wonderful, Proteus common, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, et Streptococcus bovis.

A la fin du temps d’incubation, l’ensemble des 151 kits de Test inoculés Labège® ont été contrôlés à l’aide de la PCR multiplex. Des extraits d’ADN ont été obtenus à partir de 500 µl de milieu de culture, après centrifugation et remise en suspension dans du tampon TE (Tris–HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). Brièvement, les cellules ont été lysées en utilisant successivement le lysozyme (3 mg ml-1), le SDS (1%, p / v) et la protéinase K (0,25 mg ml−1). Après une incubation d’une nuit à 37°C, l’ADN a été extrait par la méthode standard phénol/chloroforme/alcool isoamylique. Chaque mélange PCR de 50 µl contenait 5 µl d’extrait d’ADN (environ 50 ng d’ADN) et des quantités finales de 0,4 µM de chaque amorce, 0,8 mM de chaque désoxynucléoside triphosphate (Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Allemagne), 0,4 mM de tampon Tris–HCl, 1,5 mm MgCl2 et 1,5 U d’ADN polymérase Taq (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, Royaume-Uni). Toutes les réactions ont été réalisées à l’aide du système de PCR GeneAmp 2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA). Une étape initiale de dénaturation de 94°C pendant 4 min a été suivie de 30 cycles de dénaturation (94°C, 1 min), de recuit (55°C, 1 min) et d’extension (72°C, 2 min), et d’une extension finale (72°C, 5 min). Des témoins négatifs (eau au lieu d’extrait d’ADN) et positifs (extrait d’ADN de D. fairfieldensis) ont été inclus dans chaque essai. Les produits amplifiés ont été résolus par électrophorèse dans des gels d’agarose à 1,5% (p/v) contenant du bromure d’éthidium (1,6 mg ml−1). Une échelle d’ADN de 100 pb a été utilisée comme marqueur de taille (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, États-Unis). D. piger, D. desulfuricans Essex 6, D. desulfuricans MB et D. fairfieldensis ont été identifiés par une bande de 255, 255, 396 et 534 pb, respectivement. D. piger et D. desulfuricans Essex 6 ont été différenciés par des tests PCR distincts utilisant leurs amorces spécifiques respectives. Pour les échantillons négatifs, une amplification de l’ADNr 16S à l’aide des amorces consensuelles 27f et 1525r a été réalisée pour vérifier l’absence d’inhibition des PCR par les contaminants.

3 Résultats

3.1 Détection et dénombrement de SRB

Chez des individus sains et selon les critères ci-dessus, des SRB ont été trouvés dans 10 matières fécales (24%) avec le kit de test Labège® et le milieu de Postgate. Chez les patients de l’unité d’hépato-Gastro-entérologie, des SRB ont été cultivés à partir de 42 matières fécales en utilisant le milieu de Postgate. Trois échantillons supplémentaires ont été trouvés positifs avec le kit de test Labège®. Ainsi, parmi les 110 patients étudiés, des SRB ont été détectés par culture chez 45 patients (41%). Trois échantillons supplémentaires ont donné des résultats équivoques avec le Test-kit Labège® (présence d’un précipité brun foncé). Les temps moyens de détection de la croissance du SRB étaient respectivement de 2 et 6 jours en utilisant le kit de test Labège® (plage de 1 à 11 jours) et le milieu de Postgate (plage de 3 à 39 jours). Le nombre moyen de SRB dans les fèces d’individus et de patients en bonne santé était de 105 g−1 (plage de 102 à 109 g−1). Ainsi, le nombre de SRB n’était pas lié à l’état clinique des patients.

3.2 Identification du SRB par PCR multiplex

La sensibilité du test de PCR multiplex était de 100 bactéries par ml. Sa spécificité a été établie par l’absence de réactions croisées entre les quatre génospécificités différenciées. Chaque témoin positif a été trouvé positif uniquement avec l’ensemble d’amorces correspondant. Toutes les souches utilisées comme témoins négatifs pour vérifier la spécificité, y compris les souches types de D. gigas et D. vulgaris, ont donné des résultats négatifs avec les quatre ensembles d’amorces. La spécificité des réactions a en outre été confirmée par le séquençage des produits amplifiés. Les séquences obtenues correspondaient toujours à celles attendues. Pour les échantillons SRB négatifs par PCR, l’amplification de l’ADNr 16S a permis d’écarter la possibilité d’une inhibition des PCR par les contaminants.