grænser i farmakologi

introduktion

membranproteiner deltager i grundlæggende fysiologiske begivenheder i ethvert biologisk system fra bakterier til mennesker. >50% af markedsførte lægemidler er målrettet mod membranproteiner, mens den farmakologiske målretning af mange andre membranproteiner betragtes som potentielt gavnlig i adskillige biomedicinske anvendelser (overington et al., 2006; y L. R. L. R. L. R. et Al., 2007; Arinaminpathy et al., 2009). Imidlertid forbliver de molekylære mekanismer, der ligger til grund for deres funktion og regulering, stort set ukendte på grund af manglen på strukturel information. Mens membranproteiner tegner sig for ~26% af det humane proteom, repræsenterer deres strukturer kun 2% af strukturerne i Proteindatabanken (Fagerberg et al., 2010; Pandey et al., 2016). Flere forhindringer hæmmer den strukturelle undersøgelse af membranproteiner, der kræver udvikling af avancerede teknologier til belysning af deres molekylære arkitekturer (Pandey et al., 2016; Masson et al., 2017; Hagn et al., 2018; Ravula og Ramamoorthy, 2019; Redhair et al., 2019). De største hindringer er, at deres overekspression og oprensning og strukturelle undersøgelser ved de fleste teknikker (f.eks. røntgenkrystallografi) forbliver begrænsede i mange tilfælde. Disse hindringer hæmmer følgelig den rationelle udvikling af lægemiddelkandidater rettet mod sygdomsrelaterede membranproteiner (Vinothkumar og Henderson, 2010; Lounnas et al., 2013; Marciano et al., 2014).

sekundære transportører er membranbundne proteiner, der selektivt katalyserer bevægelsen af dårligt permeable opløste stoffer (f. eks. neurotransmittere, lægemidler) på tværs af cellemembranen, der understøtter forskellige cellulære funktioner i sundhed og sygdom. Sekundære transportører overholder det alternerende adgangsparadigme, ifølge hvilket den proteinligandbindende lomme bliver alternativt tilgængelig på modsatte sider af membranen ved at vedtage de indadvendte (IF) og udadvendte (OF) tilstande i rækkefølge (Jardetsky, 1966; Forrest et al., 2011). Nylige gennembrud i membranproteins strukturelle biologi gav et væld af strukturer af membranbundne transportører i forskellige konformationstilstande (trak og Boudker, 2016; Bai et al., 2017), der giver indsigt i deres transport-og løsningsgenkendelsesmekanismer. De giver dog statiske snapshots af en iboende multi-trins proces (Seeger, 2018). Der er således et voksende behov for at udvikle nye tilgange til at undersøge membranproteindynamik (Konermann et al., 2011; Smith et al., 2012; Sim et al., 2017; Mandala et al., 2018; Burke, 2019). Disse omfatter en kombination af molekylær dynamik (MD) simuleringer., 2011; Tdravkovic et al., 2012; Jekova et al., 2016; Jekova et al., 2017; Harpole og Delemotte, 2018) med avancerede eksperimentelle teknikker, herunder spektroskopiske teknikker og enkeltpartikelkryogen elektronmikroskopi (Smith et al., 2012; Pandey et al., 2016; Castell et al., 2018; Hagn et al., 2018; Ravula og Ramamoorthy, 2019; Sun and Gennis, 2019).

Hydrogen-deuterium udveksling massespektrometri (HDK-MS) fik opmærksomhed i de senere år for at studere membranproteindynamik, selvom det har været brugt i årtier til at karakterisere opløselige proteiner (Konermann et al., 2011; Vadas et al., 2017). Ms overvåger tidsafhængig udveksling af opløsningsmiddel D2O med proteiner backbone amidhydrogener under native forhold. Deuterium-valutakursen afhænger af opløsningsmiddeltilgængelighed, sekundær struktur og strukturel stivhed (Konermann et al., 2011). Kombineret med proteolytisk fordøjelse og peptidseparation tillader HDK-MS kvantificering af valutakurser i korte proteinsegmenter op til opløsning af en enkelt rest. To store fordele ved HDK-MS er, at små proteinmængder (< 0,1 mg) er nødvendige til analyse, og at kemisk proteinmærkning ikke er påkrævet, idet man undgår uønskede strukturelle forstyrrelser. Her opsummerer vi de seneste fremskridt og applikationer i brugen af HD-MS til at studere transportørernes strukturelle dynamik.

Hydrogen-Deuterium udveksling massespektrometri principper

HDK-MS principper er kort og kvalitativt beskrevet nedenfor for at muliggøre en diskussion af dens anvendelser til undersøgelse af transportører. For dybdegående forklaringer er der flere fremragende gennemgangsartikler tilgængelige (Konermann et al., 2011; Rand et al., 2014; engen og Danmark, 2015; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019).deuterium udveksler med labile proteinhydrogener på en tidsafhængig måde efter proteinfortynding i en D2O-buffer (Masson et al., 2017) (Figur 1). I) ved neutral pH udveksles de i hastigheder, der kan detekteres ved hjælp af HDK-MS (sekunder til dage) og ii) deres udveksling kan effektivt slukkes (Marcsisin og Engen, 2010; Gallagher og Hudgens, 2016). Hastigheden afhænger af flere parametre. Amidhydrogener kan udvise en “lukket tilstand”, der stammer fra deltagelse i stabile hydrogenbindinger i sekundære strukturer eller fra opløsningsmiddel utilgængelighed, som ikke tillader deres udveksling med opløsningsmiddel deuterium eller en” åben tilstand”, hvor protonabstraktion, det hastighedsbegrænsende trin af HDKS, kan forekomme (Oganesyan et al., 2018). Derudover har reaktionen en iboende kemisk hastighedskonstant, som afhænger af pH, temperatur og restmiljøet (Oganesyan et al., 2018).

overgangen mellem de lukkede og åbne tilstande sker ved lokale udfoldelseshændelser. Under indfødte forhold, hvor proteiner er godt foldet, afhænger HDK-hastigheden hovedsageligt af overgangshastigheden tilbage til lukket tilstand (ve et al., 2006). Hvis den udfoldede proteinregion vender tilbage til den lukkede tilstand med en hastighed, der er meget langsommere end den kemiske valutakurs, observeres EKS1-kinetik, hvilket resulterer i korreleret deuteriumoptagelse i tilstødende rester. Dette resulterer i to populationer: en med lav m/å og en med en høj m/å, der afspejler peptider fra proteinmolekyler, der ikke har, og som har gennemgået udveksling, henholdsvis. Med tiden bliver den høje m/å-befolkning mere fremtrædende på bekostning af den lave m/å-befolkning. EKS1-kinetik betragtes som sjælden i foldede proteiner under native betingelser, men kan for eksempel induceres ved tilsætning af denatureringsmidler., 2006; Oganesyan et al., 2018). Hvis proteinet vender tilbage til lukket tilstand med en hastighed, der er meget hurtigere end den kemiske valutakurs, observeres EKS2-kinetik. Her afhænger udvekslingen af overgangen af individuelle rester mellem åben og lukket tilstand, der forekommer på en ukorreleret måde. Således observeres med tiden en enkelt population med gradvist stigende m / å-værdier (ve et al., 2006).

efter deuteration slukkes reaktionen ved foruddefinerede tidspunkter ved at ændre pH fra neutral (7) til pHmin (2,5-3), hvilket resulterer i ~10.000 gange reduktion i HDK (Konermann et al., 2011; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018); og ved at reducere temperaturen fra 25 til 0 liter C, hvilket fører til ~14 gange fald i HDK (Englander, 2006; Oganesyan et al., 2018). Dernæst fordøjes proteinet under anvendelse af en protease, og peptiderne adskilles ved anvendelse af analytisk reversfasekromatografi. I øjeblikket ligger den største tekniske flaskehals i HDK-MS-eksperimenter i at opnå en høj sekvensdækning, som er begrænset af modstanden mod fordøjelsessymer og af proteolytiske tilstande. Endelig identificeres eluerede peptider ved anvendelse af MS, og graden af HDK beregnes ud fra de opnåede m/å-værdier. De eksperimentelle detaljer og faldgruber ved proteinfordøjelse, peptidseparation og MS-identifikation er uden for rammerne af denne gennemgang (Konermann et al., 2011; Masson et al., 2017; Masson et al., 2019).

Hydrogen-Deuterium-Udvekslingsmassespektrometri-undersøgelser af membranproteiner

På trods af deling af det skiftende adgangsparadigme er ligandinducerede konformationsændringer forskellige mellem transportører på grund af forskelle i ligand-protein-interaktioner. For eksempel kan symportere (co-transport af to eller flere ligander) overgå mellem IF og af tilstande uden bundne ligander, hvorimod ligandbinding er obligatorisk for at bytte mellem IF og af tilstande i antiporter (udveksling af ligander på modsatte sider af membranen) (Forrest et al., 2011; Henning og Boudker, 2016; Bai et al., 2017).

generelt er det vanskeligt at detektere lokale ligandinducerede dynamiske ændringer i proteiner. For eksempel er krystalstrukturerne af membranproteiner i både de ligandfrie og ligandbundne former ofte utilgængelige, hvilket udelukker påvisning af ligandinducerede konformationsændringer selv for proteiner med kendte strukturer. Desuden kan strukturelle snapshots med høj opløsning af apo-og ligandbundne tilstande muligvis ikke løse væsentlige konformationsforskelle. Imidlertid kan små ligandinducerede konformationsændringer detekteres ved hjælp af HDK-MS ved specifikke proteinunderdomæner under native betingelser ved at måle differential deuteriumoptagelsen i nærvær og fravær af ligander. Denne evne giver unikke muligheder for at løse de mest udfordrende problemer med at belyse mekanismerne for ligand-protein og protein-protein interaktioner (Rand et al., 2014; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019), som gennemgået her for en række nyligt undersøgte transportproteiner.

Konformationsovergange underliggende alternerende adgang: Na+ / H + Antiporter

Nha-proteiner regulerer cellulær pH, og volumen gennem livets kongeriger (Padan og Landau , 2016). Den vigtigste strukturelle model, der bruges til at studere Nha-ortologer, er Escherichia coli NhaA, for hvilken en krystallografisk struktur af den inaktive tilstand ved sur pH er tilgængelig (Hunte et al., 2005). For at studere den strukturelle dynamik af NhaA under fysiologisk pH blev HDK-MS for nylig anvendt (Eisinger et al., 2017). Afgørende for den indsigt, der er opnået i denne undersøgelse, giver HD-MS globale dynamiske data i modsætning til metoder baseret på stedsspecifik mærkning, som kun registrerer bevægelser af foruddefinerede proteinregioner.

i denne undersøgelse blev der opnået en usædvanlig høj sekvensdækning på 88,5% for NhaA i vaskemiddel, hvilket gav indsigt i den mekanisme, der ligger til grund for vekslende Adgang ved ligandbinding. Ved at sammenligne HDK-mønstrene mellem apo-og substratbundet Nha blev der observeret et tilbagevendende mønster af HDK-ændring i flere spiraler, hvor øget deuteriumoptagelse i den ene terminal blev ledsaget af nedsat deuteriumoptagelse ved den anden terminal. Optagelsen i midten af spiralerne var stort set uændret.

baseret på det observerede mønster af HDK-ændring, selvom det ikke direkte tilvejebringer rumlig information, blev det foreslået, at Oversættelse af transmembranhelices i forhold til membranen forekommer, som afspejlet i de gensidige HDK-ændringer observeret for de to terminier inden for specifikke transmembranhelices. Denne model er i overensstemmelse med den” elevatorlignende ” mekanisme for vekslende adgang, hvilket indebærer en lodret oversættelse af transmembranhelices under transportcyklussen (Ryan og Vandenberg, 2016). Kort sagt, HD-MS gav ny indsigt i de strukturelle overgange, der var involveret i skiftende adgang, uopnåelig af de tidligere opløste strukturer i den inaktive nhaa.

effekt af protein-Lipidinteraktioner på transportørernes Konformationslandskaber

de fleste sekundære transportører hører til major facilitator superfamilie (MFS), der deler en konserveret arkitektur på trods af deres forskellige funktioner (Radestock og Forrest, 2011). Selvom MFS-medlemmernes krystalstrukturer er tilgængelige, de gav kun lidt information om protein-lipidinteraktioner og deres virkning på ligevægten mellem AF-og IF-staterne. Således Martens et al. for at undersøge virkningerne af lipidmiljøet på tre velkarakteriserede transportører: laktosepermease, ksylosetransportør og glycerol-3-phosphat antiporter (Martens et al., 2018).

først blev en mutation, der vides at skifte ligevægten mod OF-state, introduceret ved den ekstracellulære vestibule for alle transportører (Kumar et al., 2014). Når man sammenligner vægt og muterede transportører ved hjælp af HDK-MS, afsløres det, at metoden detekterer konformationsændringen, hvor regioner på den ekstracellulære vestibule optager mere deuterium i mutanterne vs. vægt, hvorimod det modsatte forekommer for rester ved den intracellulære vestibule. Derefter blev transportørerne rekonstitueret til nanodisk sammensat af phosphatidylglycerol, tetraoleyl cardiolipin og enten phosphatidylcholin eller phosphatidylethanolamin. Interessant nok skiftede tilstedeværelsen af phosphatidylethanolamin ligevægten mod IF-tilstanden. Derefter forudsagde MD-simuleringer af transportørerne i lipid-dobbeltlag, der var identiske med nanodiskernes sammensætning, direkte interaktioner mellem den ladede phosphatidylethanolaminhovedgruppe og et konserveret cytoplasmatisk netværk af ladede rester, der stabiliserede af tilstand (Doki et al., 2013). Mutering af de ladede rester afskaffede virkningen af phosphatidylethanolamin, hvilket kraftigt antyder, at specifikke phosphatidylethanolamin-proteininteraktioner styrer transportørernes indre ligevægt. Denne undersøgelse er et skarpt eksempel på at kombinere eksperimentelle og beregningsmetoder for at identificere subtile, men funktionelt signifikante protein-lipidinteraktioner.

Spiralafvikling under Transport: undersøgelser af LeuT

LeuT er en prokaryot homolog af neurotransmitter / Na+ symporters (NSS) familie, som inkluderer vigtige lægemiddelmål såsom serotonin, dopamin og noradrenalin transportører (Kristensen et al., 2011). LeuT blev grundigt undersøgt, og dets krystallografiske strukturer langs transportcyklussen er tilgængelige (Focke et al., 2013). Disse strukturer antydede, at der kræves store strukturelle omlægninger under skiftevis adgang (Krishnamurthy og Gouauks, 2012). Imidlertid, det konformationelle landskab, der tillader overgangen mellem IF og stater, forbliver undvigende og kontroversielt.

for at studere overgangen mellem forskellige tilstande blev vaskemiddelopløselig LeuT undersøgt under forhold, der favoriserer IF eller af stater (Merkle et al., 2018). Overraskende nok udviste mange peptider, hovedsageligt på den intracellulære side af transportøren, EKS1-kinetik. Dette er temmelig usædvanligt i foldede proteiner under native forhold og anses for at afspejle en langvarig udfoldelse af sekundære strukturelementer. Baseret på den rumlige fordeling af peptider, der udviser EKS1-kinetik, sammen med de tilgængelige krystallografiske strukturer, blev det foreslået, at specifikke helices gennemgår delvis afvikling under skiftevis adgang, og at disse konformationsændringer også bidrager til frigivelse af substrat. Denne undersøgelse fremhæver den funktionelle betydning af langsomme (sekunders tidsskala) konformationsændringer, der kan løses godt ved hjælp af HDK-MS, i modsætning til andre eksperimentelle eller beregningsmæssige (f.eks.

Hydrogen-Deuterium-Udvekslingsmassespektrometri af membranproteiner i Lipid-Nanodiske

interaktionerne mellem membranproteiner og omgivende lipider kan dramatisk modulere deres funktion (Vadas et al., 2017). Faktisk afhænger aktiviteten af eukaryote NSS-medlemmer signifikant af specifikke lipid-protein-interaktioner, der modulerer proteindynamikken og følgelig substratinteraktioner (Divito og Amara, 2009). Derfor Adhikary et al. undersøgt LeuT rekonstitueret i phospholipid dobbeltlag nanodisks (Adhikary et al., 2017). Ved hjælp af denne tilgang blev LeuT undersøgt under forhold, der favoriserer IF og konformationer. Sammenligningen mellem disse tilstande afslørede specifikke ændringer i regioner, der tidligere var impliceret i transportcyklussen, hvilket afspejler funktionelt signifikante strukturelle ændringer. Interessant nok understøttede HDK-MS-dataene i overensstemmelse med tidligere biofysiske og beregningsmæssige undersøgelser en mindre hældningsvinkel for den første transmembrane spiral i If-konformationen sammenlignet med den, der blev observeret i krystalstrukturerne. Denne forskel blev tilskrevet lipidmiljøet, da krystalstrukturen blev opnået i vaskemiddel med en lille mængde lipid. For at opsummere giver MS en fleksibel platform til at studere membranproteiner i forskellige hydrofobe miljøer og under forhold, der favoriserer specifikke konformationstilstande uden behov for stedspecifik mærkning.

Ioninteraktioner med flere steder: na+/Ca2+ – veksleren

deltager i cellulær Ca2+ homeostase ved ekstrudering af Ca2+ fra cellerne mod dens elektrokemiske gradient (Blaustein og Lederer, 1999). 3NA+: 1ca2+, hvor Na+ og Ca2 + transporteres i separate trin (Khananshvili, 1990). Det er en af de mest almindelige typer af ionbindingssteder, der er optaget af tre Na+ ioner på steder betegnet Sint, Smid, sekst og en Ca2+ ion på et sted betegnet SCa (Liao et al., 2012). Da denne bindingstilstand var uforenelig med tidligere undersøgelser, MD-simuleringer og ionstrømsanalyser af mutanter blev udført, hvilket antyder, at Na+ ioner optager Sint, SCa og sekst, mens Ca2+ optager SCa (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016b; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Således er Na+ – og Ca2+ – ionerne bundet på en gensidigt eksklusiv måde langs transportcyklussen.for at etablere tildelingen af ionbindingssteder sammenlignede vi apo-tilstanden med de ionbundne tilstande af Nck_mj ved hjælp af HDK-MS (Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017). På trods af lav sekvensdækning omfattede vores Analyse 10 ud af 12 ionkoordinerende rester. Vi opdagede et Na + – afhængigt fald i deuteriumoptagelse ved Sint, SCa og sekst, men ikke Smid, hvorimod i nærvær af Ca2+ blev faldet i deuteriumoptagelse hovedsageligt observeret ved SCa. Dette er i overensstemmelse med forudsigelserne fra MD-simuleringer og mutationsanalyser, der forudser besættelsen af Smid af et vandmolekyle, men ikke af Na+ eller Ca2+ i jordtilstand (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Især har efterfølgende krystallografiske undersøgelser valideret vores bindingssteders opgave (Liao et al., 2016). Således bekræftede HDK-MS ionbindingsmodus foreslået af beregnings-og funktionelle undersøgelser.

Ionselektivitet af en Li+-transporterende Mutant

mitokondrie na+ / Ca2+ – veksleren (NC) udviser ekstraordinær ionselektivitet og udveksler Ca2+ med enten Na+ eller Li+, mens Nc ‘ er ikke transporterer Li+ (Palty et al., 2010). Selvom den fysiologiske relevans af denne ionselektivitet forbliver forvirrende, er det bemærkelsesværdigt, at 9 (ud af 12) ionkoordinerende rester i NC ‘er adskiller sig fra dem i Nc’ er og andre medlemmer af Ca2+/kation antiporter superfamilien. For at forstå, hvordan disse forskelle påvirker ionbindingsgenkendelse og transport, udførte vi strukturbaseret udskiftning af ionkoordinerende rester i NC., 2016). Påfaldende nok formidler den nydesignede konstruktion Na+ / Ca2 + og Li+/Ca2+ med sammenlignelige Km-værdier (Refaeli et al., 2016).

dernæst forsøgte vi at afgøre, om ionbindingsstederne i Nc ‘er minder om dem fra Nc’ er (Giladi et al., 2019). Det viste sig, at SCa binder Na+, Li+ eller Ca2+, mens et eller flere yderligere Na+/Li+ – steder af Nc er uforenelige med de oprindelige na+ – steder (sekst og Sint), der er tildelt Ncc_mj. Disse resultater antydede, at Nc kan transportere ioner med en elektroneutral støkiometri på 2Na+:1ca2+ eller 2LI+:1ca2+. Spænding fastspænding accelererer na+/Ca2+ valutakurser i NCK-rekonstituerede proteoliposomer (på grund af en støkiometri på 3Na+:1Ca2+), mens det ikke har nogen mærkbar effekt på Na+/Ca2+ eller Li+/Ca2+ valutakurserne i Ncl_mj (Giladi et al., 2019).

vores undersøgelser har vist nytten af HDK-MS til identifikation og validering af bindingssteder i iontransportører, hvor relativt små forskelle i de ioninducerede signaler giver vigtig information om ionselektivitet og konformationsændringer, der forekommer ved ionbinding på forskellige steder. Kombineret med MD-simuleringer og røntgenkrystallografi er HDK-MS særligt tiltalende for at belyse de strukturelle determinanter for ionselektivitet og ioninducerede konformationsændringer i iontransportsystemer, der omfatter flere ionbindingssteder.

konklusioner

i løbet af de sidste årtier har strukturbiologi enormt bidraget til vores forståelse af membranproteinfunktion, hovedsageligt ved at give statiske snapshots af diskrete tilstande i høj opløsning. For fuldt ud at dechiffrere de strukturfunktionsforhold, der ligger til grund for den komplekse proces med opløst transport, er der udviklet et stigende antal eksperimentelle og beregningsmetoder for at bygge bro over kløften mellem disse statiske snapshots og bestemme de underliggende konformationelle Landskaber. MS bruges i stigende grad til at studere intakte membranproteiner under forskellige næsten native forhold, hvilket giver nye muligheder for at studere membran-protein-interaktioner, substratgenkendelse og transportrelaterede konformationsovergange. Den fremtidige udvikling inden for automatisering af instrumentering og dataanalyse kan gøre det muligt at anvende MS i høj kapacitet og fuldt ud udnytte dets potentielle anvendelse i grundforskning og biomedicinske applikationer såsom lægemiddeldesign.

Forfatterbidrag

MG og DK gennemgik litteraturen og skrev manuskriptet.

finansiering

dette arbejde blev støttet af Israel Science Foundation (Grant #1351/18) (D. K) og af Israel Cancer Research Foundation (Grant #19202) (MG). Økonomisk støtte fra Shmuel Shalit-prisen til DK er taknemmeligt anerkendt.

interessekonflikt

forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.