forskellige motivensembler specificerer ikke-redundante DNA-bindingsaktiviteter for AP-1-familiemedlemmer i makrofager

statistiske analyser

i Fig. 1C blev forskelle i genekspression testet ved anvendelse af den uafhængige T-test (frihedsgrad = 1, to-tailed) på to replikatforsøg (n = 2). Differentielt udtrykte gener i Fig. 1b blev identificeret ved hjælp af EdgeR55 med standardparametre og ved hjælp af afskæringerne FDR < 0.05 og log2 fold skift til 2. I Fig. 2C, forskelle mellem hver gruppe (Veh, delt og KLA 1 h) blev undersøgt ved hjælp af uafhængig T-test (grad af frihed = 1, to-tailed); antallet af loci i hver gruppe for hver monomer er som følger ATF3 (Veh = 1447, delt = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), Jun (1351, 5976, 6422). Betydning for motiver i Fig. 4A blev beregnet ved hjælp af sandsynlighedsforholdstesten (frihedsgrad = 1) sammenligning af forudsigelserne foretaget af den fulde TBA-model og den forstyrrede TBA-model på alle loci bundet i Veh-behandlede makrofager for atf3 (n = 23.160), Jun (N = 15.548) og Jun (n = 19.653). Betydning for motiver i supplerende Fig. 4C blev beregnet ved hjælp af sandsynlighedsforholdstesten (frihedsgrad = 1) sammenligning af forudsigelserne foretaget af den fulde TBA-model og den forstyrrede TBA-model på alle loci bundet af JunD i GM12878 (n = 7451), H1-hESC (n = 12.931), HepG2 (n = 41.318), K562 (n = 47.477) og SK-n-SH (38.960). Betydning for motiver i Fig. 5b, supplerende Fig. 5B og supplerende Fig. 5C blev beregnet ved hjælp af sandsynlighedsforholdstesten (frihedsgrad = 1) sammenligning af forudsigelserne foretaget af den fulde TBA-model og den forstyrrede TBA-model på alle loci bundet i KLA-behandlede makrofager for Atf3 (n = 36.745), Jun (N = 17.481), Jun (n = 31.641), Fos (n = 24.365), Fosl2 (n = 10.619) og JunB (n = 13.376). Signifikansværdier for Fig. 6f og S6F blev beregnet ved hjælp af F-testen; antallet af loci analyseret for monomerer i Køretøjsbehandlede makrofager er ATF3 (n = 4163), Jun (n = 3004) og Jun (n = 4148); antallet af loci analyseret for monomerer i KLA-behandlede makrofager er: atf3 (n = 4577), Jun (n = 3232), Jun (n = 4366), Fos (n = 4477) og JunB (n = 3616).

generering af brugerdefineret genom til BALB/cJ

et brugerdefineret genom til BALB / cJ ved at erstatte invariante positioner af mm10-genomet med alleler rapporteret af Musegenomeprojektet (version 3 VCF-fil)43. For C57BL/6J blev mm10-referencegenomet fra UCSC-genomsøgeren anvendt. For at muliggøre sammenligninger mellem BALB/cJ og C57BL/6J under analyse blev koordinaterne for det brugerdefinerede genom til BALB/cJ forskudt for at matche positionerne for mm10-referencegenomet ved hjælp af MARGE34. Vi analyserede ikke nogen læsninger, der faldt inden for sletninger i BALB/cJ. Læser, der overlappede med en indsættelse, blev tildelt den sidste overlappende position i referencestammen.

analyse af chipsekv-toppe

sekventering læses fra Chipsekv-eksperimenter blev kortlagt til mm10-samlingen af musens referencegenom (eller BALBc / J custom genome) ved hjælp af den nyeste version af Bue2 med standardparametre56. Kortlagt ChIP-sek læser for at identificere formodede TF-bindingssteder med HOMER57 findPeaks-kommando (med parametre-størrelse 200-l 0-C 0-fdr 0.9) ved hjælp af input ChIP-eksperimentet svarende til behandlingsbetingelsen. For at reducere antallet af falske positive toppe beregnede vi IDR ved hver top (ved hjælp af version 2.0.3 af idr-programmet) med HOMER peak score beregnet for hvert replikateksperiment som input til IDR og filtrerede derefter alle toppe, der havde IDR kr 0,0558. De novo motiver blev beregnet med HOMER findMotifsGenome.pl kommando med standardparametre. Berigelse af de novo-motiver blev beregnet ved hjælp af findKnownMotifs.pl program i HOMER med standardparametre.

kvantificering af RNA-ekspressionslæsninger genereret fra RNA-sekv-eksperimenter blev justeret til mm10-musens referencegenom (eller BALBc / J custom genome) ved hjælp af STAR aligner med standardparametre59. For at kvantificere ekspressionsniveauet for hvert gen beregnede vi RPKM med de læsninger, der var inden for en ekson. Un-normaliserede sekventering læser blev brugt til at identificere differentielt udtrykte gener med EdgeR55; vi overvejede gener med FDR < 0,05 og en ændring i ekspression mellem to eksperimentelle betingelser to gange eller større differentielt udtrykt. For at kvantificere udtrykket af spirende RNA ‘ er kommenterede vi vores Chip-sek-toppe med antallet af GRO-sek-aflæsninger (normaliseret til 10 millioner), der var inden for 500 bps fra peak center ved hjælp af HOMER annotatePeaks.pl kommando.

TBA model træning

for hver AP-1 monomer under hver behandlingstilstand trænede vi en model til at skelne bindingssteder for hver monomer fra et sæt tilfældigt udvalgte genomiske loci. Sættet af tilfældige baggrundslokier, der blev brugt til at træne hver model, blev valgt i henhold til følgende kriterier: (1) GC-indholdsfordelingen af baggrundslokerne matcher GC-indholdet af bindingsstederne for en given monomer, (2) indeholder ingen tvetydige eller ikke-anvendelige positioner, og (3) Antallet af baggrundssekvenser svarer til antallet af bindingssteder k. For hver af sekvenserne i det kombinerede sæt af bindingsstederne og baggrundslokalerne beregnede vi den højeste log-odds-score (også kaldet motivscore) for hvert af de n-motiver, der vil blive inkluderet i model60 Motivkampe i begge retninger blev overvejet. Log-odds scorer mindre end 0 blev sat til 0. Pr. standardforarbejdningsprocedurer forud for træning af en lineær model, vi standardiserede log-odds-scorerne for hvert motiv, skalering af sæt af scoringer for hvert motiv, så gennemsnitsværdien er 0, og variansen er 1. Standardisering skalerer scorerne for alle motiver til samme rækkevidde (længere motiver har en større maksimal score) og hjælper også med at reducere effekten af multi-collinearitet på modeluddannelsen. Også, de funktioner, der bruges til træning af vores model, er en n ved 2k-matrice af log-odds-scoringer standardiseret på tværs af hver række. At generere det tilsvarende array af etiketter, vi tildelte hvert bindingssted en etiket på 1 og hver baggrund loci en etiket på 0. Ved hjælp af denne funktionsmatrice og label array trænede vi vægte for hvert motiv ved hjælp af en L1 Straffet logistisk regressionsmodel som implementeret af scikit-learn Python package61. Motivvægte vist i vores Analyse er middelværdierne på tværs af fem runder af krydsvalidering ved hjælp af 80% af dataene til træning og 20% til test i hver runde. Modeller blev trænet til Chipsekv ‘ er genereret i denne undersøgelse såvel som data hentet fra NCBI-genekspression Omnibus (tiltrædelsesnummer GSE46494) og ENCODE data portal (https://www.encodeproject.org).

kvantificering af multiple collinearitet

for at vurdere omfanget af multi-collinearitet i de motivscorefunktioner, vi brugte til at træne vores modeller, tog vi hver funktionsmatrice svarende til hvert eksperiment og beregnede VIF for hver motif38. For at beregne VIF bestemmer vi først bestemmelseskoefficienten, R2, for hvert motiv ved at regressere log-odds-scorerne for et motiv mod log-odds-scorerne for de resterende motiver. Ved hjælp af bestemmelseskoefficienten kan tolerancen for hvert motiv beregnes som forskellen mellem 1 og bestemmelseskoefficienten (1 − R2). VIF er den gensidige af tolerancen \(\frac{1}{{1-R^2}}\). Vi brugte linear_model-modulet i sklearn Python-pakken til at beregne bestemmelseskoefficienten.

Motivklyngning og sammenlægning

vi scorede ligheden mellem alle par af DNA-sekvensmotiver ved at beregne Pearson-korrelationen af de justerede positions sandsynlighedsmatricer (PPMs) svarende til et givet par motifs62. Pearson – korrelationen for et par motiver A og B af længde i beregnes ved hjælp af formlen:

ppm ‘ er blev først justeret ved hjælp af Smith–Vandmand-justeringsalgoritmen63. Kortere motiver er polstret med baggrundsfrekvensværdier inden justering. Huller i justeringen var ikke tilladt, og hver position i justeringen blev scoret med Pearson-korrelationen. Pearson-korrelationen blev derefter beregnet ved hjælp af den optimale justering. Derefter blev sæt af motiver, der har ppm ‘ er med en Pearson-korrelation på 0,9 eller derover, fusioneret ved iterativt at tilpasse hver PPM inden for sættet og derefter gennemsnit nukleotidfrekvenserne ved hver position.

vurdering af motivets betydning for TBA

p-værdier for TBA blev beregnet ved hjælp af log-Sandsynlighed ratio test. Hvert motiv blev fjernet fra det sæt funktioner, der blev brugt til at træne en forstyrret TBA-model (ved hjælp af fem gange krydsvalidering). Vi brugte derefter den fulde model (indeholdende alle motiver) og den forstyrrede model til at beregne sandsynligheden for at observere binding på alle bindingssteder og baggrundssekvenser for en given monomer og alle baggrundsregioner. Forskellen i sandsynligheden beregnet af den fulde model og den forstyrrede model blev derefter brugt til at udføre chi-kvadreret test for hvert motiv. Chi-kvadreret test blev udført ved hjælp af scipy python package64.

sammenligning med andre metoder

BaMM motif og gkm-SVM blev begge kørt med standardparametre. Vi brugte den nyeste version af den større skala gkm-SVM, LS-GKM (kompileret fra kildekode hentet fra https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm på 8/25/16), og BaMM motiv; v1.0 hentet fra https://github.com/soedinglab/BaMMmotif39,65. Begge modeller blev trænet ved hjælp af fem gange krydsvalidering. Model ydeevne blev scoret ved hjælp af roc_auc_score og precision_score funktioner fra metrics modul af sklearn.

forudsigelse af ændringer i AP-1-binding efter en times KLA-behandling

for at forudsige ændringen i binding efter KLA-behandling udnyttede vi de motivvægte, der blev lært for hvert af N-motiverne (vn) af en TBA-model, der blev trænet på de Køretøjsbehandlede data (Vveh = ) og en TBA-model, der blev trænet på 1-h KLA-behandlede data (Vkla = ) for hver AP-1-monomer. Den forudsagte ændring i bindingen for hver sekvens er derefter forskellen mellem prikproduktet af de standardiserede motivscore beregnet for sekvensen hvert af k−bindingsstederne (Sk = ) med UCK − motivvægten og prikproduktet af motivscore og Veh-motivvægten (Prikkla-veh,k = Vik-Vik-Vik-Vik-Vik). Forudsigelser blev foretaget for alle genomiske loci, der krydsede med en top for en af AP-1 monomerer i enten køretøjet eller KLA-behandlingstilstanden.

forudsigelse af stammespecifik binding med TBA

for at forudsige stammespecifik binding udnyttede vi de motivvægte, der blev lært for hvert af N-motivene (vn) ved hjælp af en TBA-model (V = ) for hver AP-1-monomer ved hjælp af C57BL/6J-dataene, og motivscore beregnet for hvert af k-bindingsstederne ved hjælp af den genomiske sekvens for C57BL/6J og BALBc / J (SC57,k = , SBAL,k = ). Dernæst beregnede vi forskellen mellem motivscorerne for C57BL6/J og BALBc/J (DN = ) og standardiserede derefter score-forskellene for hvert motiv på tværs af alle k-bindingsstederne, der havde en mutation, når man sammenlignede BALBc/J med C57BL / 6J, hvilket gav standardiserede motivscore-forskelle for hvert bindingssted (NN = standardisere(Dn) = ). Endelig lavede vi derefter en forudsigelse for stammespecifik binding ved at beregne prikproduktet af motivvægtene og den standardiserede forskel på motivscorerne mellem C57BL6/EiJ og BALBc/J for det KTH-muterede bindingssted (KURTC57−BAL = V-kurt).

TBA-2strain model training

for hver genomisk loci, der krydsede med en top for en af AP-1 monomerer, i enten C57BL/6J eller BALBc / J, beregnede vi den højeste log-odds score for hvert af de n-motiver, der vil blive inkluderet i modellen,ved hjælp af den genomiske sekvens fra begge stammer , hvilket gav to sæt motivscore for hvert af k-bindingsstederne (SC57,k=, SBAL, k = ). Motivkampe i begge retninger blev overvejet. Log-odds scorer mindre end 0 blev sat til 0. Ved hjælp af motivscore beregner vi den standardiserede forskel på motivscore på tværs af de to stammer som beskrevet i ovenstående afsnit (NN = ). Også, de funktioner, der bruges til træning af vores model, er en n af k-matrice af log-odds-scoringer standardiseret på tværs af hver række. Dernæst beregnede vi log2-foldforholdet for antallet af Chipsekv læser i C57BL / 6J sammenlignet med BALBc/J for at repræsentere omfanget af stammespecifik binding. Ved hjælp af denne funktionsmatrice og indstilling af log2-foldforholdet mellem binding mellem de to stammer som den afhængige variabel trænede vi vægte for hvert motiv ved hjælp af lineær regression som implementeret af scikit-learn Python-pakken. Motivvægte vist i vores Analyse er middelværdierne på tværs af fem runder af krydsvalidering ved hjælp af 80% af dataene til træning og 20% til test i hver runde. Forudsigelser for stammespecifik binding kan foretages ved hjælp af de beregnede vægte efter proceduren i det foregående afsnit.

Chipprotokol

protein A og G Dynabeads 50/50 blanding fra Invitrogen sagsøges for ChIP (10001d, 10003d). IP-blanding består af 20 liter perler/2 liter antistof pr.2 millioner Cellechip. Antistoffer mod AP-1-familiemedlemmer blev valgt til målretning af ikke-konserverede regioner for at minimere potentialet for ikke-specifik binding. Antistoffer er anført i supplerende tabel 3. Til fremstilling blev perler vasket med 2 liter 0,5% BSA–PBS, derefter blev perler–antistof inkuberet med 0,5% BSA–PBS i mindst 1 time på rotator (4 liter C). Vask 2 liter med 0.5% BSA-PBS, derefter resuspenderet i fortyndingsbuffer (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1 liter proteasehæmmere). Dobbelt tværbinding til ChIP: medier blev dekanteret fra celler i 10 cm plader, vask en gang kort med PBS (RT). Disuccinimidylglutarat (Pierce Cat # 20593) (fortyndet i DMSO ved 200 mM)/PBS (RT) blev brugt i 10 minutter. Derefter blev formaldehyd tilsat til en slutkoncentration på 1% i yderligere 10 minutter. Reaktionen blev slukket med 1: 10 1 M Tris pH 7,4 på is. Celler blev opsamlet og vasket to gange med kolde PBS, spinding ved 1000 liter g i 5 minutter. Kerneisolering og sonikering: Resuspend cellepiller i 1 mL kerneisoleringsbuffer (50 mM Tris–pH 8,0, 60 mM KCl, 0,5% NP40) + PI og inkuberes på is i 10 minutter. Centrifuge 2000 liter g i 3 minutter ved 4 liter C. Resuspend kerner i 200 liter frisk lysis buffer (0,5% SDS, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 50 mM Tris–HCl (pH 8)) + PI. Sonikering: kerner blev derefter sonikeret (10 millioner celler) i 25 minutter i en Biorupter (indstillinger = 30 s = On, 30 s = Off, Medium) ved hjælp af tynde vægrør (Diagenode Cat# C30010010). Efter sonikering spin maks. hastighed i 10 min ved 4 liter C. ChIP oprettet: Sonikeret DNA blev fortyndet 5 liter med 800 Fortyndingsbuffer (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1 liter proteasehæmmere). En alikvot fjernes for inputprøver (5%). Prøver på ved 4 liter C under rotation. Vask: ChIP vaskes 1 liter med TSE i (20 mM Tris–HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton * -100, 2 mM EDTA), 2 liter med TSE III (10 mM Tris–HCl pH 7,4, 250 mM LiCl, 1% IGEPAL, 1% deoksicholat, 1 mM EDTA), 1 liter med TE + 0,1% Triton * -100, overføres til nyt rør og derefter vask en anden gang med te + 0,1% Triton h-100. Eluering: Elute med 200 liter elueringsbuffer (1% SDS, 10 mM Tris pH 7,5) i 20 minutter ved RT, rystning på hvirvlen eller en nutator eller rotator. De-tværbinding: tilsæt 10 liter på 5 M NaCl og inkuber på ved 65 liter C (eller mindst 8 timer). Ryd op prøver ved hjælp af ChIP DNA Clean og koncentrator. Elute i 100 kr. Tag 40 liter og fortsæt til bibliotekets forberedelsesprotokol.

Polya RNA isolation og fragmentering

RNA isolation: RNA blev isoleret ved hjælp af Trisol-reagens (Ambion cat# 15596018) og direkte RNA mini-prep kit (cat# 11-330mb). Poly-A RNA-isolering: brug 0.2 Total RNA som udgangsmateriale for ideel kortlægningseffektivitet og minimal klonalitet. Indsamle 10 liter oligo (dT) (Neb cat# S1419S) perler pr. Perler blev vasket to gange med 1 liter DTBB (20 mM Tris–HCl pH 7,5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA, 1% LDS, 0,1% Triton * 100). Perler blev resuspenderet i 50 liter af 2 liter DTBB. 50 liter perler blev blandet med 50 liter RNA og opvarmet til 65 liter C i 2 minutter. RNA-perler blev derefter inkuberet i 10 minutter ved RT under rotation. RNA-perler blev derefter opsamlet på en magnet og vasket 1 liter hver med RNA VB1 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,12 m LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% LDS, 0.1% Triton 100) og vægt 3 (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 m LiCl, 1 mM EDTA). Tilsæt 50 liter Tris-HCl pH 7,5 og opvarm til 80 liter C i 2 minutter for at elute. Indsamle RNA og udføre en anden Oligo-dt perle samling. Efter vask af den anden samling var i stedet for at elutere 1 liter med 1 liter første strengbuffer; 250 mM Tris–HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCL2 (ThermoFisher SSIII kit Cat# 18080093). Fragmentering: tilsæt derefter 10 liter af 2 liter første strengbuffer plus 10 mM DTT og fragment DNA ved 94 liter C i 9 minutter. Saml perler på magnet og overfør eluat indeholdende fragmenteret mRNA til en ny PCR-strimmel. Skal genvinde 10 fragmenteret RNA. Første streng syntese: Vi blandet fragmenteret RNA med 0,5 µL tilfældig primer (3 µg/µL) Liv Tech #48190-011, 0.5 µL oligo-dT (50 µM fra SSIII kit), 1 µL dntp ‘ er (10 mM Liv Tech, kat 18427088) og 0,5 µL SUPERase-I (ThermoFisher Cat#AM2696) og varmen 50 °C i 1 min. Placer straks på is. Vi har så tilføjet 5.8 µL ddH2O, 0.1 µL actinomycin (2 µg/µL Sigma cat#A1410), 1 µL DTT (100 mM Liv Tech cat# P2325), 0.2 µL 1% Tween og 0,5 µL Hævet III og inkuber 25 °C i 10 min, derefter 50 °C til 50 min. Perle rydde op: Vi tilføjede 36 liter RNAClean (Ampure) og blandede, inkuberede i 15 minutter på is. Perlerne blev derefter opsamlet på en magnet og vasket 2 liter med 75% ethanol. Perlerne blev derefter lufttørret i 10 minutter og elueret med 10-fri H2O. anden streng syntese. 10 µL af cDNA/RNA var blandet med 1,5 µL 10× Blå Buffer (Enzymatics cat# B0110L), 1 µL dUTP/dNTP-mix (10 mM Affymetrix cat# 77330), 0.1 µL dUTP (100 mM Affymetrix cat# 77206), 0.2 µL RNase H (5 U/µL Enzymatics cat# Y9220L), 1 µL DNA-polymerase jeg (10 U/µL Enzymatics cat#P7050L), 0.15 µL 1% Tween-20 og 1.05 vand uden nuclease. Reaktionen blev inkuberet ved 16 liter C i 2,5 timer. rensning af perler: DNA blev oprenset ved tilsætning af 1 liter Seradyn 3 EDAC-Hastighedsperler (Thermo 6515-2105-050250) pr.reaktion i 28 liter 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% endelig koncentration) og inkubering ved RT i 10 min. Perler blev derefter opsamlet på en magnet og vasket 2 liter med 80% ethanol. Perler blev lufttørret i 10 minutter og elueret i 40 liter nuklease-frit vand. DNA er klar til biblioteksforberedelse.

Library prep protocol

dsDNA end repair: vi blandede 40 liter DNA fra ChIP-eller RNA-protokoller med 2,9 liter H2O, 0.5 µL 1% Tween-20, 5 µL 10× T4 ligase buffer (Enzymatics cat# L6030-HC-L), 1 µL dNTP-mix (10 mM Affymetrix 77119), 0.3 µL T4 DNA-pol (Enzymatics P7080L), 0.3 µL T4 PNK (Enzymatics Y9040L), 0.06 µL Klenow (Enzymatics P7060L) og inkuberes i 30 minutter ved 20 °C. 1 µL Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) i 93 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% endelig) blev tilsat, og inkuberes i 10 min. Perle oprydning: perler blev opsamlet på en magnet og vasket 2 liter med 80% ethanol. Perler blev lufttørret i 10 minutter og derefter elueret i 15 liter ddh2o. da-hale. DNA blev blandet med 10.8 µL ddH2O, med 0,3 µL 1% Tween-20, 3 µL Blå Buffer (Enzymatics cat# B0110L), 0.6 µL dATP (10 mM Tech 10216-018), 0.3 µL Klenow 3-5 Exo (Enzymatics P7010-LC-L) og inkuberes i 30 minutter ved 37 °C. 55.8 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% endelig) blev tilføjet en inkuberes i 10 min. Så perle rydde op blev gjort. Perler blev elueret i 14 liter. Y-form adapter ligering. Prøven blev blandet med 0,5 liter af en bioo stregkodeadapter (BIOO Scientific cat# 514104), 15 liter hurtig Ligeringsbuffer (l603-LC-L), 0,33 liter 1% mellem 20 og 0.5 l6030-HC-L) og inkuberet i 15 min ved RT. 7 LR på 20% PEG8000/2,5 M NaCl blev tilsat og inkuberet i 10 min ved RT. Perlerensning blev udført, og perler blev elueret i 21 LR. 10 liter blev derefter anvendt til PCR-amplifikation (14 cyklusser) med IGA-og IGB-primere (aatgatacggcgaccaccga, CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

Gro-sek

Nascent transkription blev fanget af global nuclear run-on sekventering (GRO-sek). Kerner blev isoleret fra Tgem ‘ er ved anvendelse af hypotonisk lysis (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 3 mM CaCl2; 0.1% IGEPAL CA-630) og flash frosset i Gro-frysebuffer (50 mM Tris–HCl (pH 7,8), 5 mM MgCL2, 40% Glycerol). Run-on. 3-5 liter 106 bmdm-kerner blev kørt på med BrUTP-mærket NTPs med 3 liter Nro–buffer (15 mM Tris-Cl (pH 8,0), 7,5 mM MgCl2, 1,5 mM DTT, 450 mM KCl, 0,3 U/liter SUPERase In, 1,5% Sarkosyl, 366 liter ATP, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) og 1,2 liter CTP (Roche, at begrænse run-on længde til ~40 nukleotider)). Reaktionerne blev stoppet efter 5 minutter ved tilsætning af 500 LS-reagens (Invitrogen), hvirvlet i 5 minutter og RNA ekstraheret og udfældet som beskrevet af producenten. RNA-pellets blev resuspenderet i 18 liter ddh2o + 0,05% mellem (dH2O + T) og 2 liter–fragmenteringsblanding (100 mm ncl2, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)), derefter inkuberet ved 70 liter C i 15 minutter. Fragmentering blev stoppet ved tilsætning af 2,5 liter på 100 mM EDTA. BrdU berigelse. Brdu-berigelse blev udført under anvendelse af BrdU-antistof (Iib5) og AC-perler (Santa Cruce, sc-32323 AC, lot #A0215 og #C1716). Perler blev vasket en gang med GRO-bindingsbuffer (0,25 liter saltvand-natrium-phosphat-EDTA-buffer (SSPE), 0,05% (vol/vol) mellem, 37,5 mM NaCl, 1 mM EDTA) + 300 mM NaCl efterfulgt af tre vaske i GRO-bindingsbuffer og resuspenderet som 25% (vol/vol) opslæmning med 0,1 U/pristl SUPERase-in. For at fragmentere RNA blev der tilsat 50-kold gro-bindingsbuffer og 40-ækvilibrerede BrdU-antistofperler, og prøverne roterede langsomt ved 4-C i 80 minutter. Perler blev efterfølgende spundet ned ved 1000 liter g i 15 s, supernatant fjernet og perlerne overført til en Millipore Ultrafree MC kolonne (UFC30HVNB; Millipore) i 2 liter 200 liter gro bindende buffer. IP-reaktionen blev vasket to gange med 400 gro-bindingsbuffer, før RNA blev elueret ved inkubation i 200 ls (Termofisher) under blid omrøring i 3 minutter. Elueringen blev gentaget en anden gang, 120 liter dH2O + T tilsat for at øge supernatanten og ekstraheret som beskrevet af producenten. Slutreparation og decapping: til slutreparation og decapping blev RNA-pellets opløst i 8 liter tet (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05% mellem 20) ved kraftig hvirvel, opvarmet til 70 liter C i 2 minutter og anbragt på is. Efter en hurtig tur, 22 µL Reparere master mix (3 µL 10× PNK buffer, 15.5 µL dH2O + T, 0.5 µL SUPERase-I RNase-Hæmmer (10 U), 2 µL PNK (20U), 1 µL RppH (5U)) blev tilføjet, blandet og inkuberes ved 37 °C i 1 time. At phosphorylate den 5’end, 0.5 µL 100 mM ATP blev efterfølgende tilføjet, og de reaktioner, der blev ruget i en anden 45 min ved 37 °C (høj-ATP-koncentrationen slukker RppH aktivitet). Efter slutreparation blev der tilsat 2,5 liter 50 mM EDTA, reaktioner blandet og derefter opvarmet til 70 liter C i 2 minutter, før de blev anbragt på is. En anden BrdU-berigelse blev udført som beskrevet ovenfor. RNA-pellets blev opløst i 2,75 liter TET + 0,25 liter 3 ‘ Adapter (10 liter), opvarmet til 70 liter C i 2 minutter og anbragt på is. 7 af 3’master mix (4.75 µL 50% PEG8000, 1 µL 10× T4 RNA-ligase buffer, 0.25 µL SUPERase-I, 1 µL T4 RNA-Ligase 2 afkortet (200U; NEB)) blev tilføjet, blandet godt og reaktioner inkuberes ved 20 °C i 1 time. Reaktioner blev fortyndet ved tilsætning af 10 µL TET + 2 µL 50 mM EDTA, der er opvarmet til 70 °C i 2 min., placeret på isen, og en tredje runde af BrUTP berigelse blev udført. RNA-pellets blev overført til PCR-strimler under 75% ethanolvask og tørret. Prøverne blev opløst i 4 liter tet (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 0,05% mellem 20) + 1 liter 10 liter revers transkription (RT) primer. For at annealere RTprimer blev blandingen inkuberet ved 75 liter C i 5 minutter, 37 liter C i 15 minutter og 25 liter C i 10 minutter. At ligate 5’ Illumina TruSeq adapter, 10 µL 5’master mix (1.5 µL dH2O + 0.2% Tween 20, 0.25 µL denaturated 5’TruSeq adapter (10 µM), 1.5 µL 10× T4 RNA-ligase buffer, 0.25 µL SUPERase-I, 0.2 µL 10 mM ATP, 5.8 µL 50% PEG8000, 0.5 µL T4 RNA-ligase 1 (5U; NEB)) er tilføjet, og reaktioner blev inkuberet ved 25 °C i 1 time. Reverse transkription blev udført ved hjælp af Protoscript II (NEB) (4 µL 5× NEB FirstStrand buffer (NEB; E7421AA), 0.25 µL SUPERase-I, 0.75 µL Protoscript II (150U; NEB)) ved 50 °C i 1 time. Efter tilsætning af 30 µL PCR master mix (25 µL 2× LongAmp Taq-2 X Master Mix (NEB), 0.2 µL 100 µM frem primer, 2.8 µL 5 M betain og 2 µL 10 µM enkelte stregkodesystem primer), blandinger blev forstærket (95 °C i 3 min., (95 °C til 60 s, 62 °C til 30 s, 72 °C i 15 s) x13, 72 °C i 3 min). PCR-reaktioner blev ryddet op ved hjælp af 1,5 volumener SpeedBeads (GE Healthcare) i 2,5 M NaCl/20% PEG8000. Biblioteker blev valgt i størrelse på side / TBE geler til 160-225 basepar. Gelskiver blev makuleret ved at dreje gennem et 0,5 mL perforeret PCR-rør anbragt oven på et 1,5 mL rør. Der blev tilsat 150 liter gel EB (0,1% LDS, 1 M LiCl, 10 mM Tris–HCl (pH 7,8)), og opslæmningen inkuberes under omrøring natten over. For at rense det eluerede DNA blev 700 DNA-bindingsbuffer tilsat til 1,5 mL-røret indeholdende den strimlede gelskive og gelen EB, blandet ved pipettering og opslæmningen overført til en kolonne. Prøver blev først spundet ved 1000 liter g i 3 minutter, derefter 10.000 liter g i 30 sekunder. Gennemstrømningen blev fjernet, og prøverne blev vasket med 200 liter vand (med EtOH). Gelrester blev fjernet ved flicking og kolonner vasket ved tilsætning af en anden 200 liter vaskebuffer (med EtOH). Gennemstrømning blev fjernet, søjler spundet tørre ved centrifugering ved 14.000 liter g i 1 min og DNA elueret ved tilsætning af 20 liter forvarmet sekventering TET (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 0,05% mellem 20). Biblioteker blev sekventeret.

vestlige blotting

celler blev lyseret med Igepal lysis buffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0.5% Igepal) og proteinkoncentrationer blev bestemt med BioRad-proteinassayreagens under anvendelse af BSA som standard. Proteiner blev adskilt på NuPage 4-12% bis-Tris gradientgeler (Invitrogen) og overført til en nitrocellulosemembran (Amersham). Membraner blev blokeret i TBS med 0,1% mellem 20 og 5% BSA. Membraner blev blottet med den indikerede primære natten over ved 4 C. peberrod peroksidase-konjugerede sekundære antistoffer blev påvist ved anvendelse af ECL plus vestlige blotting detection system (Amersham).

dyr og cellekultur

Tgem ‘ er blev opsamlet 3 dage efter injektion fra mandlige 8-ugers C57BL/6J eller BALB / cJ–mus og belagt med 20 liter 106 celler pr.15 cm petriskål i DMEM plus 10% FBS og 1 liter penicillin-streptomycin. En dag efter plettering blev cellerne suppleret med friske medier og behandlet med PBS (Veh) eller 100 ng/mL KLA i 1 time og derefter direkte anvendt til nedstrømsanalyser. iBMDM produceres ved infektion af BMDM med et retrovirus indeholdende myc og Braf V600E66. De udødelige celler dyrkes derefter over flere uger. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de etiske standarder, der er fastsat af University of California, San Diego Institutional Annual Care and Use Committee (Iucac).

lentivirusproduktion

pLentiguide blev modificeret til at indeholde et U6-bsmbi-spgRNA stillads og en CMV-promotor, der kører tagBFP2. 2 CRISPR-guider blev indsat for hvert mål via PCR-amplifikation med H1-promotoren (bsmbi-sted/guide1/stillads/H1-promotor/guide 2/bsmb1-sted) for i alt 2 guider pr.virus (U6 og H1-drevet) (supplerende Tabel 4). Virus blev lavet med pVSVg / ppaks2 system. To dage efter transfektion blev medier opsamlet og centrifugeret ved 4 liter C i 2 timer ved 20.000 liter g. Cellepellet blev rekonstitueret natten over ved 4 liter C i OPTI-MEM og opbevaret ved -80 liter C.

produktion af CRISPR KO iBMDMs

KO iBMDMs blev produceret ved anvendelse af lentiviral infektion. iBMDM-CAS9-IRES-EGFP blev inficeret med MOI 100, målt på 293t celler, med Lentiblast (OSE biosciences) (5 liter hvert reagens) i OPTI-mem. Dette blev derefter centrifugeret ved 1300 g i 1 time ved stuetemperatur. Medier blev derefter fjernet, og celler blev suppleret i knoglemarvsmedier (30% L-celle, 20% FBS, 1% penicillin/streptomycin i DMEM) i 2 dage. Celler blev derefter sorteret for infektion ved ekspression af en transgen på den virale sekvens (tagBFP2).

Rapporteringsoversigt

yderligere oplysninger om eksperimentelt design findes i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.

tilgængelighed af kode