Handlingsmekanismer for Du-Huo-Ji-Sheng-Tang på brusknedbrydning i en Kaninmodel af slidgigt

abstrakt

Du-Huo-Ji-Sheng-Tang (DHJST) er en traditionel kinesisk urtemedicin, der bruges til behandling af slidgigt. I denne undersøgelse blev den terapeutiske virkning af DHJST på brusknedbrydning i en kaninmodel af slidgigt undersøgt. I knæledene hos kaniner blev der udført forreste korsbåndstransektion (ACLT) for at inducere eksperimentel slidgigt. I slutningen af den sjette uge blev 30 kaniner med ACLT opdelt i seks grupper, kontrolgruppe, dhjst-gruppe og osaminethacin (OSA) – gruppe, som blev fulgt i yderligere 4 uger. De andre tre grupper af kaniner med ACLT var ubehandlet med DHJST eller OSA, som blev ofret efter 6 uger og tjente som 6-ugers tidspunktkontrol. Resultaterne viste, at i slutningen af den sjette uge efter operationen var der en signifikant histologisk degeneration i kontrolgruppen sammenlignet med den normale gruppe. I kontrolgruppen var den gennemsnitlige score for histologisk degeneration yderligere stigninger ved 10.uge, og der var en signifikant lavere gennemsnitlig score for histologisk degeneration i dhjst-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen. For at undersøge den potentielle mekanisme blev ekspressionsniveauet for VEGF og HIF-1-kur påvist. Udtrykket af VEGF-mRNA og HIF-1-mRNA er lavt i normal gruppe, mens aktiviteterne øges gradvist i kontrolgruppen. Imidlertid, sammenlignet med den for samme tidspunktmodelgruppe, aktivitet af VEGF og HIF-1 kur faldt markant i dhjst-gruppen. Som konklusion udøver DHJST signifikant terapeutisk virkning på slidgigt kaniner, og mekanismer er forbundet med inhibering af VEGF og HIF-1-kurp-ekspression.

1. Introduktion

slidgigt (OA) er en progressiv og svækkende sygdom, der kan tage år at klinisk manifestere sig hos berørte personer. Aldring af brusk og aldring af chondrocytter spiller en vigtig rolle i patogenesen og udviklingen af OA. Under udviklingen af OA er der ofte en fokal stigning i celledød. Masser af rapporter afslørede, at chondrocyts aldring bidrager til risikoen for bruskdegeneration ved at mindske chondrocytternes evne til at vedligeholde og reparere ledbruskvævet . Da det teoretiseres, at hver chondrocyt er ansvarlig for vedligeholdelsen af den ekstracellulære matrice, der omgiver den, og at matricsmolekyler produceret i en region af vævet har en meget begrænset evne til at krydse vævet, kan det fokale tab af levedygtige celler være delvist ansvarlig for vævets manglende evne til at reparere mindre skader .

i øjeblikket er der ikke en kur mod OA, og tilgængelige behandlinger bremser kun sygdommens progression . I de sidste 20 år har traditionel kinesisk medicin (TCM) set betydelige fremskridt mod OA, såsom at forbedre patienternes kliniske fund, hæmme inflammatorisk reaktion og bruskdegeneration . In vivo og in vitro undersøgelse viste også, at kinesiske urter formel er af flere omfattende aktioner mod OA . En af de mest almindelige årsager til denne sygdom er, at det er en sygdom, der er forårsaget af en person, der ikke er i stand til at behandle sygdommen. Det kan forbedre kliniske symptomer, knæfunktion og livskvalitet for patienter . Baseret på vores viden om OA-patogenese i TCM undersøgte vi effekten af DHJST på forebyggelse af bruskdegeneration af OA hos kaniner og observerede dens mekanismer.

2. Metoder

2.1. Materialer

blindgyde colorimetric apoptosis detection system (TUNEL assay) blev opnået fra Nanjing Jiancheng Biotech Company (Kina). DNA-molekylær markør, SYBR-forblanding og perfekt realtidssæt blev købt fra Invitrogen Co. (USA). Herba Asari, Shanghai Huayu Chinese Herbs Co., Kina, Kina, Kina, Kina, Kina, Kina, Kina, Kina, Kina, Kina, Kina, Kina, Kina, Kina, Kina, Kina og Kina. Ltd., Kina) blev akkrediteret af en farmakognosist i henhold til standardprotokoller, udarbejdet af Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, komponenterne blev blandet i rækkefølge med forholdet mellem 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 (tørvægt) blev stofferne ekstraheret med standardmetoder i henhold til Kinesisk Pharmacopoeia (China Pharmacopoeia and Committee, 2000). Disse rå lægemidler blev gennemblødt i destilleret vand og kogt i 30 minutter to gange, og lægemiddelopløsningen blev filtreret gennem et maske, derefter blev filtratet koncentreret til 4 g mL−1 af en vakuumpumpe og derefter opbevaret ved -20 liter C indtil brug. Osaminethacin (OSA), hver tablet indeholder 25 mg indomethacin og 75 mg aminoglucose (leveret af Hebei Jishong Pharmaceutical Co. Ltd., Kina), blev brugt som positiv kontrolmedicin.

2, 2. Kaniner og Vævsforberedelse

otteogfyrre måneder gamle hvide kaniner blev leveret af Forsøgsdyrcentret til Chinese Academy of Science. Tredive kaniner gennemgik ensidig forreste korsbåndstransektion (ACLT) under generel anæstesi. De normale kaniner gennemgik ikke en procedure.

i slutningen af den sjette uge blev de 30 kaniner med ACLT opdelt i seks grupper, kontrolgruppe, dhjst-gruppe og OSA-gruppe, som blev fulgt i yderligere 4 uger. De andre tre grupper af kaniner med ACLT var ubehandlet med DHJST eller OSA, som blev ofret efter 6 uger og tjente som 6-ugers tidspunktkontrol. Decoctions blev oralt administreret ved dosering 0.923 g (kg−1·d−1) i 4 uger blev kaniner i Osa−gruppen administreret OSA 0,09 g (kg−1·d-1) i en periode på 4 uger, modelkontrolgruppe og normal gruppe blev oralt administreret med samme volumen fysiologisk saltvand.

kaniner blev ofret til prøveudtagning. Protokollen modtog godkendelse fra Udvalget for dyreforsøg fra University Medical Center, Shanghai, Kina. Kanin tibiae blev fjernet, og tibia ledbrusk blev straks opbevaret ved -80 kr. Tibiae blev omhyggeligt dissekeret og ryddet fra tilstødende muskler og straks fikseret i 10% formalin i 24 timer. Tibiae blev efterfølgende afkalket i 4 uger i 100 g/L ethylendiamintetraeddikesyre, vasket i PBS, dehydreret gennem en række ethanol og indlejret i paraffin på en standardiseret måde for at sikre korrekt orientering. Parafinvævssektioner (7 liter) blev skåret på en standardiseret måde. Sektioner blev deparaffiniseret til histokemiske analyser.

2, 3. Histologisk vurdering af brusk

histologisk vurdering blev udført på de femorotibiale led af kaniner i dhjst-gruppen, Osa-gruppen og kontrolgrupper. Sektionerne blev farvet med Safranin o-fast green. Disse histologiske sektioner fra hvert sted blev evalueret ved hjælp af et modificeret Mankin-klassificeringssystem (tabel 1) af to uafhængige, bestyrelsescertificerede veterinærpatologer.

2.4. TUNEL Assay

H2O2-induceret apoptose blev påvist ved at udføre den terminale deoksynukleotidedyltransferase-medieret dUTP nick end-labeling (TUNEL) assay ved hjælp af et Apo-DirectTM Kit (CalBiochem, San Diego, CA). TUNEL blev udført i henhold til producentens anvisninger. Kort efter forbehandling og eksponering for H2O2 blev celler høstet, vasket, fikseret, permeabiliseret og mærket til DNA-strengbrud og derefter analyseret på et Coulter Epics Elite strømningscytometer (Beckman-Coulter, Miami, USA). Alle analyser blev udført i tre eksemplarer.

2, 5. Fluorescerende kvantitativ PCR

Total RNA blev ekstraheret fra 50 mg brusk i tibiae artikulær under anvendelse af Trisol reagens. Syntese af cDNA blev udført under anvendelse af 4 liter Total RNA pr. prøve med tilfældige primere og reagenser indeholdt i cDNA-syntesesættet med Revert Aid First streng. To mikro liter (2 liter) af hver prøve blev brugt til realtids PCR i et Rotor-Gen 2000-system (Australien). Relativ kvantificering blev beregnet ved hjælp af delta cycle threshold () relativ kvantificering. Tærskelcyklussen () for den endogene kontrol CAPDH mRNA og målsignalerne blev bestemt, og den relative RNA-kvantificering blev beregnet ved hjælp af komparativ metode, hvor

sekvenser af primere anvendt til vaskulær endotelvækstfaktor(VEGF) er: 5′-TGCCCACCGAGGAGTTTCA-3(fremad) og 5′-GGCCCCTGGTGAGTTTGAT-3 (omvendt) (produktlængde: 75 bp).Sekvenser af primere, der anvendes til hypoksi-inducerbar faktor-1-liter(HIF-1-liter) er: 5′-cagtgcaaaaagacaggtggaag-3(fremad) og 5′-CCCTGTATGGTGGTGATGTTGT-3 (omvendt) (produktlængde: 107 bp).Sekvenser af primere anvendt til GAPDH er: 5 ‘- CCGAGGGCCCACTAAAGG-3(fremad) og 5’-GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3 (omvendt) (produktlængde: 88 bp).

2, 6. Statistisk analyse

alle resultater blev udtrykt som middel-og standardafvigelse (SD). Måledata blev analyseret ved hjælp af en envejsanalyse af afvigelser (ANOVA, SPSS 11.0). Rangdata blev analyseret med ridit. Resultatet af P <.05 blev anset for at være statistisk signifikant.

3. Resultater

3.1. ACLT-induceret histologisk Degeneration hos kaniner blev reduceret med Dhjst

repræsentative histologiske sektioner er vist i Figur 1. I slutningen af 10.uge observerede vi en normal integritet af ledfladen i normal gruppe (Figur 1(a)). I kontrolgruppen med øget degeneration var der et tab af Safranin o-hurtig grøn farvning, der ledsagede spaltedannelse, der strakte sig ind i de midterste og dybe områder (Figur 1(B)), og i dhjst-gruppen var der tabt med tidlig mild fibrillering, og et tab af Safranin o-hurtig grøn farvning blev observeret sammen med chondrocytklyngning (Figur 1(c)). Osa-gruppen, med tab af Safranin o-hurtig grøn farvning, svarede disse ændringer til dhjst-gruppen(Figur 1 (d)). I slutningen af den sjette uge efter operationen var der en signifikant histologisk forskel i kontrolgruppen sammenlignet med den normale gruppe (P < .01). I kontrolgruppen var den gennemsnitlige score for Safranin o-fast grøn farvning yderligere stigninger ved 10 .uge sammenlignet med den i den 6. uge (P <.01) (figur 2 (a)). 10. uge var der signifikante forskelle i Mankin-score mellem kontrolgruppe og DHJST-gruppe, der var en signifikant lavere gennemsnitlig score for Safranin o-hurtig grøn farvning i dhjst-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (P < .01) (figur 2 (B)) og ingen statistisk signifikante forskelle i Mankin-score mellem dhjst-gruppen og OSA-gruppen (P >.05).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 2

The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. Resultaterne blev præsenteret som middelkr. SD (n = 5 pr. gruppe) i hver kolonne. * P <.01 versus slidgigt-kontrolgruppen i den 6 .uge, **P <.01 sammenlignet med dem i kontrolgruppen for slidgigt.

3.2. Dhjst hæmmede bruskceller apoptose

i slutningen af den sjette uge efter operationen var indekset for apoptosecelle i kontrolgruppen sammenlignet med det i den normale gruppe signifikant forskelle (P < .01). I kontrolgruppen blev indekset for apoptosecelle stadig stærkt forøget (fra middelkrans SD 0,35 KRS 0,13 i den sjette uge til 0,62 KRS 0,10 i den 10 .uge; P <.01) (figur 2 (c)). I slutningen af 10 .uge, sammenlignet med dhjst-gruppen, øges indekset for apoptosecelle bemærkelsesværdigt i kontrolgruppen (P <.01) (figur 2 (d)). Der var ingen signifikante forskelle i apoptosecelleindeks mellem OSA-gruppen og dhjst-gruppen (P >.05).

3, 3. Inhibering af VEGF-og HIF-1-kurp-ekspression i bruskceller er forbundet med Dhjst udøver terapeutisk virkning

fluorescerende kvantitativ PCR indikerede, at ekspressionen af VEGF-mRNA og HIF-1-kurp-mRNA er lav i normal gruppe; mens aktiviteterne øges gradvist og signifikant i kontrolgruppen sammenlignet med den for normal gruppe (P < .01); i kontrolgruppen begynder HIF-1-Kurt i artikulære chondrocytter at stige i den sjette uge efter operationen, yderligere stigninger ved 10.uge i sammenligning med den i den sjette uge (gennemsnitlig Kurt SD 94,21 Kurt 20.12 på den sjette uge, og 160.35 kr 72.27 på den 10. uge; P <.05) (tabel 2). Ved 10. uge blev ekspressionen af VEGF mRNA og HIF-1 mRNA i dhjst-gruppen signifikant reduceret sammenlignet med den i kontrolgruppe efter administration (P < .01). Selvom VEGF-mRNA-og HIF-1-mRNA-niveauet i OSA-gruppen havde en tendens til at blive reduceret med 4 ugers OSA-behandling sammenlignet med niveauet i kontrolgruppen, var der ingen signifikant forskel (tabel 3).

4. Diskussion

ACLT-modellen er en af de mest anvendte eksperimentelle modeller af OA. Kanin ACLT bruges i stigende grad i OA-undersøgelser, fordi sygdomsdebut er hurtig. Anvendelsen af eksperimentelle ACLT-modeller er af særlig klinisk relevans, da brud på ACL forekommer hos mennesker og også fører til udvikling af OA. Undersøgelse indikerer, at der findes en stor mængde chondrocytter apoptose under progressivt stadium af OA hos kaniner induceret af kirurgi. Chondrocyte apoptose er en af de karakteristiske ændringer af OA brusk. Patologisk apoptose under betingelse af skadelig stimulering kan resultere i frigivelse af kemotakse eller inflammatoriske faktorer, hvilket igen forværrer bruskskade og aktiverer smerte . Derfor chondrocyte apoptose inhibering kan være en vigtig strategi mod degenerative ændringer i kaniner knæled. Chondrocytter apoptose-indeks i dhjst-gruppen falder signifikant sammenlignet med i modelgruppen, hvilket antyder, at inhibering af chondrocyte apoptose kan være en af de vigtige mekanismer for DHJST mod degenerative ændringer.

tidligere undersøgelser har vist den hypoksiske karakter af ledhondrocytternes mikromiljø. Interessant nok viste osteoarthritiske led yderligere nedsatte iltniveauer, hypoksiens rolle under patogenesen af OA . En nylig undersøgelse beskrev, at katabolisk og hypoksisk stress i artikulære chondrocytter er stærke inducere af transkriptionsfaktoren HIF-1, som er den vigtigste regulator for cellulær tilpasning til lave iltniveauer. HIF – 1 er af afgørende betydning for overlevelse og vækststop af chondrocytter under bruskudvikling såvel som energiproduktion og matricesyntese af chondrocytter i sund såvel som osteoarthritisk brusk. I osteoarthritisk brusk øges proteinniveauerne af HIF-1 markant, og dets aktivitet korrelerer med sværhedsgraden af degenerative bruskændringer . Det foreliggende arbejde dokumenterer betydningen af transkriptionsfaktoren HIF-1-kur for at opretholde integriteten af hypoksisk ledbrusk. Overskudsniveauerne af HIF-1 Krot faldt sammen med øget apoptose af artikulære chondrocytter og førte til degenerative ændringer i kaniner knæled. Efter administration af DHJST falder HIF-1-kurp-ekspression i sammenligning med modelgruppen. Resultaterne viser, at dhjst ‘ s virkning på regulering af chondrocytternes funktion kan gennem hæmning af aktiviteten af HIF-1-kr.

det er interessant, at det forskellige udtryk for VEGF og HIF-1-kur mellem dhjst-gruppen og OSA-gruppen er signifikant efter administration. Flere undersøgelser har vist, at visse ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler, såsom indomethacin, forårsager antiinflammatoriske virkninger uafhængigt af HIF-1-Ruri-aktivitet, fordi indomethacin ikke inhiberede phosphatidylinositol 3-kinase eller ekstracellulær signalreguleret kinase/mitogenaktiveret proteinkinasevej såvel som erk-aktivitet . I modsætning hertil er indomethacin i stand til at aktivere peroksisom-proliferatoraktiveret receptor-kur, som ikke er følsom over for natriumsalicylat eller aspirin. Inhibering af phosphatidylinositol 3-kinase-eller Erk-vej er relateret til inhibering af HIF-1-rr og angiogene faktorer .hypoksi og forskellige vækstfaktorer/cytokiner forbedrer VEGF-ekspression . VEGF er ikke kun en af de vigtigste angiogenesefaktorer, men er også involveret i inflammatoriske processer i OA og bidrager til symptomer som smerte og hævelse ved at målrette mod synovialmembranerne , kroniske inflammatoriske reaktioner er ofte forbundet med produktionen af angiogene faktorer, der inducerer vaskulær proliferation, og ved reumatoid arthritis udtrykkes VEGF stærkt i synoviale celler . Da mekanisk overbelastning er en af årsagsfaktorerne for OA, studerede vi dens virkning på VEGF-ekspression på kaninens brusk, at ekspressionen af VEGF falder efter administration af DHJST, resultatet indikerer, at DHJST kan beskytte ledbrusk ved at undertrykke VEGF-ekspression i chondrocytter (figur 3).

figur 3

hypotetiske beskyttelsesmekanismer for DHJST på brusknedbrydning.

5. Konklusioner

indtil nu er de bioaktive ingredienser i DHJST ukendt, men vores undersøgelse indikerer, at DHJST udøver en signifikant terapeutisk virkning på OA hos kaniner gennem mekanismer til hæmning af chondrocytter apoptose og regulering af ekspressionen af VEGF, HIF-1-kur i chondrocytter. Dette giver videnskabelig dokumentation for, at klinikken kan anvende DHJST til behandling af OA.

finansiering

Shanghai ‘ s Naturvidenskabelige fond (bevillingsnummer: 08JC1418800).