eksperimentel
mærkning af RuBisCo:
aedans(454): donor F(58): acceptor
bindende undersøgelser:
Vilkår:
ADP bullet: GroEL kompleks bundet til GroES og ADP
ApoGroEL: Just GroEL (anvendt i tidligere bindingsundersøgelser af RuBisCO substrat)
lin et al. bestemt, at:
1. Der var en forskel i FRET ved substratbinding til transringen af ADP-kugle vs. apoGroEL-ring.
– Dette var tydeligt ved slukning af donorfluorescens (B.)
– dette indikerede en forskel i konformation af proteinsubstratet.
 |
 |
2. Fundet en” passiv ” udfoldning af substratproteiner bundet til apoGroEL ring.
– denne udfoldelse skete imidlertid meget langsommere end Groels funktionelle reaktionscyklus.
3. Der er mindre “passiv” udfoldning af substratet bundet til ADP bullet trans-ring.
– bekræftet dette med proteasefordøjelsesundersøgelser.
– dette er dog det mere fysiologisk relevante kompleks.
– så er dette et maksimalt effektivt niveau, eller kun det første trin i reaktionscyklussen?
for at teste den fysiologiske relevans tilføjede de ATP til ADP-Kuglereaktionen og overvågede FRET
 |
ved tilsætning af ATP fandt de ud af, at der var en: – en indledende hurtig, tvungen konformationsudvidelse af substratet – og derefter en langsommere komprimeringsfase – tydeligt i figur b |
 |
 |
-figur C angiver, at komprimeringsfasens kinetik er afhængig af Groes-koncentration, hvilket betyder, at den er afhængig af
kompleksets undersøgelsesmekanisme.
– mens ekspansionsfasen er uafhængig af GroES koncentration.
konkluderede, at der er to faser af udfoldning:
– langsom passiv udfoldning på grund af substratbinding til Transring af Groelkammeret(fra første bindingseksperiment)
– Hurtig, ATP-drevet udfoldning på grund af Konformationsændringen i Groelkammeret.
Hurtig udfoldning er ikke GroES-afhængig:
– et overskud af en enkeltringet GroEL-variant, SR1 blev brugt som en GroES-fælde.
– SR1 er ude af stand til at binde substrat og katalysere en udfoldende reaktion,men er i stand til at binde og sekvestrere GroES for at bestemme afhængigheden af reaktionen på sekvestrering af substratet.
– de fastslog, at den hurtige udfoldelse, der blev overvåget af FRET, forekom uden GroES cap til stede, og den efterfølgende komprimeringsfase gjorde det ikke.
– Dette indikerer, at den hurtige ekspansionsfase er afhængig af konformationsændring af GroEL induceret af ATP-binding.
så .. er udfoldelsen af substratet nødvendig for produktiv foldning?
– er dette et vigtigt skridt, og vigtigt at GroEL / GroES foldemekanisme?
-De fandt ud af, at den brøkdel af ikke-native RuBisCo, der opstår iDen oprindelige tilstand, er proportional med omfanget af udfoldelsen.
– for at undersøge dette ønskede de at måle den langsomme , passive udfoldning af substratet på grund af Groelbinding alene(ikke ATP
afhængig)
– de brugte igen SR1-binding til substrat, denne gang ikke som atrap, men som et passivt udfoldende bindingssted for substratet.
– inkubationstid med SR1 er korreleret med mængden af udfoldning, da udfoldningen kun skyldes binding af substratet.
– de fastslog, at der er en sammenhæng mellem mængden af udfoldning til nativt protein.
– så den tvungne udfoldning af GroEL/GroES er en effektiv måde at fremme udfoldningsmekanismen
, der er nødvendig for korrekt proteinfoldning.
 |
 |
 |
 |