Pokud jste měli dostatek času a bez vibrací prostředí, můžete trpělivě čekat a gravitační síla přinese nejvíce suspendované částice na dně centrifugační kyvety. Nejmenší částice by pravděpodobně zůstat v suspenzi v důsledku brownova pohybu, a většina makromolekul by být rovnoměrně rozloženy, protože oni by být v řešení, spíše než pozastavení. Já nevím jak vy, ale já nemám takovou trpělivost zapotřebí spoléhat pouze na gravitaci pro odlučování tuhých od tekuté složky. Kromě toho by z praktických důvodů byla získaná peleta příliš snadno narušena pro účinné oddělení pevného materiálu od supernatantu. Gravitace by nebyla strašně účinným způsobem oddělování suspendovaných materiálů na základě velikosti nebo jiných charakteristik.
popis podmínek odstřeďování
při popisování odstředivého běhu v materiálech a metodách je zřídkakdy nutné hlásit více než sílu, čas a teplotu odstřeďování. Požadovaná rychlost (rpm) závisí na použité odstředivce a rotoru, která se bude lišit od jedné laboratoře k druhé. Proto je zřídkakdy důležité hlásit značku odstředivky, Typ rotoru nebo rychlost.
odstřeďování
Odstředění vytváří dostředivé síly, které mohou být stovky nebo tisíce krát gravitační síla, čímž urychluje proces značně. Čím větší je počet otáček za minutu (ot / min), tím větší je gravitační síla. Užitečnost centrifugace při frakcionaci buněk by byla omezená, kdybychom mohli pouze řídit suspendované částice na dno zkumavky. Nicméně, vyšetřovatelé jsou schopni kontrolovat velikost částic, které jsou svrženy, díky fyzice částic v suspenzi.
v suspenzi kulatých částic stejné hustoty, ale různých průměrů, je síla, která pohání danou částici ke dnu, rovna její hmotnosti násobku aplikovaného zrychlení. Objem částice je funkcí jejího poloměru a její hmotnost se rovná objemu násobku koeficientu hustoty, což je konstanta. Objem koule se rovná 4/3 krát pi (konstanta) krát krychle poloměru. Pro suspenzi sférických částic o stejné hustotě za určité sady podmínek je jedinou proměnnou, která určuje sílu na danou částici, její poloměr.
odpor vůči pohybu roztokem je úměrný té části povrchové plochy, která protlačuje médium. U částic podobného tvaru se menší částice setkávají s menším odporem než větší. Protože povrch koule je 4 krát pi krát druhá mocnina poloměru, a 4 krát pí je konstanta, pak pro sférické částice o stejné složení, jen proměnná, která určuje odpor pod danou sadu podmínek je poloměr částice.
hnací síla se zvyšuje úměrně krychli poloměru. Odolnost proti pohybu se zvyšuje úměrně čtverci poloměru. Není těžké vidět, že jak se zvyšuje poloměr částice, zvyšuje se také její tendence přiblížit se ke dnu. Přidejte značné množství „tažení“ a gravitační experiment, který byl přičítán Galileovi, nakonec nefunguje tak dobře. Protože velké částice sedimentu rychleji než malé částice, vyšetřovatel může oddělit velké od malých organel, buněk, atd. jednoduše tím, že řídí čas a otáčky odstředivky běhu.
frakcionace diferenciální centrifugací
pro typický buněčný homogenát, a 10 min. spin při nízké rychlosti (400-500 x g) poskytuje peletku sestávající z neporušené tkáně, celých buněk, buněčných jader a velkých zbytků. Pelety s nízkou rychlostí se tradičně nazývají jaderné pelety. 10 min. spin mírně vysokou rychlostí, čímž se získá síly 10 000 až 20 000 x g snižuje mitochondrie spolu s lysozomy a peroxizomy. Proto se druhá peleta v tradičním schématu frakcionace buněk nazývá mitochondriální peleta.
Další frakcionace buněk diferenciální centrifugací vyžaduje použití ultracentrifugy. Takové zařízení je navrženo tak, aby otáčelo rotory při vysokých úhlových rychlostech, aby vytvářelo velmi vysoké G síly. Vzduch musí být čerpán z komory, aby se zabránilo hromadění tepla v důsledku tření vzduchu. Ve skutečnosti mnoho rotorů, které jsou určeny pro ultracentrifuge, není ani aerodynamicky postaveno, protože jsou spřádány ve vakuu. Hodinový vysokorychlostní ultracentrifugační běh, který generuje sílu řádově 80 000 x g, získá mikrosomální peletu. Mikrosomy zahrnují fragmenty membrány, včetně buněčné membrány a endoplazmatického retikula. Membránové fragmenty tvoří vezikuly, když jsou narušeny ve vodném médiu, takže vyšetření by odhalilo četné membránové vezikuly různých velikostí. Samotné vezikuly mohou být odděleny na základě hustoty v důsledku měnícího se obsahu bílkovin. Ale to je téma pro jiný dokument.
se točí několik hodin při 150 000 x g nebo tak, a můžete snížit ribozomy a dokonce i největší makromolekuly. Supernatant, který zůstává, se skládá z rozpustných složek cytoplazmy, včetně solí, malých makromolekul a prekurzorových molekul a rozpuštěných plynů.