Definition
fluorescerende mærkning er processen med at binde fluorescerende farvestoffer til funktionelle grupper indeholdt i biomolekyler, så de kan visualiseres ved fluorescensafbildning (nature.com). tilgængeligheden af nye fluoroforer har dramatisk ændret mulighederne for følsom påvisning af biomolekyler og analysen af deres interaktioner. Forbedrede fluorescerende farvestoffer muliggør nu tidligere umulige undersøgelser af cellulære strukturer og cellulære processer. Fluorescerende etiketter giver mange fordele, da de er meget følsomme selv ved lave koncentrationer, er stabile over lange perioder og ikke forstyrrer målmolekylernes funktion. Den målrettede billeddannelse af mærkede celler gør det muligt at spore dem in vitro og in vivo. Brug af forskellige fluoroforer i den samme prøve kan også tillade samtidig observation af flere molekyler på samme tid. De mest almindeligt anvendte fluoroforer er Fluoresceinisothiocyanat (FITC), derivater af rhodamin (TRITC), coumarin og cyanin. Disse syntetiske organiske farvestoffer bruges til at mærke biomolekyler som proteiner, peptider, antistoffer, nukleinsyrer, bakterier eller gær. Naturligt forekommende fluorokromer, såsom grønt fluorescerende Protein (GFP), kan også bruges til at mærke levende celler genetisk.fluorescerende mærkning giver forskere mulighed for at undersøge konformationsdynamikken og molekylære interaktioner mellem proteiner eller spore deres bevægelser for bedre at forstå deres biologiske funktioner (Modesti M, 2011). For at få bedre indsigt i receptor-ligandbinding, proteinstrukturer og aktivitet kan enkeltpeptider også mærkes. Fluorokrommærkede antistoffer anvendes i vid udstrækning i biomedicinsk forskning til at detektere antigener i immunofluorescensanalyser og er også vigtige værktøjer inden for immunodiagnostik. For at sikre pålidelige resultater bør fluorophore-konjugationen ikke forstyrre antistoffets antigenbindende egenskaber (Nath N et al, 2016).fluorescerende mærkning af nukleinsyrer
Fluorescensbaserede analyser spiller en vigtig rolle i biofysiske undersøgelser af strukturen, funktionen og dynamikken i nukleinsyrer. Nylige fremskridt inden for mærkningsmetoder og billeddannelsessystemer har muliggjort direkte in vivo observation af DNA og RNA og af deres interaktioner med andre cellekomponenter. Levende cellebilleddannelse af nukleinsyrer har åbnet nye veje for bedre forståelse af kromatinorganisation og genekspressionsregulering. (Dirks et al, 2018).
komplekse polysaccharider, såsom heparin, er strukturelle komponenter i den ekstracellulære matrice. Disse polysaccharider er essentielle for cellulær adhæsion, migration og vækst (Prigent-Richard S. Et al, 1998). Nogle forbindelser er også kendt for deres antikoagulerende, antitrombotiske, antiinflammatoriske, antivirale og antiangiogene egenskaber. Fluorescensbaserede metoder gør det lettere at identificere nye bioaktive polysaccharider og karakterisere deres biologiske funktioner (Roger O et al, 2002).
cellulære lipider spiller en afgørende rolle i cellen til energilagring, til dannelse af cellulære membraner og til intracellulære signalprocesser (M. Og Fairn G, 2014). Det lipofile farvestof Nile red bruges i vid udstrækning til at plette intracellulære lipider for at analysere deres placering og organisation (Greenspan P et al., 1985). Desuden er specifik mærkning i levende celler også mulig for at studere lipiddynamik (Schults C et al., 2010).
fluorescerende Mærkningsteknikker
almindeligt anvendte fluorescerende mærkningsmetoder bruger kemiske, kemiske, peptid / protein tag og genetiske mærkningsteknikker (Sahoo H, 2012 , Toseland CP, 2013).
- kemiske mærkningsteknikker: fluoroforer lægger til målmolekylerne gennem kemisk modifikation (kovalent eller ikke-kovalent binding). Kemiske mærkningsmetoder har flere fordele, da de er robuste, lette at udføre og meget effektive med en lang række fluoroforer. De er mere egnede til in vitro-undersøgelser snarere end in vivo.reaktioner tillader hurtig, højeffektiv og selektiv mærkning in vivo og in vitro og kan bruges til at målrette proteiner eller hele celler. På grund af etiketternes store størrelse kan der dog forekomme interferenser med målmolekylernes funktion.
- peptid / protein tag: en nyligt udviklet og meget lovende teknik tillader specifik og selektiv mærkning af proteiner gennem inkorporering af korte fluorescerende tags, som ikke forstyrrer foldningen eller molekylets funktion. Denne teknik er også let at udføre og kan bruges til at undersøge forskellige steder af enkeltproteiner afhængigt af peptidmærkets specificitet.genetisk mærkning: genetisk mærkning kan opnås ved hjælp af proteindomæner, små peptider eller enkelte aminosyrer, der er markeret med fluorescerende farvestoffer og specifikt kan fastgøres til steder langs kromosomer in vivo. Denne tilgang tillader påvisning af kromosomale abnormiteter såsom sletninger eller duplikering.
- flerfarvet mærkning: Et almindeligt krav til levende celleafbildning og til strømningscytometriapplikationer er evnen til at følge eller detektere flere fluorescerende mærkede proteiner på samme tid. Til dette formål kan specielt designede farvestoffer med et meget stort Stokes-skift anvendes, hvilket muliggør samtidig overvågning af forskellige biokemiske processer.
Fluorescensbaserede analyser
Fluorescensbaserede analyser er afhængige af fluoroforers evne til at udsende lys igen efter eksponering for lyspartikler eller fotoner. Forskellen i bølgelængde mellem eksitationslys og emissionslys, det såkaldte Stokes-skift, kan detekteres i mikroskoper og billeddannelsessystemer. Hver fluorophore har et specifikt Stokes-skift. Forskellige analyser giver forskere mulighed for at lokalisere biomolekyler, observere dem i realtid, undersøge deres interaktioner og studere aktiviteter.
- fluorescensmikroskopi
fluorescensmikroskopi muliggør identifikation af celler og cellulære komponenter og overvågning af cellefysiologi med høj specificitet. Fluorescensmikroskopi adskiller udsendt lys fra eksitationslys ved hjælp af optiske filtre. Anvendelsen af to indikatorer tillader også samtidig observation af forskellige biomolekyler på samme tid. Mens konventionelle billeddannelsessystemer tillader en opløsning på 200 til 300 nm på grund af fysiske diffraktionsgrænser, overvinder nye superopløsningsfluorescensmikroskoper som STED (stimuleret emissionsudtømning) disse grænser og giver indsigt i molekylernes nanoskala-verden (Sanderson MJ et al., 2014). - Strømningscytometri
Strømningscytometri bruges i vid udstrækning i grundlæggende forskning og klinisk praksis til at måle signalet fra specifikke fluoroforer. Celler og partikler analyseres og sorteres til sidst i “realtid”, når de passerer gennem lysstrålen af detektorer, der kvantificerer fluorescensen produceret af mærkede antistoffer eller ligander. Disse markører binder til specifikke molekyler på celleoverfladen eller inde i cellen, hvilket tillader deres påvisning og kvantificering. Flere parametre som størrelse og volumen kan måles på enkeltceller, og forskellige celletyper kan isoleres og karakteriseres (Nolan JT og Condello D, 2013). Strømningscytometri finder brede anvendelser inden for områder som immunologi, hæmatologi, transplantationsmedicin, onkologi og genetik.fluorescens in situ hybridisering (FISH)
fluorescens in situ hybridisering (FISH) tillader lokalisering af specifikke DNA-sekvenser på kromosomer. Fluorescerende DNA-eller RNA-prober bruges til at hybridisere og identificere komplementære mål-DNA-sekvenser. Fisk er traditionelt blevet brugt til at kortlægge gener på kromosomer, for eksempel under Human Genome Project. I dag anvendes fluorescens in situ hybridisering hovedsageligt til diagnostiske formål til påvisning af kromosomale abnormiteter eller i analysen af kræftceller (O ‘ Connor C, 2008). - Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)
Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) tillader analyse af tidsmæssige ændringer i fluorokromernes fluorescensintensitet, som er forårsaget af kemiske, biologiske eller fysiske påvirkninger. FCS blev først introduceret for at undersøge interaktion mellem lægemidler og DNA og repræsenterer nu et følsomt værktøj til bestemmelse af koncentration og aggregeringsniveauer af proteiner såvel som til observation af molekylære interaktioner (Tian Y et al., 2011). - Microarrays
Microarrays tillader undersøgelse af genekspression under forskellige forhold. Tusinder af gener kan undersøges på samme tid på DNA-chips. Disse er mikroskopiske dias trykt med små pletter indeholdende kendte DNA-sekvenser, der selektivt kan binde til fluorescerende mærkede mRNA/cDNA-molekyler. Efter hybridisering læses DNA-chippen ud, og dataene bruges til at oprette genekspressionsprofiler (Hoen PAC et al., 2003).
fluorescerende etiket: levende Cellebilleddannelse
den kinetiske observation af cellulære processer ved hjælp af Time-lapse fluorescensmikroskopi er blevet en grundlæggende teknik inden for cellebiologi, da levende cellebilleddannelse kan give meget værdifuld indsigt i cellulær vækst og transportmekanismer. En stor udfordring i time-lapse mikroskopi er at minimere fototoksiske effekter som følge af fotoblegning. Lyseksponeringen ødelægger gradvist fluorescerende molekyler, hvilket fører til en reduktion af fluorescenssignalet og til dannelsen af frie radikaler, som kan skade cellerne. Derfor er det afgørende for metoden til levende celleafbildning at finde en balance mellem at reducere lyseksponeringen så meget som muligt og få nyttige signaler til at observere cellerne. Forskere er også nødt til at skabe et fysiologisk miljø, der gør det muligt at replikere in vivo-dynamikken tæt. (Ettinger og T, 2014).
PromoCell fluorescerende mærkning
tilgængeligheden af nye fluoroforer har dramatisk ændret mulighederne for følsom påvisning af biomolekyler og analysen af deres interaktioner. Forbedrede fluorescerende farvestoffer muliggør nu tidligere umulige undersøgelser af cellulære strukturer og cellulære processer. PromoCell leverer en bred vifte af fluoroforer af høj kvalitet til fluorescerende mærkning af forskellige biomolekyler: proteinmærkning, antistofmærkning, nukleinsyremærkning (DNA-mærkning, RNA-mærkning) samt komplette mærkningssæt og klar til brug fluorescerende konjugater.
vores Promofluorfarvestoffer er omkostningseffektive alternativer til velkendte, førende fluoroforer og spænder over bølgelængdespektret fra blåt til langt rødt. De viser en fremragende fluorescensintensitet og fotostabilitet, en stærk lysabsorption, højt fluorescenskvantumudbytte og god vandopløselighed og kan bruges til fluorescensmikroskopi, fluorescerende in situ hybridisering (fisk), fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) og mikroarrays (protein, DNA). Nogle af dem tilbyder et ekstra stort Stokes-skift, hvilket gør dem ideelle til flerfarvet mærkning eller strømningscytometri-applikationer. Promofluorfarvestoffer er tilgængelige f. eks. som NHS-estere, maleimider og amino-modificerede etiketter klar til kovalent kobling eller som konjugater med biotin, phalloidin og deoksynukleotider (dUTPs). Desuden leverer vi også Protein af høj kvalitet & Antistofmærkningssæt med forskellige Promofluorfarvestoffer.