Dobbelt blokade af CD47 og HER2 eliminerer radioresistente brystkræftceller

cellelinjer

Human brystkræft MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549, SKBR3 cellelinjer, glioblastom U251 og tyktarmskræft hct116 cellelinjer blev købt fra ATCC. MCF-7 -, MDA-MB-231 -, BT474 -, BT549-og U251-celler blev opretholdt i DMEM-medium suppleret med 10% FBS, og SKBR3-celler opretholdt i RPMI-1640-medium med 10% FBS. Hct116-celler blev opretholdt i McCoy ‘ s 5a-Medium med 10% FBS. De radioresistente MCF7/C6-og MDA-MB-231/C5-cellelinjer, der blev klonet fra overlevende fraktioner af MCF7-og MDA−MB-231-celler efter gentagen bestråling; de HER2-overudtrykkende brystkræftstamceller (HER2+/CD44+/CD24 – /lave BCSC ‘ er) blev isoleret fra MCF7 / C626. Mus triple-negativ brystkræft 4T1 celler blev opretholdt i DMEM medium med 10% FBS. Human monocyt THP-1 blev dyrket i ATCC-formuleret RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS, 15 mM HEPES, 4,5 g/l glucose og 2-mercaptoethanol til en endelig koncentration på 0,05 mM. mus m ren rå 264.7 celler blev dyrket i DMEM-medium med 10% FBS efter ATCC-kulturmetoden. Alle cellelinjer blev testet negativ mycoplasma kontaminering med MycoSensor PCR Assay kit (Agilent Technologies, katalog # 302108).

plasmider og reagenser

CD47 promotorstyret luciferasevektor blev konstrueret ved kloning af den humane CD47 promotorregion (-1554 nt) til pGL2-basisk plasmid fra kpni / Hind III-steder. Sletningen af de formodede NF-kB-bindingssteder (TGGAAGCT-764-757) blev udført under anvendelse af et hurtigt mutationssæt (Stratagene, La Jolla, CA). De anvendte primersekvenser: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Lapatinib (katalog # S1028) blev købt fra Selleckchem. Anti-CD47 (B6H12) antistof til IHC, ICC og vestlige blot blev købt fra Santa Cruce (katalog # sc-12730). Anti-CD47-FITC til strømningscytometri blev købt fra BD Biosciences (katalog # 556045). Anti-humant CD47 (B6H12) antistof til fagocytoseanalyse blev ekstraheret fra b6h12.2-hybridom (ATCC-liter HB-9771 liter). Anti-mus CD47 antistof til in vivo tumorinhibering blev ekstraheret fra MIAP301 hybridoma leveret af Dr. Anti-CD11b antistof til IHC-farvning blev købt fra Invitrogen (katalog # MA5-17857). Musemonoklonalt anti-LARP-tubulin-antistof til vestlig blot blev købt fra Sigma-Aldrich (katalog # T6074). Musemonoklonalt anti-Kris-actin-antistof til vestlig blot blev købt fra Sigma-Aldrich (katalog # A5441). Anti-HER2/erbb2 (katalog # 29d8) antistof til IHC-farvning og vestlig blot blev købt fra Cellesignaleringsteknologi (katalog # 2165). Anti-HER2-APC antistof til strømningscytometrianalyse blev købt fra BD Biosciences (katalog # 340554).

Immunoblotting

proteiner fra celler eller tumorvæv blev ekstraheret i RIPA lysis buffer (Pierce) suppleret med protease og phosphatasehæmmercocktail (cellesignalering). Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af BCA-analysen (Pierce). Lysater blev derefter denatureret, og prøver indeholdende 30 larg-proteiner blev underkastet elektroforese i 10% SDS-poly-acrylamidgel efterfulgt af overførsel til polyvinylidendifluoridmembraner (Bio-Rad). Efter blokering med 5% fedtfri tør mælk blev membranen eksponeret for det primære antistof og inkuberet ved 4 liter C natten over. Blots blev visualiseret ved mærkning med HRP-koblede sekundære antistoffer (Sigma-Aldrich) og inkubation med Amersham ECL vestlige blotting detektion reagens (katalog # RPN2106). Blots blev udviklet på en Konica SRK 101A udvikler og kvantificeret med ImageJ.

strømningscytometrianalyse

opsamlede celler blev skyllet med PBS indeholdende 0,5% BSA i PBS, og cellepellets blev inkuberet med fluorescensmærkede primære antistoffer ved 37 liter C i 30 minutter efterfulgt af vask tre gange med 0,5% BSA / PBS. Alle antistoffer blev titreret for at optimere tilstanden, før de blev anvendt til eksperimentet. Analyse af strømningscytometri blev udført ved hjælp af FACS Canto II cytometer (BD), og efterfølgende analyse blev udført ved hjælp af programmet Tree Star, Ashland eller USA. Gating-strategierne var baseret på FSC-og SSC-egenskaber og blev oprettet for positive cellepopulationer i FITC, APC-kanaler.

humane brystkræftvæv

friske frosne HER2 positive og negative brystkræftvæv blev leveret af UC Davis Comprehensive Cancer Center Biorepository (IRB # 283665 og IRB # 218204) finansieret af UC Davis Comprehensive Cancer Center Support Grant (CCSG) tildelt af National Cancer Institute (NCI P30CA093373) med al patientinformation blokeret undtagen de diagnostiske resultater. Yderligere humane brystkræftpatologiske prøver inklusive de ikke-farvede 4-liters tykke sektioner af formalin-fast paraffinindlejret (FFPE) parret primær brystkræft og tilbagevendende brystkræft blev opnået fra Department of pathology, Ohio State University med research IRB-godkendelse (#2002h0089).

Immunohistokemi (IHC)

Immunohistokemisk farvning blev udført på 4-lutm-tykke FFPE vævssektioner. Kort fortalt blev objektglassene deparaffiniseret og rehydreret, og antigener blev hentet i 40 minutter i en citratbuffer (pH 6,1) ved 95 liter C. Endogen peroksidaseaktivitet blev blokeret med 3% H2O2-opløsning. Den primære antistofinkubation blev udført ved 4 liter C natten over efterfulgt af VECTASTAIN ABC-kittet (Vektorlaboratorier) ved RT i 30 minutter i henhold til producentens anvisninger. Reaktionsprodukterne blev påvist ved anvendelse af Peroksidasesubstrat Kit og modfarvet med hæmatoksylin (Vektorlaboratorier). To senior patologer var ansvarlige for diagnosen af brystkræft i klinikken og evalueringen af eksperimentelle tumorer. CD47-ekspressionen blev evalueret ved hjælp af både farvningsintensitet og procentdel af farvede celler. Farvningsintensiteten blev klassificeret som 0: negativ; 1: svag; 2: moderat; 3: stærk. Høj ekspression blev defineret som stærk farvningsintensitet i mere end 25% af tumorcellerne; medium ekspression var moderat farvningsintensitet i mere end 25% af tumorcellerne; lav ekspression var svag farvningsintensitet i mere end 25% af tumorceller eller moderat farvning i <25% af tumorceller ved hjælp af ASCO-CAP guidelines63 blev brugt til fortolkning af HER2-immunhistokemi (IHC), og HER2-proteinekspression blev scoret som negativ IHC 0 (ingen farvning eller membranfarvning, der er ufuldstændig og er svag/næppe synlig og inden for 10% af de invasive tumorceller) eller negativ IHC 1+ (ufuldstændig membranfarvning, der er svag/næppe synlig og inden for >10% af de invasive tumorceller); tvetydig IHC 2+ (periferisk membranfarvning, der er ufuldstændig og/eller svag/moderat og inden for >10% af de invasive tumorceller; og eller fuldstændig og periferisk membranfarvning, der er intens og inden for 10% af de invasive tumorceller); positiv IHC 3+ (periferisk membranfarvning, der er komplet, intens i mere end 10% af de invasive tumorceller). Hvis resultaterne var tvetydige (2+), blev reflekstest udført under anvendelse af in situ hybridisering (ISH). Ved påvisning af CD47-ekspression af in vivo bestrålede tumorer blev behandlede musetumorer fjernet og fikseret i 4% paraformaldehyd i PBS i 24 timer. prøverne blev dehydreret med serie ethanol (70%, 95% og 100%) i 48 timer, før de blev indlejret i paraffinopløsningen (Polysciences).

Immunocytokemi (ICC)

celler blev podet på runde dækglas og dyrket til 60-80% sammenløb efterfulgt af skylning med PBS, fiksering i 4% paraformaldehyd (pH 7,2) og permeabilisering med 0,1% Triton H-100 i PBS. Cellerne blev derefter inkuberet i en blokerende opløsning i 15 minutter før inkubation med det primære antistof natten over ved 4 liter C med 1:250 fortyndinger. Celler blev inkuberet med TR-eller FITC-konjugerede sekundære antistoffer fortyndet 1:1000 i blokeringsopløsningen i 1 time ved stuetemperatur i mørke og analyseret med konfokal mikroskopi.

identifikation af strålingsassocierede antigeniske proteiner

C57/B6 mus blev anvendt som en immuniseringsvært med 5 liter 106 MCF7/C6 celler i 0.1 ml volumen injiceret i bunden af halen eller fodpuden pr.mus efterfulgt af boosting med det samme volumen af celler på 14. dag. På 5. -7. dag efter den anden udfordring blev musene aflivet, og serumet blev opsamlet for at detektere antigene molekyler udtrykt i radioresistente BC-celler. For at skelne RAAPs fra ikke-specifikke molekyler udtrykt i normale brystepitelceller og vildtype MCF7-celler blev der udført en forrensningsprocedure med det rå serum ved hjælp af følgende trin. To millioner humane normale BRYSTEPITELIALE MCF10A-celler blev fremstillet i en opløsning indeholdende 1 mm EDTA/PBS uden trypsin for at undgå fordøjelse af nogle af de følsomme proteiner efterfulgt af skylning med PBS to gange. Cellerne blev pelleteret og derefter løsnet ved at banke på bunden af røret efterfulgt af tilsætning af 1 ml Muse anti-sera og rotere ved 4 liter C i 2 timer. blandingen blev derefter centrifugeret ved 9391 liter g i 5 minutter ved 4 liter C, og supernatanterne blev opsamlet, som blev gentaget en gang. Det første rensede antiserum blev yderligere renset ved inkubation med vildtype MCF7-celler under anvendelse af de samme procedurer og gentaget seks gange. Det endelige oprensede antiserum blev derefter testet af vestlig blot mod proteinlysat fra MCF10A-celler, MCF7− celler, MCF7/C6 og RD-BCSC-celler, der blev sorteret efter brystkræftstamcellemarkører HER2+/CD44+/ CD24-såvel som aldehyddehydrogenase (ALDH)64. CD47 og HER2 sammen med andre RAAPs i de radioresistente BC-celler blev identificeret ved vestlige blots eller ved immunudfældning af membranproteiner oprenset fra RD-BCSC-celler, og de eluerede fraktioner blev analyseret via LC/MS. De resulterende membranraaps blev grupperet med et antal proteiner og proteinfunktionelle kategorier.

CRISPR redigering af HER2 og CD47

sgrna ‘ erne blev designet efter instruktionen udgivet af Dr. Jang Labs CRISPR-designprogram (http://crispr.mit.edu) og den etablerede protokol, der er beskrevet i den foregående publikation65. Fire Oligoer blev designet svarende til de humane sgrna ‘ er blev syntetiseret og klonet i lentiCRISPR v2-vektor efter den Gekko-poolede biblioteksforstærkningsprotokol. For at minimere muligheden for ikke-specifik målretning blev tre sgRNA-oligoer af hvert målretningsgen syntetiseret og testet. SgRNA med den bedste knockout-effektivitet bestemt af vestlig blotting blev valgt til efterfølgende eksperimenter. SgRNA-sekvenserne blev anvendt til humane celler og museceller som følger:

hHer2gRNA_F: CACCGCGGCACAGACAGTGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. Efter inkubering i 12 timer blev 1 ml virusholdig supernatant med 8 ng polybren tilsat til cellerne efterfulgt af inkubation i 6 timer. derefter blev 0,5 ml yderligere regelmæssigt medium indeholdende 10% varmeinaktiveret FBS tilsat og yderligere dyrket til natten over. Infektionsmediet blev erstattet med 2 ml frisk medium med 10% FBS og dyrket i 72 timer. celler blev passeret til 60 mm vævskulturskåle og valgt ved dyrkning i 0,3 liter/ml Puromysin i 1 uge, og knockout af det målrettede gen blev verificeret ved immunoblotting.

Luciferase-assay

celler blev transficeret med pgl2-basic-CD47 eller pGL2-basic-CD47-LARSNF-kB eller pGL2-NF-kB luciferase-reportere, og luciferaseaktivitet blev målt ved Luminometer (Promega, Madison, vi). Til normalisering af reportertransfektionseffektiviteten blev den totale proteinkoncentration af lysater målt med BCA-Proteinassay kit (Pierce, Rockford, IL) med BSA som standard.

Chromatin immunopræcipitation (ChIP) assay

celler blev tværbundet med formaldehyd (1% endelig) i 10 minutter, vasket med iskold PBS og opsamlet i SDS lysis buffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8. 1). Kromatin blev skåret ved sonikering, præ-ryddet med protein G konjugerede agaroseperler og inkuberet med anti-p65, anti-c-Rel eller normal IgG ved 4 C natten over. Efter at protein G blev tilsat i 2 timer ved 4 liter C, blev komplekset vasket på en sekventiel måde med lav og høj salt immunkompleks vaskebuffere (0. 1% SDS, 1% Triton 100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 plus 150 mM NaCl for lavt saltindhold og 500 mM NaCl for højt saltindhold buffere) efterfulgt af TE buffer (to gange). DNA-transkriptionsfaktorinteraktionen blev reverseret efter tilsætningen af NaCl og inkubation ved 65 liter C natten over. Efter fordøjelsen af RNase A og Proteinase K blev DNA-fragmenter oprenset ved phenol/chloroformekstraktion og ethanoludfældning. DNA ‘ er blev oprenset og anvendt til PCR med primere, der er specifikke for genpromotorregionen, der omfatter NF-kB-bindingssteder. CD47 primere var:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. Monoklonalt rotte anti-mus CD47 IgG2a antistof (MIAP301) og hybridom blev opnået fra Dr. Begge hybridomacellelinjer blev opretholdt i IMDM-medium med 20% FBS. Antistoffer blev oprenset fra hybridoma supernatant under anvendelse af protein G-harpiks fra GenScript (katalog # L00209) efter fremstillings standardprocedurer. Prøver blev derefter yderligere koncentreret 10-20 gange ved hjælp af Microsep-centrifugalanordninger fra Pall Life Sciences. Koncentrationer af oprenset IgG blev bestemt ved måling af absorbansen ved OD280.

Fagocytoseanalyse

både humane monocyt THP1-celler og mus m-rå 264,7-celler (ATCC, TIB-71) blev opretholdt i en 5% CO2-inkubator ved 37-liter C66 ved en omtrentlig densitet på 1-liter 106 / ml. Omkring 0,8 liter 106 celler / ml rå 264,5 celler eller 1 liter 106 THP1 celler blev podet på en 6-brønds plade. Efter 24 timers inkubation blev rå 264,7 celler aktiveret ved behandling med 0,1 liter/ml lipopolysaccharid (LPS) i 24 timer. monocyt THP1-celler differentierede med Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) (40 nM) i 48 timer. Aktiverede makrofager blev farvet med Dio ved endelig samordning 40 nM i et medium i 20 minutter efterfulgt af skylning tre gange med medium. Kræftceller blev mærket med 1 liter ddao (5 mM stamopløsning i DMSO opbevaret ved -20 liter C) i PBS ved 37 liter C i 15 minutter og vasket med PBS indeholdende 1% FBS. Ddao-mærkede målceller (1 liter 106) blev tilsat til DIO-farvede m-Koler og inkuberet i et slutvolumen på 2 ml ved 37 liter C i 2 timer. efter inkubationen blev M-Koler og målceller høstet med tre gange EDTA-PBS-vask efterfulgt af 0,25% trypsinisering. Fagocytose blev vurderet ved at evaluere de dobbeltmærkede celler (DIO+/DDAO+), som repræsenterer fagocytiserede brystkræftceller af modne m-kryss via strømningscytometri. Programmet blev brugt til analyse.

Klonogen overlevelsesassay

Klonogen overlevelsesassay blev udført efter stråling med eller uden behandling (Lapatinib, 10 liter i 72 timer; anti-CD47 antistof 10 liter / ml natten over). De behandlede celler blev dyrket i 10-14 dage, og kolonier blev fikseret, farvet med Coomassie blå plet. Kolonier indeholdende mere end 50 celler blev talt som overlevende kloner og normaliseret til pletteringseffektiviteten af hver sham-behandlet tumorcellelinie.

Gap-filling rate assay

Gap-filling kapacitet blev målt med 1 til 106 celler dyrket i hver af 6-brøndsplader til 100% sammenløb efterfulgt af 24 h celle sult. Derefter blev hullet skabt ved at skrabe skålen diagonalt med en steril pipettespids. Cellerne blev enten efterladt ubehandlede eller behandlet med 10 liter/ml IgG eller anti-CD47 antistof i løbet af eksperimentets varighed. Påfyldningskapaciteten blev overvåget i 72 timer, og repræsentative billeder blev taget på dag 0 (skrabningsdag) og dag 3.

Tumorsfæredannelse

celler blev sigtet med 40 cellesilere (katalog # 352340. Corning) og enkeltcellesuspensioner blev podet i 60 mm petriskåle med lav fastgørelse med en densitet på 1000 celler/ml. Cellerne blev dyrket i serumfrit brystepitelbasalmedium (MEBM) suppleret med B27 (katalog # 17504-044. Life Technology), 20 ng/ml EGF (katalog # 4022-500. Bio-vision), 20 ng/ml basic-FGF (katalog # 13256-029. 4 liter / ml heparin ( katalog # 80603-686 EMD MILLIPORE). Celler blev dyrket i 10 dage, og tumorsfærer blev talt under lysmikroskopi.

transvulum invasion assay

Alikvoter (0. 4 ml) Matrigel (katalog # 356231. BD Biosciences) blev fortyndet i coatingbuffer: 0,01 m Tris (pH 8,0), 0,7% NaCl til den endelige koncentration på 200-300 liter/ml. Omkring 100 krøll blev indlæst i det øverste kammer i 24-brønds transvulum (katalog # 3422. Costar) og inkuberet ved 37 liter C til gelering omkring 1 time. Fjern forsigtigt den resterende coatingbuffer fra den permeable støttemembran uden at forstyrre laget, og tilsæt derefter celler (2,5 liter 104/ml). Det nedre kammer blev fyldt med 800 liter mem-medier indeholdende 5 liter / ml fibronectin (katalog # SC-29011. ). Translationen med forskelligt behandlede celler blev inkuberet i 48 timer og farvet med Diff-hurtig plet kit (katalog # K7128. IMEB INC).

fremstilling af F (ab’)2 fragmenter

CD47 F (ab’)2 fragmenter blev produceret ved papainharpiksspaltning af IgG under anvendelse af et F (ab’)2 præparationssæt (katalog # 786272. G-Bioscience) i henhold til producentens anbefalinger og rapporterede procedure67. Efter papainfordøjelse blev Fab-fragmentet adskilt fra ufordøjet IgG og Fc-regionen med proteinet A Spin-søjle fra Fab-Fragmenteringssæt SpinOUT GT-600 afsaltningskolonner blev leveret for at sikre, at den indledende antistofprøve var den optimale betingelse for Fab-fragmentering, og den oprensede anti-mus CD47 IgG blev opsamlet til in vivo musetumorbehandling.

stråling af BC-celler med CRISPR-KO CD47 og/eller HER2

til in vivo− test af tumorinhiberingseffektivitet ved stråling med mangelfuld CD47 og HER2− status blev 5 ren 105 4T1/C2− celler med CRISPR− knockout af CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) eller dobbelt (CD47 – / – /HER2 -/ -) implanteret i BRYSTFEDTPUDERNE i BALB/c (n = 6 pr gruppe). Tumorvækst blev vurderet ved at måle tumorvolumen hver 2.dag fra dag 7, indtil tumorvolumenet nåede begrænsningen. For at vurdere radiosensitiviteten af tumorer med forskellig status for CD47 og HER2 blev lokal tumorstråling leveret med 5 Gy til hver tumor på dag 9, og tumorvækst blev målt hver anden dag, indtil kontroltumorer nåede den maksimale begrænsning.

RT af mus BC med anti-CD47 og/eller HER2-behandling

til in vivo-test af tumorinhibering med et enkelt CD47-antistof i nærvær eller fravær af strålebehandling fulgte anti-CD47-behandling protokollen af Vilingham et al20 med nogle ændringer. Otte uger gamle immunkompetente (BALB / c) hunmus (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) blev injiceret med 1 liter 105 musebryst 4T1 celler i 4.brystkirtler. Halvtreds mikroliter PBS indeholdende 100 liter kontrol IgG eller anti-CD47 F (ab’) fragmenter blev injiceret i tumorstedet (dag 1) eller i tumorvævene (dag 15) og gentaget hver anden dag indtil slutningen af forsøgene. Tumorvolumener blev overvåget hver 5.dag. Til strålebehandling, anti-CD47 eller stråling kombineret med anti-CD47 blev dyrene med 4T1 tumorer tilfældigt opdelt i forskellige behandlingsgrupper og en kontrolgruppe (5-10 mus pr. Tumor lokal stråling startede, når tumorvolumen når 200 mm3 med FIR (5 Gy/dag/tumor i fire fraktioner ved anvendelse af mikrostråle IR-kilde; total dosis = 20 Gy) kombineret med tre gange tumorinjektioner af anti-CD47 F (ab’). Radiosensitiviteten af de in vivo bestrålede tumorer med tilstedeværelse eller fravær af anti-CD47 F (ab’) blev evalueret ved måling af tumorvolumen ved afslutningen af forsøgene. Dyrene blev aflivet, når tumorerne var ~1400 mm3, eller når dyrene syntes at være ubehagelige, selv når tumoren var mindre end 1400 mm3 for at overholde UCD iacuc-reglerne for brug af hvirveldyr i forskning. Protokollen til dyrebrug og pleje af in vivo strålebehandling blev godkendt af det institutionelle Udvalg for Dyrebrug og pleje ved University of California Davis (iacuc 15315).

til in vivo-test af tumorinhibering med dobbelt antistoffer mod CD47 og HER2 i nærvær eller fravær af strålebehandling blev otte uger gamle immunkompetente (BALB/c) hunmus (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) injiceret med 1 luth 105 musebryst 4T1-celler i 4.brystkirtler. 200 mm3 blev mus tilfældigt opdelt i fire grupper (6 mus pr.gruppe). PBS, IgG, anti-CD47 F (ab’) fragmenter (100 kg) eller Herceptin (5 mg/kg) blev injiceret i tumorvæv 4 timer før lokal strålebehandling (5 Gy pr.dag i 2 dage). Injektioner blev udført, og tumorstørrelser blev overvåget hver anden dag indtil slutningen af forsøgene. Mus blev aflivet, når tumorerne var ~1400 mm3, eller når dyrene syntes at være ubehagelige, selv når tumoren var mindre end 1400 mm3 for at overholde UCD iacuc-reglerne for brug af hvirveldyr i forskning. Protokollen til dyrebrug og pleje af in vivo strålebehandling blev godkendt af det institutionelle Udvalg for Dyrebrug og pleje ved University of California Davis (iacuc 15315).

Tumorinfiltrerede makrofager og makrofagfagocytose

GFP-Ekspres musebrystcancer 4T1-celler blev implanteret i 4.brystfedtpuder af BALB / c-mus, og behandlingen blev startet, når tumorer opnåede omkring 200 mm3 ved tumorinjektion af 50 liter PBS indeholdende 100 liter kontrol IgG, anti-CD47 F (ab’) fragmenter, Herceptin eller begge antistoffer hver anden dag i tre gange. Tumor lokal RT blev leveret på dag 10 og 11 med 5 Gy/dag/tumor for to fraktioner, total dosis = 10 Gy, og eksperimenter blev afsluttet 2 dage efter afslutningen af antistofbehandlinger. Tumorer blev ekstraheret, og FFPE-sektioner blev forberedt til immunofluorescensfarvning for at følge standardproceduren: objektglassene blev deparaffiniseret og rehydreret, og antigener blev hentet i 40 minutter i en citratbuffer (pH 6,1) ved 95 liter C. For at fjerne autofluorescens blev dias sokket i de-autofluorescensopløsning (0,5 M CuSO4, 0,05 M NH4COOH i H2O) ved RT i 48 timer, skyllet med vand 5 min 3gange og derefter blokeret med 1:100 hesteserum. Den primære antistofinkubation blev udført ved 4 liter C natten over: anti-GFP (1:100; Dako), anti-CD11b (1:100; Millipore); Efter vask blev dias inkuberet med 1: 250 fortyndede fluorescerende konjugerede sekundære antistoffer (Rhodamin til CD11b, Aleksa Fluor 488 til GFP) ved RT i 1 time og derefter monteret med vectashield Antifade-opløsning indeholdende DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Makrofagmedieret fagocytose blev påvist med fluorescerende mikroskopi ved hjælp af Aksiovisionsprogrammer (Seiss, Tyskland), og mikrofotografier blev kvantificeret af ImageJ.

statistisk analyse

alle de eksperimentelle data opnået fra in vitro cellulære undersøgelser og dyreforsøg præsenteres som middelkurs se, analyseret ved hjælp af to-tailed Student t-test for to grupper eller ANOVA for flere grupper. Den statistiske signifikans af Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev vurderet med en Mann–Hvidney-test. Antallet af uafhængige eksperimenter og replikaterne blev angivet i figurens legender. P-værdier < 0.05 blev anset for at være signifikante og er angivet med stjerner som følger: *P < 0.05, * * P <0.01, ***P <0.001, ****P < 0.0001.

Rapporteringsoversigt

yderligere oplysninger om forskningsdesign findes i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.