Diskussion
billedcytometrimetoden foreslået i dette arbejde demonstrerer evnen til hurtigt og effektivt at analysere autofagi i levende celler til screening af potentielle lægemidler, der kan inducere eller hæmme autofagiske aktiviteter, såsom at fremme clearance af forkert foldede proteiner forbundet med neurodegeneration eller hæmme lægemiddelresistens forbundet med kræft. Begrænsning i de nuværende metoder kan overvindes ved billedcytometri og unikke reagenser for at udvikle en ny metode til autofagidetektion. Cellometersyn er tidligere blevet brugt til fluorescerende cellebaserede analyser (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et al., 2011), og Cyto-ID autophagy-farvestoffet har vist sig specifikt at plette autophagosomer i levende celler. I dette arbejde er Cyto-ID-farvestoffet vist at kolokalisere med RFP-LC3 i sultede HeLa-celler, som yderligere validerer farvestoffets specificitet. Den udviklede billedbaserede autofagidetekteringsmetode er benchmarket mod standardstrømningscytometri ved at sammenligne autofagiaktivitetsresultaterne i næringsstøvede Jurkat-celler. Resultaterne viste en stigning i fluorescerende intensitet i næringsstøvede celler og et fald for genvundne Jurkat-celler. Imidlertid er de målte AAF-værdier for billedcytometri betydeligt højere end strømningscytometri, hvilket kan skyldes forskelle mellem instrumentering og metoder. Det Cellometer Vision image cytometer bruger en ladningskoblet enhed til fluorescensmåling, mens FACS Calibur strømningscytometer bruger et foto-multiplikatorrør (PMT). Derudover varierede metoden til analyse af fluorescerende intensiteter også mellem de to systemer. Strømningscytometeret måler totale fluorescenssignaler fra hver celle, mens det billedbaserede system erhverver billeder og analyserer fluorescerende farvede autofagosomer i cellerne, hvilket kan give mere nøjagtige målinger af autofagiaktivitet. Cellometerprogrammet kan analysere fluorescens af celler ved at summere de samlede fluorescerende billedpunkter i hver celle eller kun måle de høje fluorescerende intensitetspunkter fra autophagosomer inden for hver celle. En anden forskel kan være forårsaget af forskydningsspænding af strømningscytometri, der påvirker levedygtigheden af målcellerne (Robey et al., 2011).
Autofagisk strømning er også et vigtigt assay til udvikling af en ny detektionsmetode. CK anvendes til at hæmme lysosomal nedbrydning af autophagosomer, hvor den autofagiske aktivitet ville være den højeste for næringsstøvede Jurkat-celler i nærvær af CK på grund af synergistisk interaktion mellem behandlingerne. Den næsthøjeste ville være Jurkat-celler i sult uden CK. Kun en lille stigning i autofagisk aktivitet ville kun blive udstillet af Jurkat-celler med CK i sammenligning med kontrollen på grund af akkumulering af basale autophagolysosomer. De autofagiske strømningsresultater opnået fra begge instrumenter viste lignende tendenser, men AAF-værdierne målt i billedcytometri er signifikant højere. Disse resultater viste, at billedcytometrisk detektionsmetode let kunne implementeres for at undersøge autofagiaktivitet på trods af de potentielt instrumentspecifikke kvantitative forskelle i AAF-værdierne.
for at demonstrere, at billedcytometri kan være en potentiel screeningsteknologi til lægemiddelopdagelse, skal evnen til at analysere prøver under flere forhold testes. Billedcytometri bruges til at måle Autofagisk aktivitet af Jurkat–celler behandlet med rapamycin i forskellige koncentrationer for at demonstrere evnen til billedcytometri til at måle dosisresponseffekter over en tidsforløbsundersøgelse. Som et resultat er billedbaseret cytometri i stand til at detektere forskellene i autofagisk aktivitet på tværs af forskellige eksperimentelle forhold. I Fig. 8.6 er den autofagiske aktivitet (målt ved AAF-værdier) den højeste efter 18 timers inkubation. Et lille fald i AAF-værdier vises mellem 8 og 4 H inkubation, hvilket kan skyldes, at cellerne ikke kan komme sig fuldstændigt efter den indledende lægemiddelbehandling. Derudover kan klæbende celler, såsom den humane prostatacancercellelinie (PC-3), også måles ved hjælp af billedcytometri-metoden. Billeddannelsesopløsningen af Cellometersyn kan analysere fluorescerende mærkede autophagosomer (puncta), observeret i både fluorescerende billeder og fluorescensintensitetshistogrammer.
det er også vigtigt at demonstrere evnen til at karakterisere forskellige lægemiddelforbindelser ved at sammenligne deres autofagiske dosis–respons effekt for lægemiddelopdagelseskampagner. Dosis-respons virkninger af rapamycin og tamoksifen sammenlignes direkte ved hjælp af billede cytometri. Resultaterne ved inkubation på 18 timer viste, at rapamycin inducerede et højere niveau af autofagiaktivitet end tamoksifen. Det er vigtigt at bemærke, at tamoksifen ved 100 liter er meget cytotoksisk, hvilket fører til Jurkat celledød og desintegration efter 18 h inkubation. Den billedbaserede verifikation af cytotoksicitetseffekt ved høj koncentration kan være yderst nyttig til at eliminere usikkerheder fra kun scatter plot og histogramresultater.
Billedcytometri har vist sammenlignelige resultater med standardstrømscytometri til fluorescerende cellebaseret analyse (Chan et al., 2011; Robey et al., 2011). Billedbaseret cytometri-metode kan tilbyde flere fordele i forhold til strømningscytometri. For eksempel er antallet af celler, der kræves for hver prøve (10-20 liter), signifikant mindre end et konventionelt strømningscytometer (300-500 liter). Den indledende opsætning på strømningscytometer kræver, at nogle af målcelleprøverne bruges til PMT-spændinger og kompensationsjustering. På den anden side pipetter mange billedcytometre celler ind i et tællekammer, der kan omscannes flere gange. Derfor spildes målcelleprøver ikke under den indledende optimering af eksponeringstidsjustering og fokusering. Endnu vigtigere er fordelen ved at fange BR-og fluorescerende billeder, at forskere visuelt kan verificere erhvervede fluorescensdata. Dette kan hjælpe med at identificere cytotoksicitet som en komplicerende bivirkning af et lægemiddelbehandlingsassay, der inducerer autofagi.
Autofluorescens kan forekomme ved hjælp af Cyto-ID Green autophagy dye på grund af plasttællingskammeret, men programmet kan automatisk fjerne baggrundssignalet for at opnå den faktiske målfluorescens uden at ændre AAF-beregningen. Derudover minimeres fotoblegning af fluorescerende sonder i cellebaserede analyser, da Cellometersyn bruger LED ‘ er med lavere effekt sammenlignet med de højeffektive lasere, der anvendes i andre instrumenter. Fremtidig forbedring af Cellometerbilledcytometeret ville være at udvikle et automatiseret system med højere gennemstrømning, der kan analysere flere celler til forbedret statistisk analyse samt evnen til at analysere flere prøver samtidigt, hvilket letter cellebaseret lægemiddelscreening med højere gennemstrømning af hæmmere og aktivatorer af autofagi, apoptose, nekrose og andre fysiologiske fænomener af interesse.