- abstrakt
- 1. Introduktion
- 2. Materialer og metoder
- 2.1. Dyr
- 2, 2. Cellekulturer
- 2, 3. Immunofluorescensfarvningsassay
- 2, 4. Vestlig plet
- 2, 5. Kvantitativ (Real-Time) polymerasekædereaktion (real-time PCR)
- 2, 6. Statistisk analyse
- 3. Resultater
- 3.1. Fordelingen af astrocytter mærket af NDRG2, GFAP og S100 liter i forskellige cerebrale regioner
- 3.2. Morfologierne for astrocytter mærket med NDRG2, GFAP og S100-kr i forskellige cerebrale regioner
- 3.3. Kolokaliseringen af NDRG2, GFAP og S100 i astrocytter i forskellige cerebrale regioner
- 3, 4. Ekspressionen af NDRG2 -, GFAP-og S100-Kurproteiner i forskellige cerebrale regioner
- 4. Diskussion
- datatilgængelighed
- Disclosure
- interessekonflikter
- forfatteres Bidrag
- anerkendelser
- supplerende materialer
abstrakt
astrocytter har forskellige morfologiske egenskaber afhængigt af den cerebrale region, hvor de findes. Imidlertid kan ingen af de nuværende astrocytiske markører mærke alle underpopulationer med succes. Det er således kritisk at identificere den passende markør til en specifik videnskabelig undersøgelse. Her sammenlignede vi fordelingen og proteinekspression af tre astrocytmarkører: NDRG2, GFAP og S100, i hjernebarken, hippocampus og thalamus. NDRG2-og S100-Kurpositive astrocytter blev fordelt mere ensartet end GFAP-positive astrocytter gennem hele hjernen. NDRG2 – og S100-Immunreaktiviteterne var de stærkeste i rygbarken og thalamus, mens GFAP-immunreaktiviteten var den stærkeste i hippocampus. Desuden var proteinekspressionsniveauerne af NDRG2, GFAP og S100-Pyr hos voksne mus de højeste i henholdsvis hjernebarken, hippocampus og thalamus. Vi opdagede også astrocytmorfologi og fandt ud af, at i corpus callosum og cerebral peduncle blev GFAP-positive astrocytter fundet med flere talrige og længere processer end NDRG2 – og S100-Kurpositive astrocytter. Disse resultater viser, at NDRG2 og S100 kr er mere passende anvendt til at visualisere den samlede fordeling og ændringer i antallet af astrocytter samt mærke astrocytter i barken og thalamus. GFAP bruges imidlertid mere hensigtsmæssigt til at mærke astrocytter i corpus callosum, cerebral peduncle og hippocampus. Disse resultater hjælper med at vejlede forskere i valget af passende astrocytmarkør og antyder forskelle i immunologiske kvaliteter af astrocytter baseret på det væv, hvori de findes.
1. Introduktion
astrocytter har længe været betragtet som hjælpeceller, der kun giver trofisk, metabolisk og strukturel støtte til neuroner . I de senere år har omfattende forskning imidlertid vist, at de spiller afgørende roller i cerebrale fysiologiske og patologiske funktioner. Astrocytter hjælper med at opretholde ionhomeostase og blod-cerebrale barrierer, synapsdannelse og fjernelse samt kontrol af cerebral blodgennemstrømning og regulering af neurotransmittergenbrug, glutamat-eksitotoksicitet og antioksidant stress . Det er vigtigt, at astrocytter besidder morfologiske, populations-og funktionelle forskelle i forskellige cerebrale regioner . Derfor er identifikation af den mest passende markør for de polymorfe og flere undergrupper af astrocytter kritisk for forskning i astrocytisk Multifunktion.Glialfibrillært surt protein (GFAP) er den mest almindeligt anvendte astrocytiske markør, men som det største mellemliggende filament, der komponerer cytoskelet , blev GFAP immunmærket kun omkring 15% af det samlede astrocytvolumen, og mere end 40% af astrocytter viste sig at være GFAP-negative hos den voksne rotte hippocampus . Derudover mærkede GFAP protoplasmiske humane astrocytter dårligt og blev udtrykt sent i udviklingen af fibrøse astrocytter .
en anden almindeligt anvendt astrocytisk markør er S100 liter, et Ca2+ bindende peptid, der er rigeligt i cytoplasmaet, og kerne af astrocytter, der er involveret i cellecyklusregulering og cytoskeletmodifikation . Imidlertid udtrykkes S100-kur også i en underpopulation af modne oligodendrocytter, i choroidpleksens epitelceller og i nogle få neuroner . Manglerne ved GFAP og S100 kur i mærkning af astrocytter kan føre til unøjagtigheder eller endda fejl i at udforske astrocytternes funktioner.
N-Myc nedstrømsreguleret Gen 2 (NDRG2) blev først opdaget i et normalt humant cerebralt cDNA-bibliotek ved hjælp af en PCR-baseret subtraktiv hybridiseringsmetode . Det er en tumor suppressor og celle stress-relateret gen forbundet med celleproliferation og differentiering . NDRG2 udtrykkes bredt i hjernebarken, olfaktorisk pære, midcerebral, hippocampusog thalamus . Vigtigst er NDRG2 specifikt udtrykt i hjernens astrocytter . Således betragtes NDRG2 som en ny astrocytisk markør, især for Modne, ikke-reaktive og ikke-prolifererende astrocytter . Hvorvidt NDRG2 er mere pålidelig end GFAP og S100 Kur som en astrocytisk markør, såvel som forskellene i deres fordeling og ekspression i forskellige cerebrale regioner, er imidlertid ikke rapporteret.
i den aktuelle undersøgelse sammenlignede vi fordelingen, proteinekspression og gensidig kolokalisering af astrocytiske markører NDRG2, GFAP og S100-kur gennem hele hjernen hos mus. Vi havde til formål at identificere den mest egnede markør for astrocytter i forskellige cerebrale regioner.
2. Materialer og metoder
2.1. Dyr
unge, voksne og gamle C57BL/6 hanmus i alderen 1 måned, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder og 12 måneder blev opnået fra det eksperimentelle Dyrecenter på Central South University. Dyrene var fri til at spise og drikke, holdt ved en temperatur på 25 liter 1 liter C og anbragt med en 12:12-h lys-mørk cirkel for at simulere dyrets døgnrytme. Alle bestræbelser blev gjort for at minimere dyrelidelse og reducere antallet af anvendte dyr. Alle dyreforsøgsprocedurer fulgte en protokol godkendt af det etiske udvalg for dyreforsøg fra Central South University Animal Care and Use Committee, Kina.
2, 2. Cellekulturer
ht22-cellerne (en neuronal cellelinie) og ma1800-57-celler (en astrocytcellelinie) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Ørnemedium (DMEM, HyClone) indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS, Gibco), 50 U/mL penicillin og 50 liter / mL streptomycin. OLN – 93-cellerne (en oligodendroglialcellelinie) blev holdt i DMEM suppleret med 10% FBS, 2 mM Glutamin, 50 U/mL penicillin og 50 liter/mL streptomycin. Cellerne blev alle opretholdt ved 37 liter C i en blanding af 95% atmosfærisk luft og 5% CO2. HT22-cellerne, OLN – 93-cellerne og MA1800-57-cellerne blev podet på dias og blev farvet med antistoffer mod henholdsvis mikrotubuli-associeret protein 2 (MAP2), Purp-tubulin og GFAP.
2, 3. Immunofluorescensfarvningsassay
efter at musene blev bedøvet med natriumpentobarbital (50 mg/kg), blev deres cerebrums ekstraheret og fikseret med 0,9% kold hepariniseret saltvand og 4% paraformaldehyd. Efter postfiksering blev cerebrums successivt dehydreret i 20% saccharose og 30% saccharoseopløsninger. Sektioner med en tykkelse på 10 liter blev fremstillet under anvendelse af en Leica CM1900 frosset skiver. De cerebrale sektioner blev inkuberet i 1% H2O2 i 15 minutter og 0,3% Triton H-100 i 15 minutter, med 3 liter vask i PBS postinkubation mellem hver behandling. Sektionerne blev derefter blokeret i 5% normalt gedeserum i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet natten over ved 4 liter C i en befugtningsboks med primære antistoffer som følger: mus-anti-GFAP-antistof (#3670, 1:500, Cellesignalteknologi); kanin-anti-NDRG2-antistof (#5667, 1:200, Cellesignalteknologi); mus-anti-NDRG2-antistof (#DA281-6a5, 1:100, Sigma); kanin-anti-S100-antistof (##2017-1, 1:500, epitomics); mus anti-glutamin syntetase (GS) antistof (#mab302, 1:200, Millipore); kanin anti-MAP2 antistof (#ab32454, 1:500, abcam); og mus anti-LARP-tubulin antistof (#T6199, 1:500, Sigma). Derefter blev sektionerne inkuberet med blandinger af Aleksa – 488 (grøn, Invitrogen) og Aleksa-647 (rød, Invitrogen)-konjugeret æsel anti-kanin eller Æsel anti-mus sekundære antistoffer i 2 timer i mørke ved stuetemperatur. 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (SLI-9557, Ssbio) blev brugt til at plette kerner. Sektionerne blev monteret med 50% glycerol. Endelig blev sektionerne set og fotograferet ved hjælp af et Olympus Bh 51 (Japan) fluorescensmikroskop. Antistofferne anvendt i vores undersøgelse blev vidt brugt i vores tidligere undersøgelser og af andre efterforskere , og følsomheden og specificiteten af disse antistoffer er blevet bekræftet.
2, 4. Vestlig plet
barken, hippocampus og thalamus blev opsamlet fra C57BL/6 mus i alderen 1 måned, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder og 12 måneder. Prøverne blev homogeniseret i RIPA-buffer, og koncentrationen af proteinprøverne blev målt ved hjælp af BCA-Proteinassay Kit (Pierce Biotechnology, US). Proteinprøverne blev adskilt af 10% SDS-side (SDS-PAGE Gel kit, CV0022S, Kina) og elektrisk overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Komponenterne i SDS-PAGE Gel kit omfattede en 30% Acr-Bis, SDS-PAGE separerende Gelbuffer, SDS-PAGE stabling Gelbuffer, APS (ammoniumpersulfat) og TEMED (N, N, N’, N’-tetramethylethylendiamin). Derefter blev membranerne blokeret i 5% fedtfri tørmælk fortyndet i TBST (TBS med 0,05% mellem 20) i 1 time ved stuetemperatur og derefter inkuberet med specifikke primære antistoffer: mus anti-GFAP antistof (#3670, 1:1000, Cellesignalteknologi); kanin-anti-NDRG2-antistof (#5667, 1:1000, Cellesignalteknologi); kanin-Anti-S100-antistof (#2017-1, 1:1000, Epitomics); og kanin-anti-GAPDH-antistof (#5174, 1:1000, Cellesignaleringsteknologi) natten over ved 4-kur C. membranerne blev derefter inkuberet med et HRP-konjugeret sekundært anti-kanin-eller anti-mus-antistof (Thermo Scientific, USA) i 2 timer. kemiluminescerende signaler blev udviklet ved hjælp af vestlig lynkemiluminescensreagens plus (PerkinElmer life sciences; Et billede analysator LI-COR Odyssey System (LI-COR Biotechnology, USA). Immunoreaktiviteten af proteinbåndene blev kvantitativt analyseret af Bio-Rad-Billedlaboratoriet. Bånddensitetsværdier blev normaliseret til GAPDH.
2, 5. Kvantitativ (Real-Time) polymerasekædereaktion (real-time PCR)
hjernebarken, hippocampus og thalamus blev opsamlet fra C57BL / 6 mus i alderen 1 måned, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder og 12 måneder. Total RNA blev isoleret ved hjælp af et Transsol Up Plus RNA Kit (kode nr. ER501-01, Transgen, Kina) og kvantificeret ved hjælp af en NanoDrop 2000. Derefter blev 1000 ng af total RNA revers transkriberet i en 20-liters reaktion ved 42-liter C i 15 minutter, efterfulgt af 85-liter C i 5 sek ved hjælp af en Transskript-cDNA-syntese-Superblanding for første streng. AT341, Transgen, Kina). Komponenterne i sættet indeholdt en 5-liters transkript-All-In-One-Superblanding til Kpcr (transkript-RT, Rnasehæmmer, forankret Oligo(dT)18-Primer, tilfældig Primer(N9), dNTPs, buffer), en 5-liters transkript-alt-i-en-ingen-RT-kontrol-Superblanding til kpcr, en gDNA-fjerner og et Rnasefrit vand. Den 5-liters transkript, der blev brugt som en negativ kontrol, blev brugt som en negativ kontrol. Realtids-PCR blev udført i en 20-liters reaktion i henhold til producentens manual for TransStart Tip grøn Superblanding (kode nr. AK141, Transgen, Kina). De anvendte mRNA-primersekvenser findes i tabel 1. Reaktionen blev udført ved 94 liter C i 30 sekunder efterfulgt af 40 cyklusser på 94 liter C i 5 sekunder, 60 liter C i 15 sekunder og 72 liter C i 19 sekunder på ViiA7 realtids PCR-detektionssystem (2720 termisk Cycler, Applied Biosystems). Primerne og sekvenserne afledt af den relative mRNA-ekspression blev analyseret ved hjælp af formlen .
|
||||||||||||||||||||||||
2, 6. Statistisk analyse
statistiske tests blev udført ved hjælp af PRISM v7.0-programmer (GraphPad). Sammenligninger mellem to grupper blev udført ved hjælp af studerendes t-test. Sammenligninger mellem forskellige grupper blev udført ved hjælp af envejs ANOVA med Tukeys posttest. Alle værdier blev præsenteret som middelværdien af SD. Værdier af p <0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.
3. Resultater
3.1. Fordelingen af astrocytter mærket af NDRG2, GFAP og S100 liter i forskellige cerebrale regioner
regionerne af musene cerebra blev identificeret ved mærkning af cellekernerne. Derudover blev en tilsvarende mus hjerneatlas brugt til at verificere de specifikke analyserede regioner (Figur 1). Vi brugte derefter immunofluorescensfarvning til at detektere fordelingen af astrocytter mærket af NDRG2, GFAP og S100 kur i forskellige cerebrale regioner hos voksne hanmus i alderen 6 måneder. NDRG2-og S100-positive astrocytter var mere rigelige og mere jævnt fordelt end GFAP-positive astrocytter i hele hjernen (figur 2). NDRG2-positive astrocytter blev koncentreret i dorsalbarken (Region 1) og thalamus (Region 5), men mindre i hippocampus (Region 4), corpus callosum (Region 3) og ventralbarken (Region 2) og mindst i cerebral peduncle (Region 6) (figur 2(A) og 2(b)). GFAP-positive astrocytter blev koncentreret mest i hippocampus; mindre blev påvist i corpus callosum og cerebral peduncle og næsten ikke detekterbar i dorsalbarken, ventralbarken og thalamus (figur 2(A) og 2(c)). S100-positive astrocytter blev koncentreret mest i dorsalbarken og thalamus, mindre i hippocampus og ventralbarken og mindst af alt i cerebral peduncle og corpus callosum (figur 2(b) og 2(c)). Fordelingen af de NDRG2-positive astrocytter svarede til fordelingen af de S100-Kurpositive astrocytter.
(a)
(a))(a)
(b)
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
astrocytter i forskellige cerebrale regioner præsenterede ulige immunoreaktiviteter for NDRG2, GFAP og S100 oprensning (figur 2). Astrocytter i dorsalbarken og thalamus reagerede kraftigt på NDRG2 og S100, men svagt på GFAP. Astrocytter i hippocampus reagerede kraftigt på GFAP og moderat til NDRG2 og S100. Astrocytter i den ventrale hjernebark, corpus callosum og cerebral peduncle reagerede svagt til moderat til NDRG2, GFAP og S100-liter (tabel 2).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
+++: stærkt positiv; ++: moderat positiv; +: svagt positiv.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
distributionen af astrocytter mærket af NDRG2, GFAP og S100 KOLS i forskellige cerebrale regioner af hanmus svarede til den for gamle hanmus (12 måneder) (figur 3).
3.2. Morfologierne for astrocytter mærket med NDRG2, GFAP og S100-kr i forskellige cerebrale regioner
astrocytter er hovedsageligt opdelt i to typer: fibrøse astrocytter i hvidt stof og de protoplasmatiske astrocytter i gråt stof. Derfor sammenlignede vi morfologierne for de to typer mærket med forskellige markører i corpus callosum (hvidt stof, Region 3) og hippocampus (gråt stof, Region 4) (Figur 4). Resultaterne fra voksne hanmus (6 måneder) viste, at NDRG2 – og S100-Kurpositive astrocytter præsenterede en stjerneform karakteriseret ved stor og rund soma sammen med korte og grove cytoplasmatiske processer, der havde få grene. De GFAP-positive astrocytter præsenteret med en radial form karakteriseret ved små soma, lange processer og multigrene (figur 4). Desuden i corpus callosum og cerebral peduncle, astrocytterne mærket af GFAP præsenteret med mere rigelige længere processer end dem, der er mærket af NDRG2 og S100 kur (figur 5 og 7).
3.3. Kolokaliseringen af NDRG2, GFAP og S100 i astrocytter i forskellige cerebrale regioner
NDRG2 blev næsten kolokaliseret med GFAP i astrocytter af ventralbarken, corpus callosum og cerebral peduncle og for det meste kolokaliseret med GFAP i astrocytter af hippocampus (figur 5 og 8(a)). NDRG2 havde næsten ingen kolokalisering med GFAP i astrocytter af rygbarken og thalamus (figur 5). NDRG2 og S100 præsenterede næsten fuldstændig kolokalisering i astrocytter i de seks cerebrale regioner(figur 6 og 8 (b)). GFAP og S100 Karrus præsenteret med betydelig kolokalisering i astrocytter af ventral bark, corpus callosumog cerebral peduncle og næsten fuldstændig kolokalisering i astrocytter af hippocampus (Figur 7). GFAP og S100 havde næsten ingen kolokalisering i astrocytter af rygbarken og thalamus (Figur 7).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
vi opdagede også kolokalisering af NDRG2 og en anden astrocytisk producent, glutaminsyntetase (GS), i astrocytter af musene cerebrum. NDRG2 og GS havde signifikant kolokalisering i astrocytter (figur s1a). NDRG2 og GS præsenterede grundig kolokalisering i fibrøse astrocytter af corpus callosum og i protoplasmatiske astrocytter af hippocampus (figur s1b). NDRG2-proteinekspression i den neuronale cellelinie HT22-celler, oligodendroglialcellelinie OLN – 93-celler og astrocytisk cellelinie MA1800-57 celler blev også påvist (figur s2). NDRG2-protein blev påvist i ma1800-57-celler og blev næppe påvist i ht22-celler og OLN-93-celler (figurerne s2a og s2b).
3, 4. Ekspressionen af NDRG2 -, GFAP-og S100-Kurproteiner i forskellige cerebrale regioner
Vi brugte vestlig blotting til at detektere ekspressionsniveauerne af NDRG2 -, GFAP-og S100-Kurproteiner i tre cerebrale regioner hos voksne hanmus (6 måneder): hjernebarken, hippocampus og thalamus (figur 8 (c)). Vi analyserede ekspressionsniveauerne for disse markører i samme cerebrale region (figur 8(d)). I hjernebarken var niveauet af NDRG2-ekspression markant højere end GFAP-og S100-ekspressionsniveauer (p<0,001, p<0,05). Ekspressionsniveauet for S100 Kurt var også meget højere end GFAP (p<0.05). I hippocampus var niveauet af GFAP-ekspression højere end NDRG2 og S100-liter (p<0.01), og niveauet af NDRG2-ekspression var lidt mindre end S100-ekspressionsniveauet, skønt forskellen ikke var statistisk signifikant. I thalamus var ekspressionsniveauet for S100 kur signifikant højere end GFAP-og NDRG2-ekspressionsniveauer (p<0,01), mens niveauet af NDRG2-ekspression svarede til niveauet for GFAP.
dernæst analyserede vi ekspressionsniveauerne for den samme markør i forskellige cerebrale regioner (figur 8(e)). Niveauet af NDRG2-ekspression i hjernebarken var meget højere end i hippocampus og thalamus (p<0,01), og der blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem hippocampus og thalamus. Niveauet af GFAP-ekspression i hippocampus var det højeste blandt de tre regioner (p<0,001, p<0,01); der blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem hjernebarken og thalamus. Niveauet af S100-ekspression i thalamus var signifikant højere end i hjernebarken og hippocampus (p<0.01), uden nogen signifikant forskel observeret mellem de to sidstnævnte.
Vi detekterede også proteinniveauerne af NDRG2, GFAP og S100-kur i hjernebarken, hippocampus og thalamus hos hanmus i alderen 1 måned, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder og 12 måneder (figur 9(a)-9(f)). Proteinniveauerne af NDRG2 og GFAP i hjernebarken, hippocampus og thalamus steg gradvist med alderen (p<0,05, p<0,01). Proteinniveauer af S100-kur i hjernebarken og thalamus, men ikke i hippocampus, steg gradvist med alderen (p<0.05, p <0.01, p<0.001). MRNA-niveauerne af NDRG2, GFAP og S100-kur i hjernebarken, hippocampus og thalamus hos hanmus i alderen 1 måned, 3 måneder, 6 måneder, 9 måneder og 12 måneder var i overensstemmelse med niveauerne for proteinniveauerne (p<0,05, p<0,01, figur 9(g)-9(i)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
4. Diskussion
i denne undersøgelse fandt vi, at astrocytter mærket af NDRG2 og S100 kur blev fordelt mere bredt og ensartet end dem, der blev mærket af GFAP i hele hjernen hos unge, modne og gamle mus. Dette tyder på, at NDGR2 og S100 kur er mere passende markører til at observere den samlede fordeling og antallet af ændringer af astrocytter. Desuden viste vores resultater, at astrocytter i forskellige cerebrale regioner præsenterede forskellige niveauer af immunoreaktivitet for NDRG2, GFAP og S100-kur, hvilket antyder, at NDRG2 og S100-kur i hjernebarken og thalamus er mere passende astrocytiske markører end GFAP. Den ulige immunoreaktivitet af astrocytter over for NDRG2, GFAP og S100 kur kan også skyldes følsomheden og specificiteten af de antistoffer, vi brugte. Derudover lignede morfologierne af astrocytter mærket af NDRG2 og S100-krus hinanden, men var åbenlyst forskellige fra dem, der var mærket af GFAP, fordi disse markører mærkede forskellige cytoskeletale strukturer. NDRG2 pletter cytoplasma og cellemembraner og svagt pletter kernen . GFAP pletter hovedsageligt soma og processer, men ikke kernen, mens S100 liter pletter kernen og en del af cytoplasma og processer . Ved at sammenligne morfologierne for astrocytter mærket af NDRG2, GFAP og S100-kar, fandt vi, at GFAP var en mere passende markør for astrocytter i corpus callosum, cerebral peduncle og især hippocampus. Proteinerne NDRG2 og S100 ‘ er blev udtrykt mest i henholdsvis bark og thalamus. Vi udleder, at NDRG2 er mere egnet til astrocytter i hjernebarken, mens S100 liter er mere egnet til astrocytter i thalamus, når man kvantificerer astrocytisk densitet. De forskellige proteinekspressionsmønstre af NDRG2, GFAP og S100 K. i hjernebarken, hippocampus og thalamus bekræftede astrocytisk funktionel heterogenitet.astrocytter har vist sig at spille en vigtig rolle i vedligeholdelsen af homeostase, og de deltager aktivt i næsten alle neurologiske lidelser, såsom iskæmiske slagtilfælde, traumatiske cerebrale skader, Alsheimer sygdom og Parkinsons sygdom . Det er blevet påvist, at astrocytisk morfologi, genekspression og funktion adskilte sig mellem forskellige regioner i hjernen . Fibrøse astrocytter og protoplasmatiske astrocytter er to store underpopulationer identificeret ved deres morfologi . Fibrøse astrocytter har lange, tynde processer og et stjernelignende udseende, mens de protoplasmiske har adskillige fine processer, som kontakter og kappe synapser . Interessant nok udtrykkes mange gener heterogent af undergrupper af astrocytter. Disse gener koder for proteiner , såsom glutamattransportører og ionkanaler , såvel som glutamat , dopamin og opioidreceptorer .
heterogeniteten af genekspression indebar den funktionelle mangfoldighed af astrocytter. For eksempel adskiller glutamatoptagelse sig mellem forskellige undergrupper . Derudover varierer spontane calciumoscillationer mellem forskellige lag af den somatosensoriske bark. Kortikale lag 1 astrocytter viste hyppig asynkron Ca2 + aktivitet, hvorimod lag 2/3 astrocytter viste sjælden synkron Ca2 + aktivitet . I barken reagerer astrocytter på glutamat og norepinephrin med stigninger i calcium, mens hippocampale astrocytter udviser calciumresponser på ATP, GABA, glutamat, acetylcholin, prostaglandiner og endocannabinoider . Undersøgelser har også vist, at dyrkede astrocytter fra forskellige hjerneområder har forskellige kapaciteter til at stimulere neuritvækst og forgrening . Da astrocytter i forskellige hjerneområder præsenterer forskellige karakteristika ved morfologi og funktion, er det afgørende for astrocytiske forskere at identificere den mest passende markør for astrocytter i forskellige cerebrale regioner.
selvom flere proteiner er blevet rapporteret som selektivt udtrykt af astrocytter, har ingen vist sig at være helt begrænset til alle astrocytiske undertyper. GFAP, den mest anvendte astrocytiske markør, udtrykkes fortrinsvis i hvide stofastrocytter frem for grå stof og mærker ikke alle astrocytters processer . Endnu vigtigere er der delmængder af GFAP-negative astrocytter, der præsenterer spændingsafhængige K+-strømme, mens de GFAP-positive astrocytter præsenterer det klassiske mønster af tids – og spændingsuafhængige strømme .
tidligere undersøgelser fandt ud af, at S100-Karl var i stand til at mærke astrocytter i både gråt og hvidt stof; det blev dog også udtrykt i nogle få oligodendrocytter og neuroner . S100 det viste sig, at det var mest udtrykt i thalamus astrocytter, en undertype af celler, der deltager i rengøringen af Daergisk affald produceret ved degeneration af Daergiske terminaler i Parkinsons sygdom ved at lette tilstedeværelsen af lysosomer og dannelsen af autophagosomer . Den transkriptomiske analyse af astrocytter identificerede aldehyddehydrogenase 1 familie, medlem L1 (ALDH1L1), som en astrocytisk markør . ALDH1L1 mærkede imidlertid også oligodendrocytter . På samme måde havde de stimulerende aminosyretransportører glutamat/aspartattransportør (GLAST), glutaminsyntetase (GS), glutamattransportør-1(GLT-1), vimentin, forbindelsesin 43, akvaporin 4 og celleoverfladen glycoprotein CD44 også begrænsninger ved mærkning af astrocytter .
NDRG2 udtrykkes specifikt i astrocytter af både rotter og mus og er forbundet med vækst og modning af den udviklende embryonale hjerne . Ud over celleproliferation, differentiering og transmembrantransport deltager NDRG2 også i stressresponser, depression, iskæmiske sygdomme og neurodegenerative lidelser . Hos mus og mennesker deltager NDRG2 i udviklingen af opmærksomhedsunderskud/hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD), en sygdom forbundet med bevægelsescentret i hjernebarken . Flugge et al. opdaget ekspressionen af NDRG2 i hjernen hos mennesker, marmoseter, træskruer, rotter og mus, og foreslog NDRG2 var en ny astrocytisk markør, især for Modne, ikke-reaktive og ikke-prolifererende astrocytter . I denne undersøgelse opdagede vi først fordelingsmønsteret for NDRG2-positive astrocytter i forskellige cerebrale regioner og forskelle med astrocytterne mærket med klassiske markører GFAP og S100 kur.
astrocytter og astrocytiske markører ændrede sig under normal hjerne aldring. Tidligere arbejde har vist, at astrocytter aktiveres tidligt i aldring, og den signifikante stigning i GFAP-positive astrocytter blev fundet i hippocampusregionerne hos ældre mus . Niveauer af både GFAP-protein og GFAP-mRNA steg i forskellige dele af aldrende hjerner, såsom hjernebarken, hippocampus og lillehjernen . Der er stadig uoverensstemmelser blandt forskellige rapporter om S100 Kurr i den aldrende hjerne . I stigende grad har undersøgelser vist, at NDRG2 er forbundet med aldersrelaterede lidelser som f.eks. I vores undersøgelse steg niveauerne af GFAP og NDRG2 mRNA i hjernebarken, hippocampus og thalamus gradvist med alderen, mens niveauerne af S100-mRNA i hippocampus og thalamus steg med alderen, men ikke i hjernebarken.
Vi skal bemærke, at i øjeblikket mange markører ud over dem, vi testede, såsom ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44 og vimentin, bruges til at mærke astrocytter. I vores undersøgelse sammenlignede vi kun de klassiske cerebrale astrocytter mærket af den nye foreslåede markør NDRG2 og de mest almindeligt anvendte markører: GFAP, S100 Kursog GS i hjernen.
Som konklusion viser vores undersøgelse, at NDRG2 og S100 Chr er mere passende markører for astrocytter i henholdsvis hjernebarken og thalamus såvel som for at observere den samlede fordeling og ændringer i antallet af astrocytter i hele hjernen. I mellemtiden er GFAP overlegen i forhold til NDRG2 og S100 Kris, når man mærker processer og grene af astrocytter i corpus callosum, cerebral peduncle og især hippocampus. Vores undersøgelse viser vigtigheden af at vælge den mest passende markør for astrocytter i forskellige musens cerebrale regioner, som giver vejledning til neurovidenskabsforskere, når de udforsker astrocytiske funktioner.
datatilgængelighed
de data, der bruges til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er inkluderet i artiklen.
Disclosure
er de første forfattere.
interessekonflikter
forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
forfatteres Bidrag
Jang og Ji ma bidrog ligeligt til denne undersøgelse.
anerkendelser
dette arbejde blev støttet af Beijing Natural Science Foundation (no. 7194321 til Kina), den nationale naturvidenskabelige Foundation i Kina (no. 81801138 til Yulong Ma, no. 81771206 til Yangyuan), den unge lærde forskningsstipendium fra kinesisk Anæstesiologforening (no. 21700001 til Yulong Ma), Miaopu Foundation of China (No.21700001 til Yulong Ma), Miaopu Foundation of kinesisk PLA General Hospital (nr. 18kmm47 til Beijing kommunale videnskab & teknologi Kommission (nr. 1811000017180022 til at hænge Guo).
supplerende materialer
supplerende Figur 1. Kolokalisering af NDRG2 og GS inden for astrocytter. Supplerende Figur 2. Ekspressionen af NDRG2-protein i cellelinjer. (Supplerende Materialer)