encephalitis cuniculi stamme III er en årsag til encephalitis hos både mennesker og hunde

abstrakt

Mikrosporidier er obligatoriske intracellulære eukaryote organismer, der findes i en bred vifte af hvirveldyr og hvirvelløse værter. Encephalitis cuniculi findes almindeligvis hos tamkaniner og gnavere og forekommer også hos hunde, andre hunde og primater, herunder mennesker. DNA-sekventering af de ribosomale RNA-gener er blevet brugt til at identificere disse parasitter til et artsniveau og til at definere E. cuniculi stammer i, II og III. otte nye hundeisolater blev karakteriseret som E. cuniculi stamme III ved anvendelse af molekylære metoder. Denne stamme er også blevet identificeret i isolater fra immunkompromitterede mennesker, hvilket antyder det dyrepotentiale af denne parasitart. Langvarig mikrosporidial sporeudskillelse fra asymptomatiske hunde rapporteres også.cuniculi er en obligatorisk intracellulær protosoan af phylum Microspora og er en almindelig parasit af tamkaniner og gnavere. Lejlighedsvis er disse parasitter blevet rapporteret hos andre værter, herunder hunde, blå ræve (Alopeks lagopus) og et lille antal andre vilde kødædende dyr . Stigende antal rapporter beskriver også klinisk sygdom hos mennesker forårsaget af E. cuniculi, men kilden(E) til human infektion er ukendt .

historisk set var parasitidentitet baseret på morfologiske og undertiden ultrastrukturelle egenskaber. For nylig er morfologisk lignende medlemmer af encephalitis-slægten blevet specificeret ved anvendelse af immunologiske træk og molekylær karakterisering af de ribosomale RNA-gener . Isolater af E. cuniculi er blevet yderligere opdelt som stammer i, II eller III, baseret på antallet af gentagelser af en 4-basesekvens (5′-GTTT-3′) i det indre transkriberede afstandsstykke (ITS) region af det ribosomale RNA-gen . To hund E. cuniculi isolater blev betegnet stamme III på basis af tilstedeværelsen af 4 sekvensrepeatinger . Efterfølgende er der identificeret 4 humane isolater som stamme III (isolaterne “Donovan” GenBank 98466, CDC: V282 og IPS: H5) og som stamme i i to rapporter fra Europa . Denne undersøgelse udvider dette arbejde ved at identificere 8 yderligere hundeisolater af E. cuniculi fra 4 udbrud som stamme III. selvom ingen epidemiologiske data direkte har bekræftet overførsel fra hund til menneske, molekylære data antyder, at hunde kan tjene som potentielle reservoirer for parasitter. Derudover er langvarig udskillelse af sporer fra asymptomatiske hunde dokumenteret, hvilket yderligere styrker sandsynligheden for, at parasitten overføres.

materialer og metoder

Parasitisolater

ligene af 7 hvalpe fra 3 ikke-relaterede kuld og 1 hund blev over 18 måneder sendt til det veterinære diagnostiske laboratorium for postmortem evaluering. Dyrene var fra fire uafhængige kilder fra forskellige regioner i USA. Diagnosen encephalitis blev i hvert tilfælde foretaget på grundlag af histologiske fund. Otte parasitisolater blev etableret fra friske væv fra dyrene: 5 isolater blev afledt af hjerne – eller nyrevæv fra 5 til 7 uger gamle Boston terrier-hvalpekuldkammerater (2 hanner, 3 hunner), der døde af neurologisk sygdom (isolater 1-5, kuld 1). Isolat 6 stammer fra hjernen hos en 10 uger gammel mandlig Maltesisk terrier, der var 1 ud af 4 kuldkammerater (kuld 2), der døde af neurologisk sygdom. Isolat 7 stammer fra hjernen hos en 10 uger gammel kvindelig miniature puddelhvalp (kuld 3), der døde af neurologisk sygdom. Isolat 8 blev afledt af nyren fra en 18 måneder gammel kvindelig miniature Gravhund, der døde af nyresvigt (tabel 1).

Ved postmortem blev væv opsamlet aseptisk og homogeniseret (ti Broeck vævshomogenisator; Corning, Corning, NY) ved anvendelse af PBS, pH 7.2, plus 2 af den antibiotiske-antimykotiske opløsning (Gibco, Gaithersburg, MD). Mikrosporidiale sporer blev oprenset fra værtsvævshomogenat under anvendelse af en tidligere beskrevet percoll densitetsgradientmetode modificeret ved at ændre centrifugeringshastigheden til 600 g . Mikrosporidierne blev dyrket i rk-13-celler (ATCC CCL-37) under anvendelse af RPMI 1640-medium suppleret med 5% føtalt bovint serum og 2 liter antibiotikum-antimykotisk opløsning (Gibco) som tidligere beskrevet . Parasitkultur og DNA-analyse blev udført over flere måneder baseret på modtagelse af de forskellige case-prøver, så muligheden for utilsigtet krydskontaminering var ubetydelig.

DNA-isolering

for isolater 1-6 og 8 blev parasitter dyrket i kortvarig kultur for at generere tilstrækkelige sporer til molekylær karakterisering. For isolat 7 blev parasitter direkte oprenset fra frisk hvalpehjernevæv til DNA-isolering. For de fleste isolater blev DNA ‘ et ekstraheret fra oprensede sporer ved hjælp af Instagenmatricen (BioRad, Hercules, CA) efter producentens protokol for bakteriekulturer . For noget af det molekylære arbejde med isolater 6 og 8 blev sporer behandlet som tidligere beskrevet, og DNA blev ekstraheret fra sporer ved hjælp af en standard phenolchloroformekstraktionsmetode ved anvendelse af et partitioneringsgelmikrofuge-rørsystem (light phase Lock Gel system; 5 Prime Karr 3 Prime producent , Vestchester, PA) for at optimere DNA-genopretning. DNA ‘ et blev ethanol udfældet, pelleten blev resuspenderet i TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6), og DNA-koncentrationen blev estimeret ved anvendelse af A260 : A280-forhold ved UV-spektrofotometri (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscatve, NJ). DNA ekstraheret fra vævskultur-afledte sporer af encephalitis hellem blev anvendt som en positiv kontrol, og en reagens-kun negativ kontrol blev inkluderet i alle ekstraktions-og sekventeringsreaktioner.

DNA partiel sekventering og analyse af den lille underenhed ribosomal DNA (SSU rRNA) gen

en del af 5′ – enden af SSU rRNA-genet fra hver af de 8 isolater blev amplificeret ved anvendelse af primerpar PMP1 og PMP2, som tidligere beskrevet . Polymerasekædereaktionen (PCR) for hvert isolat blev udført efter producentens anvisninger (GeneAmp PCR core reagenser, N808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). Forstærkningen blev udført i en termisk cycler (PTC-200 Peltier; MJ Forskning, vandby, MA). Efter initial denaturering i 5 minutter ved 95 liter C blev tak polymerase (0,5 U) sat til hver 25-liter reaktion. Prøverne gennemgik derefter 35 cyklusser med denaturering (94 liter C, 30 sekunder), udglødning (60 liter C, 30 sekunder) og forlængelse (72 liter C, 1 minut) efterfulgt af 10 minutter ved 72 liter C til endelig forlængelse. Ikke-inkorporerede nukleotider blev fjernet ved hjælp af kromatografikolonner (Micro Bio-Spin 30; BioRad). Prøverne blev holdt ved 4 liter C, indtil de blev behandlet til automatisk sekventering.

DNA-analyse af ITS-regionen

en del af ITS-regionen af det ribosomale RNA-gen i hvert isolat blev amplificeret ved PCR med int530f-og int580r-primerparet under anvendelse af de ovenfor beskrevne amplifikationsmetoder. Det resulterende PCR-produkt blev sekventeret i en automatiseret DNA-sekvensator (model 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems/Roche Molecular Systems, Branchburg).

DNA automatiseret sekventering

PCR-forstærket DNA af hvert isolat blev amplificeret til automatiseret sekvens med et kommercielt sæt (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle sekventering Ready-Reaction Kit; Promega, Madison, med) efter producentens anvisninger. Alle reaktioner blev kørt i en termocycler (MJ Research Minicycler). Prøverne gennemgik derefter 35 cyklusser med denaturering (94 liter C, 30 sekunder), udglødning (60 liter C, 30 sekunder) og forlængelse (72 liter C, 1 minut) efterfulgt af 10 minutter ved 72 liter C til endelig forlængelse. Forlængelsesprodukter blev oprenset ved hjælp af kromatografikolonner (mikro Bio-Spin; BioRad), tørret i en vakuumcentrifuge (Savant Instruments, Holbrook, NY) og opbevaret ved -20 liter C indtil sekventeret i en automatiseret sekvensator (Perkin-Elmer 377 ABI Applied Biosystems).

ved hjælp af justeringsprogrammer (sekventering; Genkoder, Ann Arbor, MI) blev der opnået konsensussekvenser af rurit 265-baser for en del af SSU rRNA-genet for hvert parasitisolat. Disse sekvenser blev evalueret for homologi mod tidligere rapporterede Encephalitosonsekvenser i NCBI GenBank-databasen ved hjælp af en simpel BLASTN-søgning.

dobbeltstrenget DNA heterodupleks mobilitetsanalyse

DNA fra isolat 6 blev amplificeret ved PCR med primerparet int530f og int580r som tidligere beskrevet . De PCR-amplificerede produkter blev analyseret til generering af heteroduplekser og homoduplekser ved anvendelse af tidligere karakteriserede isolater af E. cuniculi fra forskellige værter.

resultater

i alt 8 parasitisolater fra 4 separate kliniske udbrud blev etableret i vævskultur. Både lette mikroskopiske træk og in vitro-vækstkarakteristika hos parasitterne antydede, at de var E. cuniculi, en mikrosporidian, der tidligere blev rapporteret hos hunde såvel som andre værter. Delvis sekventering af 5 ‘ – enden af hvert isolats SSU rRNA–gen (GenBank Af144246-Af144253) bekræftede parasitternes identitet som E. cuniculi, da alle prøver viste 100% homologi med tidligere offentliggjorte sekvenser (GenBank L39107desorgoa, L17072¦ESORGSMALL; 98470¦ECDSSRR2).Heterodupleksanalyse og sekventering af ITS-regionen af det ribosomale RNA-gen karakteriserede yderligere alle hundeisolaterne som stamme III, hvilket bekræfter tidligere rapporter om subtile variationer blandt E. cuniculi isolater fra forskellige gnavere, kaniner og humane værter. Figur 1 illustrerer DNA-homodupleksdannelse mellem hundeisolat 6 og et tidligere karakteriseret stamme III-isolat såvel som heterodupleksdannelse mellem isolat 6 og de andre E. cuniculi-stammer.

Diskussion

den biologiske betydning af flere stammer af E. cuniculi er endnu ikke afklaret; evnen til at skelne mellem parasitstammer kan dog give et værktøj til sporing af infektionskilder i epidemiologiske undersøgelser. Vores molekylære data, der identificerer 8 mikrosporidiske isolater fra hunde som E. cuniculi stamme III er enig med en tidligere undersøgelse, der klassificerede 2 hundeisolater som stamme III . Kaninisolater, mus og rævisolater er blevet rapporteret som stammer I eller II . Disse data tyder på, at stamme III overvejende kan være forbundet med hunde. Menneskelige isolater er blevet identificeret som stamme III på den vestlige halvkugle og som stamme I i Europa . Selvom kilden(E) til menneskelig eksponering for E. cuniculi er ukendt, der er stigende tegn på, at dyr kan tjene som infektionsreservoirer, og der er mulighed for at overføre organismen mellem dyr og mennesker. Det er en interessant mulighed, at geografiske og kulturelle forskelle i ejerskab af kæledyr kan spille en rolle i menneskelig eksponering, da hunde er almindelige kæledyr i USA, mens kaniner ofte holdes som kæledyr eller som mad i Sverige og andre europæiske lande.

undersøgelse af fækale og urinprøver fra de klinisk normale Boston terrier-forældre og 1 hvalp fra kuld 1 viste lave niveauer af sporeudskillelse for karrus 4 måneder efter død af kuldkammerater (isolater 1-5; upublicerede data). Denne observation antyder yderligere en mulig mekanisme til direkte eller indirekte transmission af parasitterne fra hunde til mennesker gennem forurening af lokaliserede miljøer med urin og fækal udskillelse af hunde. Selvom ingen epidemiologisk undersøgelse har vurderet forholdet mellem ejerskab/eksponering af kæledyr og humane mikrosporidiale infektioner, i et enkelt tilfælde, hvor børn blev udsat for hvalpe med åbenlys encephalitis, serokonverterede 1 ud af 3 børn . Yderligere E. cuniculi isolater fra forskellige værter skal analyseres for yderligere at evaluere risikoen for at opretholde potentielt inficerede kæledyr i husholdningerne hos immunkompromitterede personer med høj risiko for mikrosporidiale infektioner.

anerkendelser

Vi takker patologer fra veterinærmedicinsk diagnostisk laboratorium Jay Hoffman, Joanne Mansell og Bruce Abbitt for at levere hundevæv til denne undersøgelse.