Discussion
La méthode de cytométrie d’image proposée dans ce travail démontre la capacité d’analyser rapidement et efficacement l’autophagie dans les cellules vivantes pour le dépistage de médicaments potentiels pouvant induire ou inhiber des activités autophagiques, telles que la promotion de la clairance des protéines mal repliées associées à la neurodégénérescence ou l’inhibition de la résistance aux médicaments associée au cancer. La limitation des méthodes actuelles peut être surmontée par la cytométrie d’image et des réactifs uniques pour développer une nouvelle méthode de détection de l’autophagie. La vision par cellomètre a déjà été utilisée pour des dosages à base de cellules fluorescentes (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et coll., 2011), et il a été démontré que le colorant autophagique Cyto-ID colorait spécifiquement les autophagosomes dans les cellules vivantes. Dans ce travail, le colorant Cyto-ID se colocalise avec la RFP-LC3 dans des cellules HeLa affamées, ce qui valide davantage la spécificité du colorant. La méthode développée de détection de l’autophagie basée sur des images est comparée à la cytométrie en flux standard en comparant les résultats de l’activité de l’autophagie dans les cellules Jurkat affamées de nutriments. Les résultats ont montré une augmentation de l’intensité fluorescente dans les cellules dépourvues de nutriments et une diminution pour les cellules Jurkat récupérées. Cependant, les valeurs d’AAF mesurées de la cytométrie d’image sont considérablement plus élevées que la cytométrie en flux, ce qui pourrait être dû à des différences entre l’instrumentation et les méthodes. Le cytomètre d’image de vision à cellomètre utilise un dispositif à couplage de charge pour la mesure de la fluorescence, tandis que le cytomètre de flux FACS Calibur utilise un tube photo-multiplicateur (PMT). De plus, la méthode d’analyse des intensités fluorescentes différait également entre les deux systèmes. Le cytomètre en flux mesure les signaux de fluorescence totale de chaque cellule, tandis que le système basé sur des images acquiert des images et analyse des autophagosomes colorés par fluorescence à l’intérieur des cellules, ce qui peut fournir des mesures plus précises de l’activité de l’autophagie. Le logiciel de cellomètre peut analyser la fluorescence des cellules en additionnant le total des pixels fluorescents dans chaque cellule, ou en mesurant uniquement les pixels à haute intensité fluorescente des autophagosomes dans chaque cellule. Une autre différence pourrait être causée par le stress de cisaillement de la cytométrie en flux affectant la viabilité des cellules cibles (Robey et al., 2011).
Le flux autophagique est également un test important pour développer une nouvelle méthode de détection. Le CQ est utilisé pour inhiber la dégradation lysosomale des autophagosomes, où l’activité autophagique serait la plus élevée pour les cellules Jurkat affamées de nutriments en présence de CQ en raison de l’interaction synergique entre les traitements. Le prochain plus élevé serait les cellules Jurkat en famine sans CQ. Seule une légère augmentation de l’activité autophagique serait observée par les cellules Jurkat avec CQ uniquement par rapport au contrôle en raison de l’accumulation d’autophagolysosomes basaux. Les résultats du flux autophagique obtenus à partir des deux instruments ont montré des tendances similaires, mais les valeurs de l’AAF mesurées en cytométrie d’image sont significativement plus élevées. Ces résultats ont démontré que la méthode de détection cytométrique par image pouvait être facilement mise en œuvre pour examiner l’activité de l’autophagie, malgré les différences quantitatives potentiellement spécifiques à l’instrument dans les valeurs de l’AAF.
Afin de démontrer que la cytométrie d’image peut être une technologie potentielle de criblage de découverte de médicaments, la capacité d’analyser des échantillons dans de multiples conditions doit être testée. La cytométrie d’image est utilisée pour mesurer l’activité autophagique des cellules Jurkat traitées avec de la rapamycine à diverses concentrations, afin de démontrer la capacité de la cytométrie d’image à mesurer les effets dose–réponse au cours d’une étude au cours du temps. En conséquence, la cytométrie basée sur l’image est capable de détecter les différences d’activité autophagique dans diverses conditions expérimentales. Sur la Fig. 8.6, l’activité autophagique (mesurée par les valeurs de l’AAF) est la plus élevée après 18 h d’incubation. Une légère diminution des valeurs d’AAF est montrée entre 8 et 4 h d’incubation, ce qui peut être dû au fait de ne pas permettre aux cellules de se rétablir complètement après le traitement médicamenteux initial. De plus, des cellules adhérentes telles que la lignée cellulaire du cancer de la prostate humaine (PC-3) peuvent également être mesurées à l’aide de la méthode de cytométrie par image. La résolution d’imagerie de la vision par cellomètre permet d’analyser des autophagosomes marqués par fluorescence (puncta), observés à la fois dans des images fluorescentes et des histogrammes d’intensité de fluorescence.
Il est également important de démontrer la capacité de caractériser différents composés médicamenteux en comparant leur effet dose–réponse autophagique pour les campagnes de découverte de médicaments. Les effets dose–réponse du tamoxifène et de la rapamycine sont directement comparés par cytométrie d’image. Les résultats à 18 h d’incubation ont montré que la rapamycine induisait un niveau d’activité autophagique plus élevé que le tamoxifène. Il est important de noter que le tamoxifène à 100 µM est hautement cytotoxique, entraînant la mort et la désintégration des cellules Jurkat après 18 h d’incubation. La vérification basée sur l’image de l’effet de cytotoxicité du tamoxifène à forte concentration peut être très utile pour éliminer les incertitudes provenant uniquement des résultats du diagramme de dispersion et de l’histogramme.
La cytométrie d’image a démontré des résultats comparables à la cytométrie en flux standard pour l’analyse à base de cellules fluorescentes (Chan et al., 2011; Robey et coll., 2011). La méthode de cytométrie basée sur l’image peut offrir plusieurs avantages par rapport à la cytométrie en flux. Par exemple, le nombre de cellules requis pour chaque échantillon (10-20 µL) est nettement inférieur à un cytomètre en flux classique (300-500 µL). La configuration initiale sur le cytomètre en flux nécessite que certains des échantillons de cellules cibles soient utilisés pour les tensions PMT et le réglage de la compensation. D’autre part, de nombreux cytomètres d’image pipettent des cellules dans une chambre de comptage qui peut être analysée plusieurs fois. Par conséquent, les échantillons de cellules cibles ne sont pas gaspillés lors de l’optimisation initiale de l’ajustement du temps d’exposition et de la mise au point. Plus important encore, l’avantage de capturer des images BR et fluorescentes permet aux chercheurs de vérifier visuellement les données de fluorescence acquises. Cela peut aider à identifier la cytotoxicité comme un effet secondaire compliqué d’un test de traitement médicamenteux qui induit l’autophagie.
L’autofluorescence peut se produire à l’aide du colorant autophagique vert Cyto-ID grâce à la chambre de comptage en plastique, mais le logiciel peut supprimer automatiquement le signal de fond pour obtenir la fluorescence cible réelle sans modifier le calcul de l’AAF. De plus, le photoblanchiment des sondes fluorescentes dans les tests à base de cellules est minimisé car Cellometer Vision utilise des LED de faible puissance par rapport aux lasers de haute puissance utilisés dans d’autres instruments. L’amélioration future du cytomètre d’image du cellomètre consisterait à développer un système automatisé à plus haut débit capable d’analyser plus de cellules pour une analyse statistique améliorée, ainsi que la capacité d’analyser plusieurs échantillons simultanément, facilitant le dépistage cellulaire à plus haut débit des inhibiteurs et des activateurs de l’autophagie, de l’apoptose, de la nécrose et d’autres phénomènes physiologiques d’intérêt.