Actomyosin kontraktilitet skalaer med myoblast forlængelse og forbedrer differentiering gennem Yap nuklear eksport

myoblaster vedtager en langstrakt form for at differentiere og regulere deres actinnetværk til spredningsområdet

for at vurdere forholdet mellem celleform, actinnetværk og fokale adhæsioner dyrkede vi c2c12 myoblaster på et homogent lag af fibronectin (FN). Efter 24 timer i kultur blev myoblaster fikseret og farvet for actin for at bestemme deres morfologiske parametre (Fig. 1A). FN-coatede substrater tillod etablering af specifikke celle-substratinteraktioner ved at rekruttere specifikke transmembranintegriner. Faktisk udtrykkes flere underenheder af karrus integrin, der kombineres med karrus1-underenhed, under skeletmyogenese, hvilket er vigtigt i MyoGen cellemigration,myoblastfusion, muskelfibermodning eller ved vedligeholdelse af muskelintegritet32, 33. Yderligere eksperimenter udført på Laminin (LAM)-belagte substrater indikerede, at begge morfologiske parametre (celleformindeks, celleperimeter og celleområde, supplerende Fig. 1A) og celle-substratinteraktioner (antal og område af fokale adhæsioner, supplerende Fig. 1B) var statistisk ens på FN og LAM, validering af FN-belægningen til undersøgelse in vitro morfologierne af c2c12-myoblaster under fusion/differentieringsprocessen.

Vi kvantificerede celleformindekset (CSI), der karakteriserede myoblasternes morfologi ved at give information om den cellulære forlængelse. Afrundede celler har en CSI tæt på 1, mens aflange celler har en CSI tæt på 0. Vi fandt CSI i området fra 0,1 til 0,8 med en middelværdi på 0.37 0,15 (n = 101), hvilket tyder på en stor variation i cellemorfologier (Fig. 1B). Myoblaster udviste en gennemsnitlig omkreds på 259 liter 82 liter (Fig. 1C, n = 101) og bred vifte af spredningsområder (fra ~1000 til ~4000 liter 2) med en middelværdi på 2057 liter 618 liter 2 (Fig. 1D, n = 101). Disse fund opnået på c2c12 myoblaster blev styrket ved at udføre yderligere morfologiske målinger (CSI, celleperimeter og celleområde) på primære humane myoblaster (16ubic, supplerende Fig. 2A), der kommer fra biceps af en patient upåvirket af FSHD (dvs. der er blevet bekræftet at mangle en 4KA sletning). Som vist i supplerende Fig. 2B-D, viser vores resultater, at CSI for 16ubiske myoblaster varierede fra 0,14 til 0,86 med en gennemsnitsværdi på 0,44 liter 0,17 (n = 90), hvilket antyder en stor variation i cellemorfologier for humane myoblaster, som observeret for c2c12-celler. Samlet set viser vores resultater, at variabiliteten af cellemorfologier ikke er afhængig af celletypen eller nogen artefakt af cellekulturen.

Vi studerede derefter fordelingen af actinfilamenter i en population af c2c12 myoblaster for at forstå, om variabilitetsspredningsområderne kan modulere actincytoskelettet. Vores resultater viste, at den samlede fluorescensintensitet af F-actin-netværket var lineært relateret til det cellulære område (Fig. 1E, n = 31, R2 = 0,748), hvilket antyder, at jo større myoblast spredes, jo flere actinfilamenter dannes. Som vist i supplerende Fig. 3, karakteriserede vi derefter fordelingen af vinculin-indeholdte adhæsioner for at bestemme, hvordan variationer i celleform påvirker celle-substratinteraktioner i c2c12 myoblaster. Vi fandt ud af, at det samlede areal af celle-substratadhæsioner pr. 1F, n = 31, R2 = 0,783) og med fluorescensintensiteten af F-actin (Fig. 1G). Vores resultater indikerer, at c2c12-myoblaster antager en række celleformer og spredningsområder, men tilpasser igen både mængden af actinfilamenter og vinculin-adhæsioner til deres spredning. For at få mere indsigt i celleformens rolle for myoblastdifferentiering overvejer vi derefter udviklingen af celleformatforholdet under proliferation (P0 ved 6 timer og P2 ved 48 timer) og differentiering (D2 ved 96 timer) trin (Fig. 1 time). Som vist i Fig. 1I, J, vores fund viser, at myoblaster øgede deres billedformat fra 0,40 liter 0,16 (P0) til 0,36 liter 0,09 (P2) og 0,24 liter 0,07 (D2), hvilket antyder, at myoblaster forlænger markant og vedtager et billedformat på 1:4 for at differentiere. Derudover viste vores resultater, at actinspændingsfibrene var stærkt orienterede ved D2 (supplerende Fig. 4A, B), svarende også til signifikante nukleare forlængelser (supplerende Fig. 4C). Samlet set viser vores fund, at f-actin-netværket moduleres ved ændringer af myoblastmorfologien og indikerer, at myoblastdifferentiering krævede cellulær forlængelse op til et billedformat på 1:4.

den rumlige organisering af actin-netværket og kernen styres af myoblast-morfologien

vi kontrollerede den iboende variation i myoblast-morfologier ved hjælp af klæbende mikromønstre til at standardisere deres spredningsområder og kontrollere deres former. Ved at bruge en mikrokontaktudskrivningsteknik20 skabte vi klæbende mikromønstre af fibronectin (FN) med et konstant areal på 1600 liter 2 og forskellige geometrier. Vi brugte afrundet (CSI = 1), kvadreret (CSI = 0,79), trekantet (CSI = 0,60) og forskellige aspektforhold på rektangulært (CSI = 0,50 og 0,34 for 1: 4 og 1:7 aspektforhold, henholdsvis) FN mikromønstre til kultur individuelle myoblaster (Fig. 2A). Disse forskellige geometrier af mikromønstre gjorde det muligt at standardisere myoblastformen in vitro over et bredt område og kontrollere deres spredningsområde.

for kvantitativt at bestemme cellegeometriens rolle på den rumlige organisation af actincytoskelettet bestemte vi orienteringen af actinfilamenterne for hver celleform34, 35. Actinfilamenter farvet med phalloidin blev farvekodet som en funktion af deres orientering med en farvegradient, der spænder fra lyseblå, når actinfilamenter blev organiseret parallelt (0 liter) til den vandrette akse og rød (+90 liter) eller orange (-90 liter) for dem, der var organiseret vinkelret på den vandrette akse (Fig. 2B). Vi observerede, at actinfilamenter i afrundede celler blev fordelt tilfældigt med orienteringer fra -90 liter til +90 liter. Kvadrerede celler udstillede actinfilamenter organiseret i tre hovedvinkeldomæner: 0° til 25°, 50° og 90° c og -50° til -90°, mens trekantede celler viste actin filamenter primært organiseret i henhold til de tre sider af mønster på 0°, 60° -60°. Interessant nok fandt vi, at actinfilamenter var meget orienterede parallelt med den lange celleakse (0 liter) for rektangulære celler på 1:4 (CSI = 0,50) og 1:7 (CSI = 0,34) billedforhold. Kvantificeringen af vinculinholdige adhæsioner indikerede ingen statistiske forskelle i adhæsionsområder mellem cellemorfologier (supplerende Fig. 5A-C), hvorimod orienteringen af fokale adhæsioner blev moduleret ved celleform (supplerende Fig. 5D, E), som observeret for actinfilamenter. Vores resultater viser, at både 1: 4 og 1: 7 rektangulære myoblaster tillader en stærkere organisering af actincytoskelet (Fig. 2C) og fokale adhæsioner, hvilket tyder på, at myoblastforlængelse fører til dannelsen af kontraktile dipoler.

i betragtning af cellekernens rolle i differentiering af myoblaster i myotubes undersøgte vi derefter, om ændringer i celleform og cytoskeletarkitektur kan modulere formen og orienteringen af kernen36. Vi fandt ud af, at det nukleare aspektforhold steg markant med sænkning af CSI (Fig. 2D). Faktisk viste afrundede celler (CSI = 1) på cirkulære mikromønstre en afrundet kerne, der var kendetegnet ved et gennemsnitligt billedformat på 1,11 liter 0,06, mens rektangulære celler med et billedformat på 1:4 (CSI = 0,50) og 1:7 (CSI = 0,34) udviste store nukleare deformationer med billedformat på henholdsvis 1,39 Pund 0,21 og 2,19 Pund 0,23. Vi bemærkede også, at orienteringen af kernen blev moduleret af cellemorfologien (Fig. 2E). Vi fandt ud af, at orienteringen af kernen i afrundede, kvadrerede og trekantede celler strakte sig over en bred vifte af vinkler (fra ~15 pund til ~60 pund) med en gennemsnitlig orientering på ~40 pund (cirkulær, n = 11), ~33 pund (firkant, n = 14) og ~43 pund (trekant, n = 10) i forhold til den vandrette akse. For rektangulære celler indikerede vores resultater, at kernen var orienteret parallelt med celleaksen med en gennemsnitlig vinkel på ~14 liter (1:4, n = 15) og ~2 liter (1:7, n = 10).

Celleforlængelse forbedrer myoblast kontraktilitet

det næste spørgsmål, vi behandlede, var, hvordan ændringer i celleform påvirker myoblast kontraktilitet. For at besvare dette spørgsmål brugte vi trækkraftmikroskopi (TFM) til at bestemme de trækkraftspændinger, der udøves af mikromønstrede myoblaster. Som vist i Fig. 3A observerede vi, at de maksimale spændinger blev udøvet ved ekstremiteterne af de mikromønstrede myoblaster, uanset celleformen. Som tidligere observeret på andre celletyper37 akkumulerede kontraktilspændingen fortrinsvis i hjørnerne (firkanter og trekanter) eller i begge ekstremiteter (1:4 og 1:7 rektangler) af mikromønstrede myoblaster. Vi kvantificerede den samlede stress, der udøves af individuelle mikromønstrede myoblaster for at bestemme, om cellemorfologien modulerer cellekontraktiliteten. Som vist i Fig. 3B, afrundede celler (CSI = 1) udøvede en total stress på 170,7 liter 46,4 N/m2, mens rektangulære celler (CSI = 0,34, billedformat 1:7) udøvede en større samlet mængde stress (295,9 liter 156.8 N / m2), hvilket antyder, at aflange celleformer fører til øgede trækkraftspændinger. Desuden fandt vi, at rektangulære formede celler (CSI = 0,34, billedformat 1:7) udviste den større maksimale spændingsværdi (684,3 liter 257,8 Pa, Fig. 3C), mens afrundede myoblaster viste den laveste maksimale spændingsværdi (351,5 til 123,6 Pa). I betragtning af at de kontraktile spændinger blev udøvet ved celleperiferien, og at sænkning af CSI fører til øgede trækkraftspændinger, afbildede vi den maksimale spændingsværdi som en funktion af afstanden fra massens centrum til cellens ekstremitet (Fig. 3D), som repræsenterer 22,6 liter (CSI = 1), 28,28 liter (CSI = 0,79), 33,98 liter (CSI = 0,60), 41,23 liter (CSI = 0,50) og 53,45 liter (CSI = 0,34). Som vist i Fig. 3D fandt vi, at den maksimale kontraktile stress steg lineært med afstanden fra centroid til ekstremiteten af cellen (R2 = 0,958, n = 65), hvilket tyder på, at langstrakte morfologier af myoblaster udøver flere trækkræfter.

for at bestemme actomyosin-netværkets Bidrag til etablering af kontraktile kræfter i myoblaster blev c2c12-celler behandlet med G-actin-sekvestrerende lægemiddel Latrunculin B (LatB) og med myosin II-hæmmeren Blebbistatin (Bleb). Immunforstærkede myoblaster med phalloidin indikerede, at LatB-og Bleb-behandlede celler udviste et diffust actinnetværk (Fig. 3E), hvilket viser, at begge lægemidler påvirkede organisationen af F-actin markant. Vi brugte TFM på mikromønster myoblaster behandlet med begge lægemidler til at bestemme actomyosin-netværkets rolle i etableringen af kontraktile kræfter i myoblaster med forskellige geometrier. Vores fund indikerer, at LatB-behandling inducerede et signifikant tab af kontraktilitet, som steg med celleforlængelsen. Faktisk viste afrundede celler et tab af kontraktil stress på ~62%, mens 1:4 og 1:7 rektangulære celler behandlet med LatB var karakteriseret ved et tab af kontraktil stress på henholdsvis ~88% og ~86% (Fig. 3F). Derudover fandt vi, at den kontraktile stress på 1:4 rektangulære celler behandlet med Bleb blev kendetegnet ved et tab på ~80% af den kontraktile kraft, hvilket viser, at myosin II molekylære motorer er nøgleaktører for myoblast kontraktile kræfter.

tilsammen indikerer disse resultater, at kontraktiliteten af actomyosin-netværket forbedres i aflange myoblaster gennem etablering af et tæt netværk af parallelle actomyosinfibre.

kontraktiliteten af cellepar steg efter deres fusion og hæve på aflange mikromønstre

for at forstå, hvordan myoblastmorfologi kan påvirke kontraktile egenskaber hos myotubes, betragter vi en minimal model af to myoblaster. Vi bestemte først trækkræfterne udøvet af celledobbler ved P1 (24 h i proliferationsmedier) belagt på mikromønstre af forskellige former (supplerende Fig. 6A). Der var ingen statistiske forskelle i kontraktil stress mellem den brede vifte af CSI (supplerende Fig. 6B), på trods af en veldefineret orientering af actin-netværket (supplerende Fig. 6C) og kernerne (supplerende Fig. 6D, E) på 1:4 og 1:7 rektangulære mikromønstre. Baseret på denne observation kvantificerede vi derefter den kontraktile stress, der udøves af celledobbler dyrket på cirkulære (CSI = 1) og rektangulære (CSI = 0,50, 1:7 billedforhold) FN-mikromønstre i løbet af yderligere fem dage (D5, Fig. 1H) i differentiering medium. Vi brugte Mitotracker Red Cmksros (ThermoFisher Scientific), en levende mitokondriel farvning, for at sikre, at myoblast-dubletter blev smeltet sammen (Fig. 4A) 38. Som vist i Fig. 4B, C, fandt vi, at den samlede kontraktile stress var lidt forøget i smeltede celledubletter dyrket på cirkulære mikromønstre (267 liter 64 Pa) sammenlignet med cirkulære ufusede celledubletter (157 liter 37 Pa), hvorimod smeltede aflange dubletter var mere end to gange mere kontraktile (543 liter 193 Pa) end ufusede aflange dubletter (211 liter 73 Pa). Disse resultater indikerer, at den cellulære kontraktilitet steg efter cellefusion og blev signifikant forbedret for langstrakte morfologier.

Actomyosin kontraktilitet fremmer myotube differentiering

Vi spurgte derefter, om actomyosin kontraktilitet af myoblaster kunne påvirke myotube differentiering. C2c12 myoblaster blev dyrket på FN-coatede substrater i proliferationsmedier i 2 dage (P2, Fig. 1H) for at nå den cellulære sammenløb. Derefter blev enten LatB eller Bleb tilsat i 30 minutter, og proliferationsmediet blev erstattet af et differentieringskulturmedium. Efter 4 dage i differentieringsmedium (D4, Fig. 1H) blev c2c12-celler fikseret og farvet for DNA og TroponinT, en markør for differentiering (Fig. 5). Vi vurderede effekten af LatB-og Bleb-behandlinger ved farvning af alpha actinin på kontrol myotubes (CTRL) og myotubes behandlet med Latrunculin B (+LatB) og blebbistatin (+Bleb). Som observeret i supplerende Fig. 7, Kontrol myotubes præsenterer typiske stribede med båndmønstre, hvorimod LatB-og Bleb-behandlinger forstyrrer striationsmønstre i myotubes. Kontrol myotubes (CTRL) blev karakteriseret ved et gennemsnitligt billedformat på 7,99 liter 3,38 (Fig. 5A) og et positivt Troponin T-område på 51,7 liter 5,6% (Fig. 5B). Vores resultater tyder på, at LatB-og Bleb-behandlinger reducerede fraktionen af Troponin T-området til henholdsvis 44,9 liter 5,2% og 44,4 liter 5,1%. Derudover fandt vi, at fusionsindekset var statistisk lavere for LatB (27 liter 3%) og Blebb-behandlede (29 liter 3%) celler end for kontrolceller (38 liter 5%), hvilket styrkede actomyosinkontraktilitetens rolle i myoblastdifferentiering (Fig. 5C). Samlet set indikerede disse resultater, at myoblasts actomyosinkontraktilitet fremmer myotube-differentiering.

myoblastforlængelse udløser Yap-nuklear eksport, hvilket er afgørende for differentieringen af myoblaster i myotubes

for at få mere indsigt i de intracellulære mekanismer, der styrer myotube-differentieringen, overvejer vi YAP ‘ s rolle ved at bestemme dens lokalisering i enten cytoplasmaet eller kernen i myoblaster, hvor den binder til og aktiverer myoblaster, der tead transskription faktorer39. Til dette formål kvantificerede vi det cytoplasmatiske/nukleare YAP-forhold i mikromønstrede myoblaster (Fig. 6A og supplerende Fig. 8). Celleforlængelse på 1:4 og 1: 7 rektangulære mikromønstre øgede det cytosoliske/nukleare YAP-forhold (Fig. 6B), hvilket antyder, at celleforlængelse udløser Yap-nuklear eksport gennem nukleare kompressionskræfter udøvet af actomyosin-netværket40. For at verificere, om lokaliseringen af YAP i enten cytoplasmaet eller kernen er relateret til specifikke stadier af differentieringsprocessen, farvede vi YAP i c2c12-celler efter 24 h (P1) og 48 h (P2) af proliferationstrinnet og ved 96 h (D2) og 264 h (D9) af differentieringstrinnet (Fig. 6C og supplerende Fig. 9). Interessant nok viste vores resultater, at det cytoplasmatiske/nukleare YAP-forhold steg fra 0,37 liter 0,07 ved P1 til 0,68 liter 0,06 ved P2 og 0,67 liter 0,06 ved D2 og derefter faldt til 0,42 liter 0,10 ved D9 (Fig. 6D). Interessant nok viste det cytoplasmatiske / nukleare YAP-forhold ved D9 sig at være statistisk ikke forskelligt fra P1-værdier, hvilket antyder, at det cytoplasmatiske/nukleare YAP-forhold i differentierede myotuber svarer til myoblasts. For at verificere disse resultater høstede vi myoblaster på spredningstrinnet P1 (24 h) og differentieringstrinnet D2 (96 h), og vi isolerede deres cytoplasmatiske og nukleare materialer. Vi udførte en bicinchoninsyre (BCA) proteinassay, og proteinerne indeholdt i cytoplasmatiske og nukleare ekstraktioner blev analyseret ved elektroforese (Fig. 6E). Vores vestlige blot-fund viste, at det cytoplasmatiske/nukleare YAP-forhold steg fra 0,62 liter 0,08 ved P1 til 0,87 liter 0,24 ved D2 (Fig. 6F). Denne biokemiske kvantificering af YAP demonstrerede en betydelig Yap-nuklear eksport til differentiering af c2c12-celler og styrker vores fund.

baseret på disse resultater vurderede vi YAP ‘ s rolle ved at bruge leptomycin B til at blokere aktiv eksport fra kernen ved direkte binding til eksportin141. Faktisk har Alberto Elosegui-Artola og kolleger vist for nylig, at leptomycin B (LMB) kan bruges effektivt til at undersøge, hvordan kontraktile kræfter, der udøves af cytoskelettet, driver YAP nuklear translokation39. Ved at behandle c2c12-myoblaster ved P2 (48 h) med LMB fandt vi, at det cytoplasmatiske til nukleare YAP-forhold var signifikant lavere i LMB-behandlede celler ved D2 (96 h, Fig. 6G), hvilket antyder, at YAP hovedsageligt er koncentreret i kernen, når den nukleare eksport hæmmes. Derudover viste vores resultater, at fusionsindekset ved D4 af LMB-behandlede celler (Fig. 6H) var meget lav (3,8 large 1.5%) sammenlignet med kontrolceller (42,4 liter 9,1%), hvilket viser, at aktiv nuklear eksport er nødvendig for c2c12-differentiering.