Hvis du havde tilstrækkelig tid og et vibrationsfrit miljø, kunne du tålmodigt vente, og tyngdekraften ville bringe de fleste suspenderede partikler til bunden af et centrifugerør. De mindste partikler ville sandsynligvis forblive i suspension på grund af brunisk bevægelse, og de fleste makromolekyler ville være ensartet fordelt, fordi de ville være i opløsning snarere end suspension. Jeg ved ikke om dig, men jeg har ikke den slags tålmodighed, der er nødvendig for kun at stole på tyngdekraften til adskillelse af fast stof fra flydende komponenter. Desuden ville den pellet, du opnåede, til praktiske formål være alt for let forstyrret til effektiv adskillelse af fast materiale fra supernatant. Gravity ville ikke være en frygtelig effektiv måde at adskille suspenderede materialer baseret på størrelse eller andre egenskaber.
beskrivelse af centrifugeringsbetingelser
når der skrives en centrifugeringskørsel i materialer og metoder, er det sjældent nødvendigt at rapportere mere end centrifugeringens kraft, tid og temperatur. Den krævede hastighed (rpm) afhænger af den anvendte centrifuge og rotor, som varierer fra et laboratorium til det næste. Det er således sjældent relevant at rapportere fabrikatet af centrifuge,rotortype eller hastighed.
centrifugeringsprocessen
centrifugering producerer en centripetal kraft, der kan være mange hundrede eller tusindvis af gange tyngdekraften, hvilket fremskynder processen betydeligt. Minut (RPM), desto større er tyngdekraften. Nytten af centrifugering i cellefraktionering ville være begrænset, hvis alt, hvad vi kunne gøre, er at drive suspenderede partikler til bunden af et rør. Imidlertid er efterforskere i stand til at kontrollere størrelsen på partikler, der bringes ned, takket være partikelens fysik i suspension.
i en suspension af runde partikler med samme densitet, men forskellige diametre, er kraften, der driver en given partikel til bunden, lig med dens masse gange den påførte acceleration. Partiklens volumen er en funktion af dens radius, og dens masse er lig med dens volumen gange dens densitetskoefficient, som er en konstant. Volumenet af en kugle er lig med 4/3 gange pi (en konstant) gange kuben af radius. For en suspension af sfæriske partikler med lige densiteter under et specifikt sæt betingelser er den eneste variabel, der bestemmer kraften på en given partikel, dens radius.
modstanden mod bevægelse gennem en opløsning er proportional med den del af overfladearealet, der skubber gennem mediet. For partikler med lignende form støder mindre partikler på mindre modstand end større. Da overfladearealet af en kugle er 4 gange pi gange kvadratet af radiusen, og 4 gange pi er en konstant, så for sfæriske partikler med lige sammensætning er den eneste variabel, der bestemmer modstand under et givet sæt betingelser, partikelens radius.
drivkraften stiger proportionalt med KUBEN af radius. Modstand mod bevægelse øges proportionalt med radiusens firkant. Det er ikke svært at se, at når en partikels radius stiger, øges dens tendens til at nærme sig bunden også. Tilføj en betydelig mængde ‘træk’, og tyngdekraftseksperimentet, der er tilskrevet Galileo, fungerer trods alt ikke så godt. Da store partikler sediment hurtigere end små partikler, kan en efterforsker adskille store fra små organeller, celler osv. simpelthen ved at kontrollere tiden og omdrejningstallet for en centrifugekørsel.
fraktionering ved differentiel centrifugering
for et typisk cellehomogenat, en 10 min. spin ved lav hastighed (400-500 g) giver en pellet bestående af ubrudt væv, hele celler, cellekerner og stort affald. Den lave hastighed pellet kaldes traditionelt den nukleare pellet. En 10 min. spin med en moderat hurtig hastighed, hvilket giver kræfter på 10.000 til 20.000 g bringer mitokondrier ned sammen med lysosomer og peroksisomer. Derfor kaldes den anden pellet i det traditionelle cellefraktioneringsskema mitokondrielle pellet.
yderligere cellefraktionering ved differentiel centrifugering kræver anvendelse af en ultracentrifuge. Et sådant instrument er designet til at dreje rotorer ved høje vinkelhastigheder for at generere meget høje G-kræfter. Luften skal pumpes ud af kammeret for at undgå varmeopbygning på grund af luftfriktion. Faktisk er mange rotorer, der er designet til en ultracentrifuge, ikke engang bygget aerodynamisk, da de spindes i et vakuum. En times højhastigheds ultracentrifugekørsel, der genererer en kraft i størrelsesordenen 80.000 g, giver en mikrosomal pellet. Mikrosomer omfatter fragmenter af membran, herunder cellemembran og endoplasmatisk retikulum. Membranfragmenter danner vesikler, når de forstyrres i et vandigt medium, så undersøgelse ville afsløre adskillige membranvesikler i forskellige størrelser. Vesiklerne selv kan adskilles på basis af densitet på grund af varierende proteinindhold. Men det er et emne for et andet dokument.
Spin i flere timer ved 150.000 g eller deromkring, og du kan nedbringe ribosomer og endda den største af makromolekyler. Supernatanten, der er tilbage, består af opløselige komponenter i cytoplasmaet, herunder salte, små makromolekyler og precursormolekyler og opløste gasser.