for at inducere hæmolyse

resultater

Hlya-induceret hæmolyse kræver aktivering af Purinerge receptorer.

Supernatant fra det larr-hemolysin (HlyA)–producerende E. coli–stamme ARD6 lyses heste -, menneske-og murine erythrocytter (Fig. 1). Figur 1 viser den hlya-inducerede hæmolyse som en funktion af tiden. Time-lapse eksperimenter med murine og humane erythrocytter bundet til dækglas afslørede, at HlyA-induceret hæmolyse er en sekventiel proces. Inden for de første 20 minutter inducerede HlyA crenation af de røde blodlegemer som et resultat af cellekrympning efterfulgt af en gradvis volumenforøgelse og endelig lysis af cellerne (Fig. 1a og 1b, Film S1). Denne sekventielle krympning og hævelse gælder også på enkeltcelleniveau. Det er således ikke forskellige populationer af røde blodlegemer, der enten krymper eller svulmer, men snarere at en enkelt erytrocyt først krymper og derefter svulmer som følge af hlya-applikation. Erythrocytsuspensionen (1,25%) blev inkuberet med fortyndet E. coli supernatant (50 liter · ml−1). Erythrocytter fra de tre testede arter viste markant forskel i reaktionsevnen over for HlyA (Fig. 1C) med den laveste følsomhed over for hlya i humane erythrocytter. I alle de følgende eksperimenter blev mængden af tilsat E. coli supernatant justeret til at producere 50% hæmolyse efter 60 minutters inkubation.

Vi bruger generelt filtreret E. coli (ARD6) supernatant til at inducere hæmolyse, medmindre andet er angivet. Denne tilgang blev valgt for at sikre, at vores resultater også ville gælde in vivo, hvor HlyA frigives fra E. coli sammen med forskellige andre komponenter. Når vi valgte denne tilgang, var vi imidlertid nødt til at kontrollere, at hæmolysen induceret af HlyA-producerende E. coli faktisk kunne tilskrives HlyA. Derfor rensede vi HlyA fra vores ARD6-kultur. Efter oprensning blev en suspension af den oprensede HlyA adskilt på en 5-15% natriumdodecylsulfat (SDS) gel. Et enkelt 100-kDa-bånd dukkede op efter coomassie r-farvning, og massespektroskopi identificerede båndet som HlyA (Fig. S1 A og B). Som en ekstra kontrol brugte vi supernatanten fra E. coli-stammen D2103, en ikke-patologisk laboratoriestamme af E. coli, der ikke producerer HlyA. Supernatanten fra disse bakterier inducerede ikke hæmolyse i humane, murine eller heste erythrocytter (Fig. S1D). Desuden sammenlignede vi vores resultater med HlyA venligt leveret af Prof. Sucharit Bhakdi, University of mains, Tyskland (med aktiviteten på 10 ng·ml−1 for 50% hæmolyse af karret, Fig. S2). I det følgende, når renset HlyA nævnes, er det med henvisning til dette præparat. Under vores indledende test af den biologiske aktivitet af HlyA opdagede vi, at ATP-scavenger apyrase fuldstændigt hæmmede HlyA-induceret hæmolyse af heste erythrocytter. Dette fund var virkelig overraskende, da det indebar ekstracellulær ATP, der var nødvendig for hæmolysen påført af HlyA-producerende E. coli. Da ekstracellulær ATP er et signalmolekyle, der aktiverer P2-receptorer, kan vores fund antyde, at den fremherskende poremodel for HlyA-induceret hæmolyse kan være en forenkling. Derfor testede vi effekten af ATP scavenging mere grundigt. Vi fandt ud af, at apyrase fuldstændigt hæmmede hæmolyse af ikke kun heste, men også murine og humane erythrocytter (Fig. 2A). Derudover reducerede geksokinase, som hurtigt nedbryder adenosintrifosfat (ATP) til adenosindiphosphat (ADP), ligeledes den hlya-inducerede hæmolyse i røde blodlegemer af Murin og human oprindelse på en koncentrationsafhængig måde (Fig. 2B). Dette fund blev verificeret af renset HlyA (Fig. 2B, indsat). Det er værd at bemærke, at i humane erythrocytter forstærkede både apyrase og geksokinase den hlya-inducerede hæmolyse ved lavere koncentrationer. Sondringen kan tyde på en forskel i P2-receptorekspressionsmønster på de røde blodlegemer mellem arten.

for at validere relevansen af dette fund var det vigtigt at lære, om P2-receptorantagonister påvirkede den hlya-inducerede hæmolyse. Den ikke-selektive P2-receptorantagonist PPADS koncentrationsafhængigt nedsatte hæmolyse induceret af HlyA-producerende E. coli i heste -, murine-og humane erythrocytter (Fig. 2C). EC50-værdien for PPADS var henholdsvis 520 liter, 400 liter og 180 liter for henholdsvis humane, murine og heste erythrocytter. Dette fund blev underbygget for hele spektret af hlya-koncentrationer (Fig. 2D) testet i humane erythrocytter udsat for oprenset HlyA. Koncentrationsresponsforholdet var kompatibelt med kompetitiv antagonisme, og det skal bemærkes, at effekten af endda maksimale toksinkoncentrationer blev reduceret af P2-receptorblokkeren. Således synes P2-receptoraktivering at være involveret i hlya-induceret hæmolyse. Den ikke-selektive P2-receptorantagonist suramin reducerede også koncentrationsafhængigt hlya-induceret hæmolyse hos alle tre arter (data ikke vist). I højere koncentrationer forårsager suramin imidlertid dramatisk erytrocytkrympning og er derfor muligvis ikke egnet til evaluering af P2-receptorimplikation i erythrocytter.

for at vurdere, om effekten af den purinerge antagonist på hæmolyse kun var et resultat af øget osmolalitet, testede vi effekten af ekstracellulær saccharose på den HlyA-inducerede hæmolyse (data ikke vist). Saccharose (1 mM) faldt kun let hæmolyse (5,1% – 1,7%), mens 10 mM og 75 mM-saccharose markant nedsatte hæmolyse (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Da koncentrationerne af antagonister og Atpaser anvendt i denne undersøgelse aldrig oversteg 1 mM, kan effekten ikke være resultatet af øget osmolaritet. Vores resultater afspejlede heller ikke uselektiv binding mellem antagonisterne og toksinet. Dette blev testet i heste-erythrocytter, som blev præinkuberet med HlyA i 10-15 minutter ved 37 liter C eller i 30 minutter ved 4 liter C, grundigt vasket og genophængt med eller uden antagonisterne. Fordi HlyA er inkorporeret i membranen under præinkubationen, fortsatte erytrocytterne med at lyse i fravær af fri HlyA. Fig. S2 viser, at forskellige farmakologiske interventioner reducerede hæmolyse, efter at HlyA var forbundet til erytrocytterne. Antagonisterne var imidlertid mindre effektive, når de blev tilsat til vaskede erytrocytter, hvor den lytiske proces allerede var indledt.

hvilke P2-receptorer er involveret i Hlya-induceret hæmolyse?

erythrocytter udtrykker forskellige typer P2-receptorer. P2-receptorer, der er rapporteret at være udtrykt i modne humane erythrocytter, omfatter P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2H1 (15) og P2H7 (16), mens P2Y1, P2H1, P2H4 og P2H7 synes at være til stede i erythroide stamceller (17). For at teste, hvilken af disse purinerge receptorer der deltager i den HlyA-inducerede hæmolyse, adresserede vi de pågældende receptorer individuelt. Da p2y1-receptoren er impliceret i sorbitolinduceret hæmolyse af plasmodium-inficerede humane og murine erythrocytter (14), testede vi, om denne receptor var ansvarlig for den HlyA-inducerede hæmolyse. P2Y1-receptorantagonisten MRS2179 påvirkede ikke den hlya-inducerede hæmolyse (Fig. S3A) ved koncentrationer (op til 500 liter) ud over, hvad der var nødvendigt for at hæmme hæmolyse i Plasmodium berghei– inficerede erythrocytter (14). Da der ikke er nogen specifikke antagonister for P2Y2-receptorer, undersøgte vi virkningen af HlyA i transgene mus. Den hlya-inducerede hæmolyse var ens i erythrocytter fra p2y2 – / – og P2Y2+ / + mus (Fig. S3B). I tilfælde af P2Y13 testede vi antagonisten MRS2211, som er rapporteret at vise en vis selektivitet over for P2Y13-receptoren (18). MRS2211 reducerede hlya-induceret hæmolyse signifikant i humane og murine erythrocytter (Fig. S3C). Dette fund modsiger vores resultater med geksokinase (nedbrydende ATP til ADP), som skal stimulere snarere end hæmme den ADP-følsomme P2Y13-receptor. Derfor bør geksokinase og MRS2211 give modsatte resultater, hvis P2Y13-receptoren er involveret. Da dette ikke er tilfældet, er P2Y13-receptoren en usandsynlig kandidat til P2-receptoren involveret i hlya-induceret hæmolyse. Vi kan ikke udelukke muligheden for, at inhiberingen produceret af MRS2211 medieres gennem en anden P2-receptor.

dette efterlader i princippet kun P2H-receptorerne, der skal overvejes. Fig. 3A viser, at den ikke-selektive blokering af P2H-receptorer Evans blue kraftigt reducerede den hlya-inducerede hæmolyse, hvilket antyder, at en P2H-receptor er involveret i denne hæmolyse. Af P2H-receptorer udtrykt i røde blodlegemer, betragtede vi p2h7 som den mest sandsynlige mediator af hlya-induceret hæmolyse af følgende grunde. P2h7-receptorerne er kendt for at gennemgå en overgang til en større permeabilitetstilstand, hvilket i sidste ende fører til lysis i visse celler (12). P2h7-receptoren er rapporteret at interagere med kanalproteinet panneksin1 (12), og komplekset skaber en betydelig porepermeabel for større molekyler såsom ethidiumbromid (13). Panneksin1 er udtrykt i humane røde blodlegemer (19) og er for nylig blevet foreslået som ATP-frigivelseskanal i erythrocytter (20). For at teste om p2h7-receptorer deltager i hlya-induceret hæmolyse, brugte vi antagonister med relativ selektivitet for P2H7: Brilliant Blue G (BBG), ATP-2′,3′-dialdehyd (Oksatp) og KN-62 (21). Alle antagonister reducerede koncentrationsafhængigt hæmolyse i heste -, murine-og humane erythrocytter (Fig. 3). Heste-og humane erytrocytter var mere følsomme over for alle de testede stoffer sammenlignet med murine erythrocytter. I denne sammenhæng skal det nævnes, at den murine p2h7-receptor er kendt for at være mindre følsom over for KN-62 sammenlignet med den humane receptor (22). Beskyttelsen mod hæmolyse ved P2H-receptorantagonisme blev igen underbygget for hele koncentrationsområdet for oprenset HlyA i humane erythrocytter ved anvendelse af BBG som et eksempel på en p2h7-antagonist (Fig. 3D). Igen viser antagonisten en væsentlig effekt på hlya-induceret hæmolyse, selv under HlyA-koncentrationer, der producerede maksimal hæmolyse. Inhiberingen af hæmolyse af Oksatp blev verificeret ved anvendelse af oprenset HlyA i murine og humane erythrocytter (Fig. 3e, indsat). Den nye selektive, konkurrencedygtige p2h7-receptorantagonist A438079 reducerede hæmolysen i humane erythrocytter, men var mindre effektiv i murine erythrocytter (Fig. 3F). Immunobloter af plasmamembranfraktioner for p2h7-receptoren bekræfter, at humane og murine erythrocytter udtrykker et protein af relevant Størrelse (66 kDa, Fig. 3G, og fuldt ud i Fig. S4B). Det vil kræve yderligere undersøgelse for fuldt ud at fastslå det relative bidrag af P2H-receptorer i den hlya-inducerede hæmolyse. Med vores nuværende værktøjer kan vi ikke udelukke muligheden for bidrag fra andre P2H-receptorer i den HlyA-inducerede hæmolyse i nogen af de undersøgte arter.

Fig. S4A viser hlya-induceret hæmolyse i Murine (p2h7+/+ og P2H7−/−) erythrocytter. De murine erythrocytter viser en lignende grad af hæmolyse som reaktion på HlyA uanset deres genotype. P2h7 – / – mus og p2h7+ / + mus blev oprindeligt genereret af PFISSER og blev krydset tilbage til BALB/c baggrund. Vi påviste ingen uoverensstemmelser mellem følsomheden over for hlya-induceret hæmolyse i erythrocytter isoleret fra BALB/c og C57BL/6 mus (data ikke vist), selvom C57BL / 6-stammen vides at have en genetisk variation i C-terminalen af p2h7-receptoren (23). Disse data er i overensstemmelse med den minimale effekt af A438079 på murine erythrocytter og den lave proteinekspression af p2h7-receptoren i murine erythrocytter (Fig. 3F og 3G).

disse resultater antyder, at der er mindst en yderligere P2-receptor involveret i den HlyA-inducerede hæmolyse i murine erythrocytter. Da P2H1 og P2H7 deler lignende inhibitorprofiler for BBG, KN – 62 og Oksatp (24), testede vi p2h1-antagonisterne MRS2159 og NF449. MRS2159 koncentrationsafhængigt hæmmet hæmolyse i erythrocytter fra hest (EC50:150 liter) og mus (EC50: 150 liter). Humane erythrocytter var relativt ufølsomme over for antagonisten, men i en koncentration over 250 liter så vi en lille og statistisk signifikant reduktion (Fig. 4A). Denne effekt var meget mere udtalt, hvis renset HlyA blev anvendt (Fig. 4C). Dette indebærer, at der kan være forskelle i det cellulære respons med hensyn til, om de udsættes for HlyA i ren form eller i kombination med andre E. coli-bestanddele. Nf449 koncentrationsafhængigt hæmmer den hlya-inducerede hæmolyse hos mennesker (Fig. 4B). NF449 var meget mindre effektiv i murine erythrocytter i overensstemmelse med den murine p2h1-receptor, der var relativ resistent over for denne hæmmer (25). Det skal understreges, at selvom NF449 er et suraminderivat, fremkaldte det ikke de samme volumenændringer i erythrocytter som suramin. Immunobloter af p2h1-receptoren er kendt for at vise op til 4 bånd i forskellige væv; et 45 kDa ikke-glycosyleret, et 60 kDa glycosyleret og et 95/120 kDa-bånd, der kan være den polymeriserede form af receptoren (26, 27). I vores hænder genkendte p2h1-receptorantistoffet konsekvent et 45 KD-bånd og et meget svagt 60 kDa-bånd i blots af plasmamembraner fra murine og humane erythrocytter (Fig. 4D). Interessant nok fandt vi, at ekspressionsniveauet 60 kDa− båndet var meget højere i p2h7−/ – musene sammenlignet med kontroller (lignende i tre præparater, Fig. 4D). I denne immunoblot justeres proteinniveauerne for at undgå overbelastning af båndene fra p2h7−/− musene, hvilket efterlader 60 kDa-båndet næsten uopdageligt i p2h7+/+ musene. Denne tilsyneladende opregulering af p2h1-receptoren kan potentielt skjule en hæmolytisk fænotype hos p2h7–receptormangelmus. Samlet set understøtter disse data hypotesen om, at både p2h1-og p2h7-receptoren er relevante for den hlya-inducerede hæmolyse. Vores resultater peger på signifikante interspecies variationer, hvor p2h7-receptoren er vigtigere for hæmolyse i humane erythrocytter.

Hlya-induceret hæmolyse forhindres af Panneksin1-antagonister.

Carbenoksolon (28), meflokin og probenecid (30) er blevet anvendt som antagonister med relativ selektivitet for panneksin1. Carbenoksolon reducerede signifikant niveauet af hæmolyse hos alle tre arter med lignende følsomhed (Fig. 5A). Virkningen af carbenoksolon blev igen testet for hele spektret af hlya-koncentrationer (oprenset toksin, Fig. 5B), der også viser betydelige effekter under maksimale hlya-koncentrationer. Meflokin og probenecid blev kun testet i murine og humane erytrocytter. EC50 for meflokin var 25 liter i humane og 18 liter i murine erytrocytter. Probenecid hæmmede hæmolyse i humane erythrocytter med en EC50 på 2 mM, men var mindre effektiv i murine erythocytter. For nylig har de kendte Cl-kanalantagonister NPPB og nifluminsyre vist sig også at hæmme panneksinkanaler (31). Begge stoffer reducerede den hlya-inducerede hæmolyse med en væsentligt mere udtalt virkning på humane erythrocytter (Fig. S5).